專利名稱：一種新生兒組織工程膀胱片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學組織工程技術領域，尤其涉及一種新生兒組織工程膀胱片及其制 備方法。
背景技術：
先天性膀胱畸形包括膀胱外翻、發(fā)育不全，重復膀胱，臍尿管未閉，巨膀胱綜合征 及膀胱憩室，如膀胱外翻是由于胚胎期泄殖腔膜的發(fā)育異常，導致先天性的下腹壁和膀胱 前壁缺損，膀胱后壁外翻，粘膜暴露的膀胱畸形，該病罕見，約1 4萬新生兒中有一例，男 性多于女性，約2 8 1，由于膀胱外翻，膀胱粘膜和輸尿管口外露，很易導致尿失禁及上 行性的腎孟腎炎，未經治療者半數死于兒童期。因此，先天性膀胱畸形患兒需要在出生后盡 早對膀胱進行修補或重建。目前，臨床上膀胱修補或重建最常用的膀胱替代材料仍為胃腸道，但因其與泌尿 系組織結構及生物特性不同而導致許多問題，如感染、代謝紊亂、尿結石形成、穿孔、黏液增 多及惡性腫瘤形成等一系列并發(fā)癥。于是，人們開展了用合成的生物材料替代膀胱壁的研 究，目前修復重建膀胱的組織工程技術有兩類①未種植種子細胞技術，直接應用構建的細 胞支架塑型和重建功能性膀胱，但多項研究表明，應用未種植種子細胞技術重建膀胱，移行 上皮可以再生，肌層雖然可以出現，但常存在發(fā)育不良，并會隨時間的延長出現瘢痕形成和 移植物萎縮；②種植種子細胞技術，將體外擴增的種子細胞接種于細胞支架之上，而后移植 體外構建的組織工程化組織入宿主體內繼續(xù)生長，直至形成替代的膀胱組織。傳統(tǒng)上膀胱 組織工程中常用的種子細胞為膀胱移行上皮細胞和膀胱平滑肌細胞。在膀胱組織工程的研 究早期，難以克服移行上皮細胞的老化問題，從Cilento等成功實現了移行上皮細胞在體 外大規(guī)模擴增以來，原代培養(yǎng)基本形成了消化法、組織塊法、刮取法和尿脫落細胞法等。但 自體膀胱移行上皮和平滑肌細胞作為種子細胞的缺點①當機體器官處于終末衰竭時，用 于擴增足夠細胞的組織標本可能無法獲得，而且作為已分化成熟的細胞，在體外培養(yǎng)時，不 僅增殖速度較慢，還存在去分化等問題；②由于染色體端粒的連續(xù)性縮短，正常的體細胞只 能進行有限的分裂傳代，如果達到傳代的極限，細胞將衰老并死亡；③神經源性膀胱的平滑 肌細胞在細胞增殖、收縮性及細胞黏附等方面都與正常細胞不同；④不適應于膀胱腫瘤患 者。近幾年，隨著干細胞的不斷深入研究，其獨特的優(yōu)越性展現在人們的面前。干細胞是一 類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的特殊細胞。根據干細胞的來源、發(fā)育階段、分 化趨勢可將它們分為兩大類胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞由于存在倫理、來源、 免疫排斥以及在條件不適時易成瘤性等問題限制了其的應用，而成體干細胞也存在細胞數 量、免疫排斥等缺陷，且對于新生兒而言取材也很困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題為提供一種新生兒組織工程膀胱片及其制備方法。為此，本發(fā)明提供了一種新生兒組織工程膀胱片，其特征在于其包含分化而來的平滑肌樣細胞和可降解支架材料；包繞可降解支架材料，呈片狀；所述平滑肌樣細胞表達 α -SMA、CALP 禾口 MHC0在優(yōu)選實施例中，所述干細胞為人羊水來源干細胞(human amniotic fluid colony-derived stem cells，hAFCSCs)、人羊膜間充質干細胞或臍帶血間充質干細胞，其 中最優(yōu)選為自體hAFCSCs。hAFCSCs作為種子細胞構建組織工程膀胱迄今國內外尚無報道， 且與胚胎干細胞，骨髓和脂肪等來源的間充質干細胞相比，還具有來源穩(wěn)定易獲取、無成瘤 性、免疫原性弱、增殖和分化能力強等優(yōu)勢。在優(yōu)選實施例中，所述可降解支架材料為天然生物材料或人工合成可降解材料， 其中天然生物材料為自然衍生材料或無細胞基質，自然衍生材料為纖維蛋白、膠原、透明質 酸及其復合代物等大分子材料，無細胞基質有膀胱黏膜下脫細胞基質(bladder acellular matrix graft, BAMG)、尿道細胞夕卜基質(urethral extracellular matrix, UECM)或小腸 黏膜下脫細胞基質(small intestinals ubmucosa, SIS)；所述人工合成可降解材料為聚乳 酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸與聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-己內酯的共聚物 (PLCL)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)或聚羥基丁酸(PHB)，其中優(yōu)選聚羥基乙酸(PGA)。