專利名稱：一種組織工程化肝單元的構(gòu)建方法及一種組織工程化肝單元的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及將干細(xì)胞在體外分別向肝實質(zhì)細(xì)胞、血管 內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞與生物材料相結(jié)合，共同構(gòu)建組織工 程化肝單元的方法，利用此方法不僅可以獲取肝組織工程的大量種子細(xì)胞，制備肝 功能不全時的輔助功能結(jié)構(gòu)單位，而且可以此為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步構(gòu)建具有特定結(jié)構(gòu) 和功能的可移植的生物人工肝組織。
背景技術(shù)：
肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，它擔(dān)負(fù)著重要而復(fù)雜的生理功能，如各種物質(zhì)代 謝的中樞、分泌膽汁、合成蛋白和凝血因子以及解毒等，對維持生命和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn) 定起重要的作用，是人體最復(fù)雜的器官之一，目前，終未期肝病如急性肝衰竭，肝 硬化、肝癌等危及生命， 一直是醫(yī)學(xué)界難以解決的問題，死亡率非常高。全世界約有3億多肝病患者，其中三分之一在我國，我國是肝病大國，是世界上終末期肝病 發(fā)病率最高的地區(qū)之一，每年因肝病而死亡者人數(shù)眾多。原位肝移植是肝功能衰竭 及先天性肝代謝疾病唯一成熟的治療方法。美國UNOS報道，在過去十年里，全世 界實施26040例肝移植；據(jù)中華器官移植學(xué)會及全國肝移植協(xié)作組的統(tǒng)計，1976年 到2004年我國內(nèi)地完成各種類型肝移植5000余例。供肝缺乏是世界各國面臨的主 要問題。盡管近來發(fā)展了背馱式、劈離式、活體劈離式等各種肝移植術(shù)式，最大程 度利用供肝，但仍不能解決等待肝移植患者與供肝者之間的巨大差額，且因其具有 操作復(fù)雜、患者常需終生免疫抑制、花費(fèi)巨大等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受到極大的限制。隨著20世紀(jì)卯年代組織工程學(xué)概念的提出和不斷發(fā)展，肝組織工程因其獨(dú)有的 優(yōu)勢日益成為治療終末期肝病研究熱點(diǎn)并取得顯著進(jìn)展。肝組織工程即將適當(dāng)?shù)姆N 子細(xì)胞與生物支架材料相結(jié)合，在一定的微環(huán)境下，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成一定量的 肝實質(zhì)細(xì)胞和組織，再移植到患者體內(nèi)發(fā)揮代償或替代肝功能的作用。其主要面臨 的問題有缺乏與患者免疫相容的可再生的功能性種子細(xì)胞；缺乏在機(jī)械、生物、 化學(xué)方面均理想的生物支架；不能產(chǎn)生大型的、易與受體血液循環(huán)整合相通的血管化組織等。其中種子細(xì)胞的選擇、體外擴(kuò)增培養(yǎng)是肝組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵因素。成熟肝細(xì)胞具有諸多不足而不能成為滿意的細(xì)胞來源，如自肝功能衰竭獲取肝細(xì)
胞難度較大、異基因肝細(xì)胞可能產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、體外培養(yǎng)易失去活性與功能等。目前，肝組織工程種子細(xì)胞來源的研究主要集中于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell， ESC)與成體干細(xì)胞(adult stem cell, ASC)上，二者雖各有優(yōu)點(diǎn)，但ESC的應(yīng)用仍有 倫理、道德、法律方面的爭議；目前ESC向肝細(xì)胞系誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)體系尚不成熟， 其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究有待進(jìn)一步深入。研究發(fā)現(xiàn)，人體組織內(nèi)具有一類能夠不斷自我更新和增殖，具有多向分化潛能的 細(xì)胞群體一干細(xì)胞。它能夠在體外培養(yǎng)、增殖并且分化成不同的組織細(xì)胞。其中來 源于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為髓質(zhì)和非髓質(zhì)細(xì)胞型，包括脂肪細(xì)胞、軟骨 細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、以及內(nèi)皮細(xì)胞。體外 培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)體積小，成梭形，核漿比例大，其作為組織工程 種子細(xì)胞有如下優(yōu)點(diǎn)l.相對容易獲得；2.通過干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)可能使子細(xì)胞恢復(fù)正常功 能并擴(kuò)增；3.干細(xì)胞移植臨床上容易實施；4.與其它干細(xì)胞(胚胎或新生兒干細(xì)胞) 相比，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更符合倫理觀念。已有學(xué)者利用骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 治療兒童的成骨不全，并取得了較好的治療效果。骨髓間質(zhì)細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞 在體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境或體內(nèi)固有的微環(huán)境下能夠被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮 等組織。研究證實，肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞種植在適當(dāng)?shù)纳镏Ъ懿牧仙峡梢赃M(jìn)行生長 和增殖(Stephen S. Kim， 1998， SatosW Kaihara, 2000)。內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞在支架 材料上共同生長，即形成具備含有血管系統(tǒng)的活的組織工程肝臟(Lan Sample,2002)。 除骨髓以外，人們在胎盤、臍帶、脂肪等組織中陸續(xù)分離出與骨髓中的MSC具有類 似生物學(xué)特性的干細(xì)胞，而且，與骨髓來源的MSC相比，它們的大量獲取更為簡單， 來源更加豐富，且采集方法相對簡單，因此越來越受到關(guān)注。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞結(jié)合適當(dāng)支架材料 和結(jié)構(gòu)形式共同構(gòu)建工程組織肝單元的方法。本發(fā)明組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，包括以下步驟1) 分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外將其分別向肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；2) 將向血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)的內(nèi)充細(xì)胞和含有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠一同種植 在一管狀支架內(nèi)壁，該支架外具有一外包圍體，將已向肝細(xì)胞分化的功能細(xì)胞和含 有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠種植在所述支架與外包圍體之間，形成細(xì)胞材料復(fù)合體； 所述支架與外包圍體壁面均有貫穿的微孔；3)將細(xì)胞材料復(fù)合體置于含5 10%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5 10天， 即制備成含有BMSC來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元，保存?zhèn)溆?。其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為來自離體骨髓的骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞、來自離體脂肪 組織的間充質(zhì)干細(xì)胞、或來自離體胎盤或臍帶組織的間充質(zhì)干細(xì)胞。其中，所述步驟1)中在所述間充質(zhì)干細(xì)胞中先分別加入含有誘導(dǎo)因子的生物蛋 白膠再進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)。上述構(gòu)建方法中，所述步驟1)將間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件為以 P2-Ps代成體干細(xì)胞用條件培養(yǎng)液重懸，按l-5X105/citr'接種于預(yù)先鋪好Matdgel的 96孔板內(nèi)，每孔加200jJl條件培養(yǎng)液,每3天換液一次；所述條件培養(yǎng)液為5-10% 胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlHGF、 lng/ml FGF-4、 ITS,和、尼克酰胺0.61 g/L、地塞米松O.l pmoL/L、牛血清白蛋白2g/L、鳥氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、 谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖lg/L、半乳糖2g/L及適量氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳。所述步驟1)將間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件為將P廠P9成體干 細(xì)胞以條件培養(yǎng)液重懸，按2-8X107cm2接種于預(yù)先鋪好Matrigel的96孔板內(nèi)， 每孔加20(HJl條件培養(yǎng)液，每3天換液一次進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，選取圓形或類圓細(xì)胞， 將細(xì)胞消化處理，以普通培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液；所述條件培養(yǎng)液為L-DMEM， 2%FBS， 2%馬血清，10ng/mlVEGF (R&Dsystem)、 2ng/ml bFGF (R&Dsystem)、 lxITS(Sigma)、尼克酰胺0.61 g/L、地塞米松0.1 pmoL/L、 BSA 2 g/L、鳥氨酸0.1 g/L、 脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖lg/L、半乳糖2 g/L及微量氯化鋅、硫 酸鋅和氯化錳。如上所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法中，所述支架和外包圍體所用的可降解 生物材料為膠原、殼聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚L一乳酸、聚羥基烷酯、聚羥 基丁酸酯和聚乳酸羥基乙酸中的一種，優(yōu)選聚乳酸羥基乙酸。所述支架和外包圍體上微孔為自然形成或人工開設(shè)，所述微孔直徑為 100-20(Hmi。所述支架為平面二分叉形式，主干和兩分叉在同一平面上，且兩分叉相 對于主干呈一角度分布；或者所述支架為立體多維分級形式，主干下連接兩分叉， 每一分叉又分成若干下一級支分叉，支分叉與主干不在同一平面上。本發(fā)明的另一目的，在于提供上述方法獲得的一種工程組織肝單元。采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明對多種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，令其向肝細(xì) 胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，用于獲取肝組織工程的大量種子細(xì)胞，并將其與適當(dāng)?shù)纳?物活性材料結(jié)合，制備肝功能輔助功能結(jié)構(gòu)單位。該組織工程化肝單元可用于移植 到肝功能衰竭患者體內(nèi)，(部分)代償/替代肝功能，從而為肝衰竭患者提供除肝移植 以外的新的治療途徑。


圖1為光學(xué)顯微鏡觀察BMSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞EC誘導(dǎo)后ld、 3d、 5d、 7d、 14d、 21d的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化圖;其中，a)MSCx跳b) ld x40; c) 3d x40; d)7dx跳 e) 14 x跳f) 21d xl00。圖2為向EC誘導(dǎo)后BMSC在纖維蛋白凝膠中的組織學(xué)切片形態(tài)；圖中，A:誘 導(dǎo)后3d(x250); B:誘導(dǎo)后7d(xl25); C:誘導(dǎo)后21d(xl25)。圖3為BMSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞EC誘導(dǎo)后免疫熒光檢測結(jié)果；其中，a):誘導(dǎo)后 的3d flt-l-FITC (x250); b):誘導(dǎo)后7d flt-l-FITC(x250); c):誘導(dǎo)后21d CD31-PE(xl25); d):誘導(dǎo)后21d CD34-FITC(xl25); e):誘導(dǎo)后21d flk-l-TRITC(xl25); f):誘導(dǎo)后21d vWF-FITC(x125)。