另一方面，本發(fā)明還公開了一種新生兒組織工程膀胱片的制備方法，包括下列步 驟將可降解支架材料置于培養(yǎng)容器中，干細胞懸液均勻地種到降解支架材料，37°C， 95%濕度，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-4小時；加入基礎誘導培養(yǎng)液并添加誘導因子培養(yǎng)，每天換基礎誘導培養(yǎng)液和誘導因子一 次，體外培養(yǎng)4周，所述基礎誘導培養(yǎng)液為低糖DMEM+10% FBS+1 %青鏈霉素+1 % L-谷氨酰 胺，所述誘導因子為 30 μ M L-Ascorbic acid+2. 5ng/ml TGF-β l+5ng/ml PDGF-BB。在優(yōu)選實施例中，所述干細胞懸液含有纖維蛋白、膠原、透明質酸或基質膠 (matrigel)；更優(yōu)選為基質膠(matrigel)，以使干細胞能貼附可降解支架材料上。在一優(yōu)選實施例中，所述干細胞懸液細胞密度為4X IO7個/ml。在優(yōu)選實施例中，所述干細胞為hAFCSCs、人羊膜間充質干細胞或臍帶血間充質干 細胞，其中最優(yōu)選為自體hAFCSCs。在優(yōu)選實施例中，所述可降解支架材料為天然生物材料和人工合成可降解材料， 其中天然生物材料為自然衍生材料或無細胞基質，自然衍生材料為纖維蛋白、膠原、透明質 酸及其復合代物等大分子材料，無細胞基質為有膀胱黏膜下脫細胞基質、尿道細胞外基質 或小腸黏膜下脫細胞基質；所述人工合成可降解材料為聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸與聚乙 醇酸共聚物、聚乳酸-己內酯的共聚物、聚羥基鏈烷酸酯或聚羥基丁酸，其中優(yōu)選聚羥基乙 酸。本發(fā)明所述培養(yǎng)容器是常規(guī)的細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板。本發(fā)明方法具有以下突出優(yōu)點和特點一，所選種子細胞為特殊來源的細 胞-hAFCSCs、人羊膜間充質干細胞或臍帶血間充質干細胞，這些種子細胞有穩(wěn)定的細胞來 源，可建立或已有細胞庫，并且臨床應用時不存在免疫排斥或免疫排斥低。如果胎兒經產 前診斷確認存在膀胱的先天性畸形需要進行修復或重建，那么可以充分利用產前診斷至胎 兒出生這段時間，構建胎兒組織工程膀胱片，待胎兒出生后即可嘗試進行膀胱修補或重建。 二，hAFCSCs與可降解支架材料采用邊誘導、邊構建組織工程膀胱片的方法，將分離培養(yǎng)的早期hAFCSCs直接種植到支架材料上，使hAFCSCs在合適的誘導環(huán)境里邊誘導邊擴增與支 架材料形成復合物。結果證實，此種方式下，細胞增殖迅速，細胞貼附能力好，包繞可降解支 架材料，細胞呈成片狀，組織增厚明顯且具有一定韌性。而傳統(tǒng)的構建方式是先將干細胞在 培養(yǎng)皿中將其誘導分化為所需要的成體細胞，再將分化后的成體細胞種植到支架材料上， 但誘導分化后的成體細胞的增殖能力、貼附能力均下降，不利于細胞在支架材料上的貼附 和增殖，造成早期細胞流失率高；繼之，一段時間后待支架材料逐漸降解失去足夠的結構強 度，本身增殖、貼附能力均較低的誘導后細胞更加難以形成一定韌性和厚度的組織塊，實驗 易失敗。因此采取邊誘導、邊構建的方式更利于組織工程組織的培養(yǎng)成功。體內實驗生物 力學檢測也證實細胞-支架復合物在力學指標上具有和正常膀胱平滑肌組織類似的力學 拉伸特征，這一力學優(yōu)勢有助于恢復重建膀胱充盈時膀胱順應性的一致性。


圖IhAFCSCs向平滑肌細胞誘導分化的“峰”、“谷”樣形態(tài)改變和誘導細胞相關蛋 白(α -SMA, CALP，MHC)的表達。圖2hAFCSCs種植到PGA支架上掃描電鏡下觀察其生長情況及形成的組織塊大體 肉眼觀。圖3組織免疫熒光化學染色顯示體內構建組織的相關蛋白表達情況。圖4A-C各組間生物力學指標測試的比較*表示力學陰性對照組與力學實驗組，力學陽性對照組相關力學指標比較，差異具 有顯著性。#表示力學實驗組與力學陽性對照組相關力學指標比較，差異具有顯著性。
具體實施例方式為進一步詳細描述在本發(fā)明的實踐中所使用的常規(guī)技術，實踐者可參看有關 細胞生物學、組織結構學以及胚胎學的標準的教科書及評論。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell :A practical approach[E. J. Robertson 編，IRL 出版有限 公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P. M. Wasserman 等編，學術 出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro [Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 :900,1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells :Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P. D. Rathjen等，Reprod.Fertil. Dev. 10 :31,1998]。細胞生物學、蛋白質化學、和抗體技術可以在“蛋白科學中的當前方案” [J. E. Colligan等編輯，Wiley&Sons]、“細胞生物學中的當前方案” [J. S. Bonifacino等， ffiley&Sons]和“兔疫學功時當亦方案” [J. E. Colligan等編輯，ffiley&Sons]中找到。