圖4為BMSC向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化后光鏡下形態(tài)；其中，A: P2-P9BMSC; B:誘導(dǎo)后3d; C:誘導(dǎo)后5d; D:誘導(dǎo)后7d; (XIOO)。圖5為向干細(xì)胞誘導(dǎo)后BMSC免疫組織化學(xué)熒光染色結(jié)果；其中，A:誘導(dǎo)后3d (AFP-TRITO250); B:誘導(dǎo)后7d (AFP-TRITO250); C:誘導(dǎo)后3d (Alb-FITCx250); D:誘導(dǎo)后7d(Alb-FIT0250)。圖6為EC在材料表面貼附生長的形態(tài)；其中，a)PLGAX 2000; b)PLGAX 2000; c)PUX2000; d)PUX2000。圖7為支架管壁的微孔結(jié)構(gòu)形態(tài)，圖中箭頭所指為微孔。圖8顯示組織工程化肝單元結(jié)構(gòu)。圖8-A示出了其中一種平面對稱二分叉支架 形式，圖8-B顯示另一種立體多維支架形式。圖9為本發(fā)明構(gòu)建的肝單元移植大鼠4周后取出標(biāo)本圖片。圖10為本發(fā)明構(gòu)建的肝單元移植大鼠4周后取出標(biāo)本冰凍切片熒光顯微鏡觀察 結(jié)果其中，在紫外激發(fā)光下發(fā)藍(lán)色光的細(xì)胞(如箭頭所指)即為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞， 可見標(biāo)記細(xì)胞組成毛細(xì)血管的管腔樣的結(jié)構(gòu)。圖11為本發(fā)明構(gòu)建的肝單元移植大鼠4周后取出標(biāo)本組織切片免疫熒光檢測結(jié)果(AFP-HTC) xl00。圖12為本發(fā)明構(gòu)建的肝單元移植大鼠4周后取出標(biāo)本組織切片檢測結(jié)果；其中， M:支架材料；H:肝細(xì)胞。A為100X， B為200X， C和D為400X。
具體實施方式
本發(fā)明的研究思路是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)作為種子細(xì)胞，其來源于離體的骨 髓、胎盤、臍帶、脂肪等組織；血管支架內(nèi)部種植向血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)預(yù)誘導(dǎo)的 MSC，包裹支架周圍的是向肝細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)的MSC;血管支架壁上有孔道供血管內(nèi)皮細(xì) 胞向外游離趨化，生長進(jìn)入周圍的肝樣組織中，形成毛細(xì)血管網(wǎng)。支架材料以生物 降解型高分子材料為主，細(xì)胞與支架結(jié)合后，在生物反應(yīng)器中模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行培 養(yǎng)。以下結(jié)合具體實施例的試驗步驟，詳述本發(fā)明的構(gòu)建方法。實驗過程中所用材料和試劑包括但不限于以下所注明的1) Percoll分離液(Sigma)的配制將Percoll原液按9:1與O.lmol/L PBS混 合，稀釋到密度為1.073g/mL。2) DMEM (Dulbecco、s modified Eagle's medium)培養(yǎng)基(Gibco):將10g低糖 DMEM粉末溶于1L三蒸水，每升加入4g HEPES、 3.7g Na2HC03及0.3g谷胺酰 銨，將pH調(diào)節(jié)到7.0 — 7.4，加入青霉素、鏈霉素至終濃度為100U/mL。 0.22pm的 微孔濾膜超濾除菌，每90mL加入10mL胎牛血清(fetal bovine serum, FCS)， 4"C保存。3) 胎牛血清(fetal calf serum, FCS， Hyclone)4) 胰蛋白酶(Sigma)5) ITS (insulin 1.0 g/1, sodium selenite 0.67mg/l, transferring 0.55 g/1, sodium pyruvate 11.0 g/l， Hyclone)6) CD34-FITC、 CD133-PE (Miltenyi Biotec )、 CD31-PE (PharMingen)、 CDlla —FITC、 CD44陽FITC、 CD71-FITC 、 CD29-PE 、 CD45-FITC 、 CD90-FITC (Serotec);7) Matrigel 、重組人bFGF、重組人VEGF165 (R&D)8) 多聚甲醛、3%戊二醛等國產(chǎn)試劑9) 地塞米松、尼克酰胺(Sigma )、鳥氨酸、脯氨酸(Hyclone)10) 纖維蛋白凝膠(廣州倍繡生物技術(shù)有限公司)11) 小鼠抗Flk-1單克隆抗體、山羊抗vWF多克隆抗體(Santa Gruz);兔抗Flt-1 多克隆抗體(BOSTER);熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG及兔抗山羊IgG (北 京中杉金橋)實施例一l.骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的分離培養(yǎng)及鑒定
1) 骨髓來源可以為骨髓庫中的骨髓、外科手術(shù)中從棄離骨中擠出的骨髓，或 通過骨髓穿刺獲得。骨髓穿刺是臨床上廣泛應(yīng)用的成熟而安全的獲取骨髓組織的方 法，因此骨髓穿刺抽吸可以作為本發(fā)明的一個特別來源。2) 向獲取的骨髓液中加適量DMEM培養(yǎng)液，混勻后以200目篩網(wǎng)過濾，取篩 下組分；3) 平衡密度離心，棄上清；用DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成骨髓細(xì)胞懸液；4) 將細(xì)胞懸液滴加在比重1.073的Percoll分離液液面上進(jìn)行密度梯度離心，取 界面層單個核細(xì)胞，用PBS離心洗滌。5) 將分離得到的骨髓單個核細(xì)胞以2.0Xl()5/cm2的密度接種于完全培養(yǎng)液 (DMEM +10%胎牛血清)中，置于37。C， 5%(302飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)72h，更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每2-3天換液一次，得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC); 或者，這些細(xì)胞可通過使用流式細(xì)胞儀分選或根據(jù)細(xì)胞的大小和基粒的有無進(jìn)行分 離，干細(xì)胞較小并相對無基粒。6) 待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長到80%融合時，用0.25%的胰酶消化傳代，以8.0X107cnr' 的密度接種于傳代培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；或最終的分離和重懸浮之后，用標(biāo)準(zhǔn)的 細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以增加干細(xì)胞的數(shù)量。常用的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基如添加5% 15%(例如10%)血清(包括胎牛血清，馬血清等)的DMEM或者D/F12培養(yǎng)基。培養(yǎng) 傳代的細(xì)胞形態(tài)顯示貼壁生長的原代(Pe) BMSC數(shù)量稀少，散落存在，呈細(xì)而小 長梭形，隨著BMSC的迅速增殖，7d后出現(xiàn)較大的克隆，14天左右細(xì)胞生長達(dá) 80%-90%融合.傳代后，自P2至P9其形態(tài)呈較均一的長梭形或多邊形，成群生長時排 列整齊如刷狀，生K:旺盛時呈旋渦樣；P9之后，BMSC形態(tài)變的較為寬大，間有分 叉。因此，在本發(fā)明中采用P2-P9BMSC。7) 對獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定，用流式細(xì)胞儀檢測取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，用1:1的0.1%的胰蛋白 酶和0.01% EDTA混合液消化；用含2%BSA的PBS洗滌后制成900ul含有1.5 X 106 個MSC的單細(xì)胞懸液，等分為7份，分別加入7個Eppendof管中，a管為標(biāo)準(zhǔn)對照， 加入5pL IgGl-PE及IgGl-FITC; b管加入5pL CD133-FITC和5pL CDllb-PE單克 隆抗體；c管加入5pL CD34-PE和5pL CD71-FITC單克隆抗體；d管加入5pL CD29-PE 和5pL CD45-FITC單克隆抗體；e管加入5pL CD31-PE和5fiL CD90-FITC單克隆抗 體；f管加入5pL CDlla-HTC單克隆抗體；g管加入5)aL CD44-FITC單克隆抗體
室溫孵育20 30min，然后用PBS洗2遍，力Q入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì) 胞儀對培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測和鑒定。鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增后的BMSC 成體干細(xì)胞表型為CD45-、 CD31一、 CDlla一 、 CD34一、 CD133—、 CD71low、 CD29+、 CD44+、 CD卯+。2. 脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)的分離培養(yǎng)及鑒定1) 脂肪組織可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得，如從手術(shù)棄離物中獲得、或通過脂肪 抽吸術(shù)而獲得。脂肪抽吸術(shù)是目前醫(yī)學(xué)上應(yīng)用最為普遍的安全的方法，因此脂肪抽 吸物是本發(fā)明細(xì)胞的一個豐富來源。2) 獲取的脂肪組織以PBS反復(fù)沖洗，以除去損傷組織、血液和紅細(xì)胞等。3) 在脂肪組織中加入2倍體積0.2% I型膠原酶膠原酶和1倍體積牛血清白蛋 白(BSA)，移入50ml離心管，37'C消化45min，并不時搖動。4) 200目篩網(wǎng)過濾消化物，濾液使用平衡密度離心方法1200轉(zhuǎn)/min離心5 min 收集富含脂肪組織來源的干細(xì)胞群體的部分(沉淀)細(xì)胞，隨后用PBS懸浮沉淀部 分，再以1200轉(zhuǎn)/min離心5 min來洗滌細(xì)胞2遍.5) 最終細(xì)胞用含有10%FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)液重懸，以2.0><105/cm2的 密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，置于37°C、 5%C02的孵箱中進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng).6) 脂肪組織來源的干細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定取第5代培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪組織來源的干細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，離心。以PBS 洗漆細(xì)胞2 3次后，用lml PBS重懸細(xì)胞，計數(shù)。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1X106 個/ml,按5X 105個細(xì)胞/管將細(xì)胞平均分至多個EP管中，分別將PE或FITC標(biāo)記 的多個抗體進(jìn)行組合，加入各管中，室溫下孵育20 30min，然后用PBS洗2遍， 加入0.5ml PBS重懸細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測和鑒 定。鑒定結(jié)果顯示，擴(kuò)增后的ADSCs成體干細(xì)胞表型為CD45—、 CD34—、 CD133—、 CD106—、 CD71bw、 CD49dl0WCD29+、 CD44+、 CD90+。3. 胎盤組織來源的MSC1) 胎盤組織可來自于足月順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)中棄離的胎盤組織。2) 剝除母體側(cè)蛻膜，剪取小塊胎兒蛻膜側(cè)胎盤組織，PBS沖洗，去除血跡，剪 成碎片。3) 加入0.1% 1V型膠原酶,37。C消化30min，過100目篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液,加入
配好的培養(yǎng)基(含DMEM， FBS, bFGF)，調(diào)整培養(yǎng)細(xì)胞密度為1 X 105/ml ,置于37°C. 5。/。C02,飽和濕度的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 4d進(jìn)行換液。4) 細(xì)胞按常規(guī)方法傳代、凍存、復(fù)蘇。5) 胎兒脫膜側(cè)胎盤組織消化后獲得細(xì)胞中僅有少量的貼壁細(xì)胞，經(jīng)2周后逐漸 形成扁平單層細(xì)胞，呈漩渦狀生長或成簇生長;在細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時,胞體變得細(xì)長， 形態(tài)類似成纖維細(xì)胞。6) 用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的表面標(biāo)志進(jìn)行檢測和鑒定，胎盤間充質(zhì)干細(xì) 胞表達(dá)CD29、CD44 、 CD105,但不表達(dá)CDllb、 CD34 、 CD45 、 CD19 、 CD106 、 CD40 、 CD40L 、 CD28 、 CD80禾卩CD86等表面抗原分子。實施例二體外誘導(dǎo)BMSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)分化及鑒定1) 條件培養(yǎng)液的配制含2。/。胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/mlVEGF(R&D system)、 2ng/mlbFGF (R&Dsystem)、 lxITS (Sigma)、尼克酰胺0.61 g/L、地塞米松 0.1pmoL/L、牛血清白蛋白(BSA) 2 g/L、鳥氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰 胺0.73 g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2 g/L及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳) 等-2) P2-P';代BMSC以條件培養(yǎng)液重懸，按2X107cm2接種于預(yù)先鋪好Matrigd (1: 3比例稀釋)的96孔板內(nèi)，每孔加200ul條件培養(yǎng)液，每3天換液一次； 3)光學(xué)顯微鏡觀察:動態(tài)觀察BMSC誘導(dǎo)后ld、 3d、 5d、 7d、 14d、 21d的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變 化。結(jié)果參見圖l，其中，a) MSC 100x; b) ld40x; c) 3d40x; d) 7d 100x; e) 14 100x; f) 21d 100x。圖片顯示誘導(dǎo)后ld ，細(xì)胞由原來的長梭形變短、變粗，成 多角形；誘導(dǎo)后3d ,細(xì)胞伸出偽足相互連接，成管網(wǎng)狀排列；誘導(dǎo)后7d ，細(xì)胞排 列成條索狀，并形成血管腔樣結(jié)構(gòu)；14-21d ，血管腔樣結(jié)構(gòu)密度增加，管腔直徑變 的寬大，條索狀結(jié)構(gòu)長度增加，管腔樣結(jié)構(gòu)周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細(xì)胞。 纖維蛋白凝膠立體培養(yǎng)及組織學(xué)切片1) 將誘導(dǎo)后7d、 14d、 21d的BMSC分別消化以10%胎牛血清的低糖DMEM 重懸；2) 懸液與纖維蛋白原混合后接種于96孔板，最后加入凝血酶2U/孔，混合液總 體積為100ul/孔，纖維蛋白原終濃度為2mg/ml;3) 加入凝血酶后纖維蛋白原變成纖維蛋白，呈半透明半固體凝膠，細(xì)胞均勻分
布在立體凝膠中；4) 光學(xué)顯微鏡下觀察纖維蛋白凝膠中有無血管樣結(jié)構(gòu)形成；5) 將各組纖維蛋白凝膠取出，10%甲醛固定，組織學(xué)切片(垂直于每孔平面縱 行切面)，HE染色觀察。結(jié)果參見圖2，圖中，A:誘導(dǎo)后3d(250x); B:誘導(dǎo)后7d(125x); C:誘導(dǎo)后 21d (125x)。顯示誘導(dǎo)后7d 、 14d 、 21d的細(xì)胞在纖維蛋白凝膠中同樣形成條索狀 與血管腔樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后第3d、 5d、 7d、 14d、 21d分別行纖維白凝膠切片(如圖2)， 誘導(dǎo)后第3d開始見內(nèi)皮樣細(xì)胞散在分布，由單個細(xì)胞的細(xì)胞漿圍成一毛細(xì)血管腔樣 結(jié)構(gòu)(圖2細(xì)箭頭所示)；7d后部分區(qū)域內(nèi)皮樣細(xì)胞相對密集分布，由2個以上細(xì)胞 構(gòu)成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)(圖2粗箭頭所示)或細(xì)胞排列成條索狀、巢狀(圖2雙箭頭 所示)，周圍圍繞一周基底膜樣結(jié)構(gòu)，這為其應(yīng)用中建立與體內(nèi)循環(huán)的聯(lián)系奠定了基 礎(chǔ)。免疫熒光檢測1) 未誘導(dǎo)的BMSC與誘導(dǎo)后ld、 3d、 5d、 7d、 14d、 21d的BMSC培養(yǎng)板，用 PBS洗滌3次，每次5min;2) 4%的多聚甲醛室溫原位固定15min， PBS洗滌3次，每次5min;3) 0.1% Triton和3%過氧化氫孵育10min;4) 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;5) 20。/。馬血清37。C孵育15min;6) 傾去血清，分別加CD34-FITC、CD133-PE直標(biāo)熒光抗體工作液與FIk-l、vWF、 Flt-l抗體工作液各50uL，置于濕盒中于37"C孵育30 min放4。C過夜；陰性對照用 0.01mmoL/L的PBS代替一抗；7) 4X:過夜后，CD34、 CD133直標(biāo)熒光抗體組經(jīng)PBS沖洗3次，直接在熒光顯 微鏡下觀察；其余各組滴加熒光標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-TRITC 及兔抗山羊IgG-FITC)工作液37。C孵育30min， PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡下觀 察；結(jié)果參見圖3顯示未誘導(dǎo)的BMSC免疫組化熒光染色CD34、CD31、Flt-l、Flk-l、 vWF均為陰性；誘導(dǎo)后3d，即有部分細(xì)胞開始出現(xiàn)Flt-l陽性表達(dá)，而CD34、CD31、 Flk-l、 vWF則在誘導(dǎo)后7d才開始出現(xiàn)陽性表達(dá)；此后熒光染色陽性率逐漸增加。 部分上述表面標(biāo)志熒光染色陽性的細(xì)胞參與構(gòu)成血管腔樣結(jié)構(gòu)或成鋪路石樣排列。本實施例以BMSC為例說明種子細(xì)胞如何向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)，其它來源(如 脂肪組織、胎盤組織)的間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)過程與此相同，不再一 —贅述。 實施例三骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定實驗中所用試劑及抗體有小鼠抗人AFP單克隆抗體，兔抗人Alb抗體(Santa Cruz);熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG (北京中杉金橋公司)；靛青綠 (Indocyanine green, ICG)(遼陽第三制藥廠)；其余同前。1、體外誘導(dǎo)BMSC向肝細(xì)胞分化將P廠P9BMSC以條件培養(yǎng)液重懸，按5X 107cm2接種于預(yù)先鋪好Matrigd (1: 3比例稀釋)的96孔板內(nèi)，每3天換液一次 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。動態(tài)觀察BMSC誘導(dǎo)后3d、 5d、 7d的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，參見圖4， 誘導(dǎo)后3d ，長梭形細(xì)胞逐漸變短、變粗，成多角形或肝細(xì)胞樣圓形細(xì)胞。誘導(dǎo)后 5-7d ，肝細(xì)胞樣圓形細(xì)胞密度比例逐漸增多。其中形態(tài)變?yōu)閳A形或類圓的，判定有 成熟肝細(xì)胞分化的趨勢，將細(xì)胞消化處理，以普通培養(yǎng)基(DMEM/F12)重懸制成細(xì)胞 懸液，備用條件培養(yǎng)液的配制含2%胎牛血清的低糖DMEM中加入10ng/ml HGF、 lng/ml FGF-4、 lxITS、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1 pmoL/L、牛血清白蛋白(BSA) 2 g/L、鳥氨酸0.1 g/L、脯氨酸0.03 g/L、谷氨酰胺0.73 g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2 gZL 及適量微量元素(氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳)等。2、 免疫熒光檢測1) 未誘導(dǎo)的BMSC與誘導(dǎo)后3d、 5d、 7d的BMSC培養(yǎng)板，用PBS洗滌3次， 每次5min;2) 4%的多聚甲醛室溫原位固定15min， PBS洗滌3次，每次5min;3) 0.1% Triton和3%過氧化氫孵育10min;4) 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;5) 20%馬血清"。C孵育Umin;6) 傾去血清，分別加AFP、 Alb抗體工作液各50jiL，置于濕盒中于37r孵育 30 min放4T:過夜；陰性對照用0.01mmoL/L的PBS代替一抗；7) 4t:過夜后，滴加熒光標(biāo)記的二抗(山羊抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-TRITC) 工作液37。C孵育30min， PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果參見圖5，顯示未誘導(dǎo)的及誘導(dǎo)后3d的BMSC免疫組化熒光染色AFP、 Alb均為陰性；誘導(dǎo)后5-7d，細(xì)胞開始出現(xiàn)AFP、 Alb陽性表達(dá)，并逐漸增加陽性率。3、 ICG攝取、排泌實驗1) 將誘導(dǎo)3d、 5d、 7d的BMSC用PBS沖洗后，加入lmg/mLICG，于37。C孵育 15 min;2) 顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色的變化； 3) PBS沖洗2遍，換回完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并觀察顏色的變化；肝細(xì)胞具有特有的ICG攝取、排泌功能，實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后3d、 5d、 7d的 細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入ICG孵育15min后，形態(tài)無變化的及誘導(dǎo)后3d的BMSC未著 色，而誘導(dǎo)后5d、 7d的肝細(xì)胞樣圓形細(xì)胞被染成深綠色(參見圖5中深色點(diǎn))，換 回常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時后，著色細(xì)胞的綠色褪去，提示細(xì)胞具有類似肝細(xì)胞的ICG 攝取和排泌功能；上述結(jié)果表明，BMSC已逐漸分化為AFP、 Alb陽性并具備活性 功能的成熟肝細(xì)胞。綜合以上實驗表明，骨髓來源的具備多分化潛能的成體干細(xì)胞在體外適當(dāng)條件 下可分別向血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞分化，BMSC可作為肝組織工程中穩(wěn)定的肝特異 性功能的種子細(xì)胞。Matrigel、纖維蛋白凝膠、VEGF、 bFGF、 HGF、 FGF及誘導(dǎo)后 表達(dá)的flt-l、 flk-l等表面分子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞分化的 過程中可以提供適宜的微環(huán)境并起重要作用。本實施例以BMSC為例說明種子細(xì)胞如何向肝細(xì)胞誘導(dǎo)，其它來源(如脂肪組 織、胎盤組織)的間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)過程與此相同，不再一一贅述。實施例四支架材料及結(jié)構(gòu)的設(shè)計支架的目的是為細(xì)胞提供環(huán)境以使種子細(xì)胞粘附聚集生長以形成特定結(jié)構(gòu)和形 狀的組織。支架材料本身應(yīng)具有可生物降解性和生物相容性(包括血液相容和組織 相容)，支架結(jié)構(gòu)上要盡可能增加吸附種子細(xì)胞的表面積，并能引導(dǎo)細(xì)胞的生長方向。本發(fā)明的支架可選用具有孔洞結(jié)構(gòu)的組織工程材料，可選用的材料如膠原、殼聚糖、聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚L一乳酸、聚羥基烷酯(PHA)、聚 羥基丁酸酯(PHB)、聚乳酸羥基乙酸(PLGA)、和聚氨酯(PU)，實驗驗證其中聚 乳酸羥基乙酸和聚氨酯與血液相容性更好；更進(jìn)一步實驗表明，兩種優(yōu)選材料對骨 髓成體干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都具有良好的相容性(參見圖6)。這些材料可以使用NaCl顆粒制孔/浸出法制備成多孔薄膜材料，進(jìn)而制備成本發(fā) 明中的支架；在本發(fā)明中，支架材料的微觀結(jié)構(gòu)參見圖7該材料壁面微孔均勻，孔 隙相互貫通，參見圖7 (b)中箭頭所指，最好還具有較大的貫穿整個壁面的較大的 微孔通道，如圖7 (a)中箭頭所指。當(dāng)材料本身微孔不具有貫穿性時，需要人工在 支架上開設(shè)微孔通道，該微孔通道直徑在100 200pm。在本發(fā)明中，支架2制備成管狀，管壁設(shè)有微孔通道21，管內(nèi)填充已向內(nèi)皮細(xì) 胞預(yù)分化誘導(dǎo)的細(xì)胞3及生物膠4，管外填充已向肝細(xì)胞預(yù)分化誘導(dǎo)的細(xì)胞5及營養(yǎng)
基質(zhì)6，最外層再覆以同樣材料制備的外包圍體l，外包圍體上同樣應(yīng)有大量微孔通 道11。由此形成的組織工程化肝單元結(jié)構(gòu)參見圖8所示。支架本身結(jié)構(gòu)形式可以有各種變化。8-A示出了一種平面對稱二分叉形式支架2， 該種形式兩分叉22和主干23在同一平面上且相對于主干23呈一角度并對稱分布。 另一種支架的變化形式可參見圖8-B，該支架為立體多維分級的形式，主干23下連 接兩分叉22，每一分叉22又繼續(xù)分成若干下一級支分叉24 (圖中示出兩個分支叉 24),支分叉24與主干23不在同一平面上，這樣形成的支架2具有多維立體構(gòu)象， 更易于形成毛細(xì)血管網(wǎng)。所有形式的支架其端口均可仲出外包圍體，從而形成既有 內(nèi)部微環(huán)境又可與外界環(huán)境交互的組織工程化肝單元。實施例五含有成體干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元構(gòu)建1、 BMSC與支架結(jié)合體內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)1) 將無菌的DAPI儲存液加入培養(yǎng)的MSC上清中，至終濃度為50mg/L;37 'C 孵育染色30min; Hanks平衡鹽溶液沖洗6遍，除去未結(jié)合的DAPI。2) BMSC-DAPI以條件培養(yǎng)液(組成參見實施例二)重懸，置于冰上至少1 h備用；3) 懸液與纖維蛋白原混合后，以2.0X10Vcm2的密度接種于96孔板，最后加入 凝血酶2U/孔，混合液總體積為100ul/孔，纖維蛋白原終濃度為2mg/ml;4) 加入凝血酶后纖維蛋白原變成纖維蛋白，呈半透明半固體凝膠，細(xì)胞均勻分 布在立體凝膠中；5) 將纖維蛋白凝膠自細(xì)胞培養(yǎng)板中挑出，放入支架管內(nèi)壁；6) 將支架及種植之細(xì)胞種植于肝損傷的NOD-SCID裸鼠腹腔中(或腹膜外或 包裹于大網(wǎng)膜中)，誘導(dǎo)培養(yǎng)四周成為肝羊-元。2、 BMSC與支架結(jié)合體外誘導(dǎo)培養(yǎng)1) BMSC以條件培養(yǎng)液分別重懸，EC (血管內(nèi)皮細(xì)胞)條件培養(yǎng)液與實施例二 相同，其中需加入10ng/mlVEGF、 2ng/mlbFGF;肝細(xì)胞條件培養(yǎng)液與實施例三相同， 其中需加入10ng/mlHGF、 lng/mlFGF-4;2) 將以上分別得到的BMSC懸液與纖維蛋白元(廣州倍繡生物技術(shù)有限公司) 混合后，分別以2.0X10V'cm'的密度接種于96孔板，最后加入凝血酶2U/孔，混合 液總體積為100ul/ L纖維蛋白原終濃度為2mg/ml;3) 然后分別加入凝血酶后纖維蛋白原變成纖維蛋白，呈半透明半固體凝膠，細(xì) 胞均勻分布在立體凝膠中，分別置于37。C， 5。/。C02飽和濕度的孵箱內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)分 化培養(yǎng)3-5天4) 將含有向血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)分化細(xì)胞(內(nèi)充細(xì)胞)的纖維蛋白凝膠自細(xì)胞 培養(yǎng)板中挑出，注入支架管內(nèi)壁；將含有向肝細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)分化細(xì)胞(功能細(xì)胞)的 纖維蛋白凝膠自細(xì)胞培養(yǎng)板中挑出，注入支架管與外包圍體之間形成細(xì)胞材料復(fù)合 體5) 最后將細(xì)胞材料復(fù)合體置入含5 10%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5 10 天，即制備成含有BMSC來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元，保存?zhèn)溆胦3、 BMSC與支架結(jié)合體外誘導(dǎo)培養(yǎng)另一種體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，1)依據(jù)實施例二和實施例三先將BMSC分別向EC細(xì)胞 (內(nèi)充細(xì)胞)和肝細(xì)胞(功能細(xì)胞)預(yù)誘導(dǎo)；2)然后分別加入含有誘導(dǎo)因子的生物 蛋白膠中，其中需加入10ng/mlVEGF、 2ng/mlbFGF;肝細(xì)胞生物蛋白膠中需加入 10ng/mlHGF、 lng/mlFGF-4; 3)將含有EC細(xì)胞的生物蛋白膠注入支架管內(nèi)壁，將 含有肝細(xì)胞的生物蛋白膠注入支架管與外包圍體之間形成細(xì)胞材料復(fù)合體；4)將細(xì) 胞材料復(fù)合體置入含5 10%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5 10天，即制備成含 有BMSC來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元，保存?zhèn)溆没蛞浦踩敫?損傷動物的腹腔中。本實施例以BMSC為例說明骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在預(yù)誘導(dǎo)分化后如何與支 架結(jié)合形成組織工程化肝單元，其它來源(如脂肪組織、胎盤組織)的間充質(zhì)干細(xì) 胞預(yù)誘導(dǎo)后與支架結(jié)合的形式與此相同，不再一一贅述。實施例六組織工程化肝單元的應(yīng)用將實施例五之2構(gòu)建的肝單元植于肝損傷的NOD-SCID裸鼠腹腔中(或腹膜外 或包裹于大網(wǎng)膜中)；4周后，取出植入肝單元作為標(biāo)本，行組織學(xué)切片，HE染 色觀察。 免疫熒光檢測1) 標(biāo)本冰凍切片以PBS洗滌3次，每次5min;2) 4%的多聚甲醛室溫原位固定15min， PBS洗滌3次，每次5min;3) 0.1% Triton和3%過氧化氫孵育10min;4) 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;5) 20%馬血清37。C孵育15min;6) 傾去血清，分別加AFP抗體工作液各50pL，置于濕盒中于37。C孵育30 min
放4'C過夜；陰性對照用0.01mmoL/L的PBS代替一抗； 7)4。C過夜后，滴加熒光標(biāo)記的二抗(抗小鼠IgG-TRITC)工作液37i:孵育30min， PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果1、 移植后的形態(tài)學(xué)觀察移植后4周，見移植物表面為纖維組織包裹，呈鮮紅色，部分切面呈顆粒狀，質(zhì)硬，前與腹膜粘連，后與受損肝臟緊密相連，與腹膜肝臟間有血供相連，間有微小血管，分離后有出血及滲血(參見圖9)。2、 DAPI與免疫熒光檢測DAPI是一種標(biāo)記細(xì)胞核的熒光染料，因其與dsDNA 有高度的親和力，與DNA結(jié)合后會發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。參見圖10，熒光顯微鏡下， 在紫外激發(fā)光下發(fā)藍(lán)色光的細(xì)胞(圖中箭頭所指)即為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞?？梢姌?biāo)記 細(xì)胞組成毛細(xì)血管的管腔樣的結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色顯示AFP-FITC標(biāo)記陽性細(xì)胞形成肝索樣結(jié)構(gòu)，參見圖11。3、石蠟切片HE染色參見圖12可見大量肝細(xì)胞樣細(xì)胞(如圖中H標(biāo)注)，彼此相互連接，成條索樣，條索之間可見內(nèi)皮樣細(xì)胞間斷排列，內(nèi)可見紅細(xì)胞，形成肝臟所特有的肝索與肝血竇樣結(jié)構(gòu)，通過以上具體描述可以獲知，本發(fā)明確立了將成體干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞)在體外 /體內(nèi)分別向肝細(xì)胞和向內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞與生物材料相 結(jié)合，共同構(gòu)建組織工程化肝單元的方法，該方法可用于制備肝功能不全時的輔助 功能結(jié)構(gòu)單位。
權(quán)利要求
1、一種組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟1)分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外將其分別向肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；2)將向血管內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)的內(nèi)充細(xì)胞和含有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠一同種植在一管狀支架內(nèi)壁，該支架外具有一外包圍體，將已向肝細(xì)胞分化的功能細(xì)胞和含有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠種植在所述支架與外包圍體之間，形成細(xì)胞材料復(fù)合體；所述支架與外包圍體壁面均有貫穿的微孔；3)將細(xì)胞材料復(fù)合體置于含5～10％血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)5～10天，即制備成含有BMSC來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元，保存?zhèn)溆谩?br> 2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述間充 質(zhì)干細(xì)胞為來自離體骨髓的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、來自離體脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞、 或來自離體胎盤或臍帶組織的間充質(zhì)干細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述 步驟l)中在所述間充質(zhì)干細(xì)胞中先分別加入含有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠再進(jìn)行預(yù)誘 導(dǎo)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟 1)將間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件為以P2-Pe代成體干細(xì)胞用條件培養(yǎng)液 重懸，按l-5X 10Vcm2接種于預(yù)先鋪好Matrigel的96孔板內(nèi)，每孔加200|Jl條件培 養(yǎng)液，每3天換液一次；所述條件培養(yǎng)液為5-10%胎牛血清的低糖DMEM中加入 10ng/mlHGF、 lng/mlFGF-4、 ITS，禾d、尼克酰胺0.61g/L、地塞米松0.1 (imoL/L、 牛血清白蛋白2g/L、鳥氨酸0.1g/L、脯氨酸0.03g/L、谷氨酰胺0.73g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2g/L及適量氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟 1)將間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)條件為將P廠P9成體干細(xì)胞以條件培 養(yǎng)液重懸，按2-8X107cm2接種于預(yù)先鋪好Matrigel的96孔板內(nèi)，每孔加200iJl條 件培養(yǎng)液，每3天換液一次進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，選取圓形或類圓細(xì)胞，將細(xì)胞消化處理， 以普通培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液；所述條件培養(yǎng)液為L-DMEM， 2%FBS， 2%馬 血清，10ng/mlVEGF (R&D system)、 2ng/ml bFGF (R&D system)、 lxITS (Sigma)、 尼克酰胺0.61 g/L、地塞米松0.1 pmoL/L、BSA2 g/L、鳥氨酸0.1 g/L、脯氨酸0.03 g/L、 谷氨酰胺0.73 g/L、葡萄糖1 g/L、半乳糖2 g/L及微量氯化鋅、硫酸鋅和氯化錳。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述支架和外包圍體所用的可降解生物材料為膠原、殼聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、 聚L一乳酸、聚羥基垸酯、聚羥基丁酸酯和聚乳酸羥基乙酸中的一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述支架和外包圍體所用材料為聚乳酸羥基乙酸。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述支架 和外包圍體上微孔為自然形成或人工開設(shè)，所述微孔直徑為100-200pm。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述組織工程化肝單元的構(gòu)建方法，其特征在于，所述支架 為平面二分叉形式，主干和兩分叉在同一平面上，且兩分叉相對于主干呈一角度分 布；或者所述支架為立體多維分級形式，主干下連接兩分叉，每一分叉又分成若干 下一級支分叉，支分叉與主干不在同一平面上。
10、 用以上任一所述權(quán)利要求的構(gòu)建方法得到的組織工程化肝單元。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程化肝單元的構(gòu)建方法及一種組織工程化肝單元。是將間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分別向肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，然后分別結(jié)合含有誘導(dǎo)因子的生物蛋白膠填充到一管狀支架的內(nèi)壁和外側(cè)，并以一外包圍體包裹形成細(xì)胞材料復(fù)合體；所述細(xì)胞材料復(fù)合體置于培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)即制備成含有血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的組織工程化肝單元。本發(fā)明使用間充質(zhì)干細(xì)胞獲取肝組織工程的大量種子細(xì)胞，并將其與適當(dāng)?shù)纳锘钚圆牧辖Y(jié)合后，制備肝功能輔助功能結(jié)構(gòu)單位。該組織工程化肝單元可用于移植到肝功能衰竭患者體內(nèi)，部分代償/替代肝功能，從而為肝功能衰竭患者提供除肝移植外的新的治療途徑。
文檔編號C12N5/08GK101148656SQ20061011318
公開日2008年3月26日 申請日期2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日
發(fā)明者雪 南, 岳慧敏, 磊 張, 峰 林, 王韞芳, 管利東, 峰 粱, 裴雪濤, 顏永年 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所