與 本發(fā)明相關的試劑、克隆載體、和基因操作試劑盒可從商業(yè)供應商那得到，例如BioRad、 Stratageneλ Invitrogen、ClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。細胞培養(yǎng)方法通常在“動物細胞培養(yǎng)基本技術手冊”最新版本(R. I. Freshney編 輯，Wiley&Sons)；“細胞培養(yǎng)一般技術” (Μ. A. Harrison和I. F. Rae，劍橋大學出版)；和“胚 胎干細胞方法和操作規(guī)定”(K. Turksen編輯，Humana出版)中有描述。組織培養(yǎng)基和試劑 可從商業(yè)供應商那得至IJ，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalCo.、以及 ICN Biomedicals。組織工程材料的選擇通常在“生物醫(yī)學材料”(李玉寶編著，化學工業(yè)出版社， 2003)；“生物醫(yī)用材料導論”(李世普編著，武漢工業(yè)大學出版社，2008)；“生物醫(yī)學材料 學”(顧漢卿等編著，天津科技翻譯出版公司，199 中有描述。力學測試可選用instron corporation(美國)不同規(guī)格的儀器進行力學測試。組織工程方法通常在“組織工程學原理”(R. Lanza等編輯，楊志明等譯，化學工業(yè) 出版社，2006)； “組織工程學理論與實踐”(曹誼林等編輯，上海科學技術出版社，2004)； “人體組織工程學”(胡敏等編著，人民軍醫(yī)出版社，2006)中有描述。生物力學測試相關技術通常在“醫(yī)用生物力學”(楊桂通編著，科學出版社，1994)； “Biomechanics :Mechanical Properties of Living Tissues”，Yc Fung 編著，New York Springer-Verlag, 1993)；“生物力學活組織的力學特性”(馮元楨編著，湖南科學技術出 版社，1986)；“材料力學實驗”(劉宏文等編著，高等教育出版社，199 中有描述。本發(fā)明所述干細胞為人羊水來源干細胞(human amniotic fluid colony-derived stem cells, hAFCSCs)、人羊膜間充質干細胞或臍帶血間充質干細胞可來自商業(yè)化細胞或 自體細胞。本發(fā)明優(yōu)選為人羊水來源干細胞(又稱人羊水干細胞)。Kaviani等發(fā)現從孕 71-90天孕羊的羊水細胞中獲得的間充質干細胞的體外擴增速度明顯快于羊胎兒細胞和成 年羊骨髓來源的間充質干細胞。2003年h’t Anker等從人孕中期羊水細胞中培養(yǎng)得到間 充質干細胞，發(fā)現其擴增潛能甚至超過了骨髓間充質干細胞。2007年Kim等在對孕14-16 周人羊水細胞進行體外培養(yǎng)研究中獲得類似于骨髓間充質干細胞的干細胞，稱其為hAFFTs 細胞，通過端粒酶活性和分化潛能測定，發(fā)現其具備端粒酶活性和良好的體外擴增潛能。 Coppi等分離獲得的AFS (amniotic fluid stem cells)細胞在體外可迅速生長，在36小時 內即實現細胞數倍增，而且未顯示出有致瘤特性。這些細胞在經過250次倍增之后，仍然保 持正常核型。對本發(fā)明使用的培養(yǎng)基的類型沒有限制，只要可用于干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。 在這類培養(yǎng)基中(X)2的濃度優(yōu)選是5%，但本發(fā)明不限于此。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。以 下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā) 明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商 所建議的條件。實施例中所述羊水由上海市楊浦區(qū)婦幼保健院提供。實施例中所使用的基礎誘導培養(yǎng)液成分為低糖DMEM+10% FBS+1%青鏈霉 素+1 % L-谷氨酰胺；添加的為誘導因子30 μ M的L-Ascorbic acid+2. 5ng/ml的 TGF-β l+5ng/ml 的 PDGF-BB。實施例1一 hAFCSCs的分離、分選及誘導培養(yǎng)羊水標本來自孕中期月)行產前診斷的孕婦，超聲引導下行羊膜腔穿刺取得 20-40ml羊水至50ml無菌離心管，密封后4°C冷藏保存并迅速轉移到層流無菌細胞培養(yǎng)室內的超凈臺中。利用無菌100目篩網過濾后4°C環(huán)境下IOOOrpm離心5min。離心后棄上清， 管內加入5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)。8-10天后用克隆杯挑取生長良好形態(tài)均勻的克隆獲得hAFCSCs。 體外繼續(xù)培養(yǎng)擴增后選取第4代hAFCSCs，待其生長至70-80%融合時，更換為基礎誘導培 養(yǎng)液并每Mh向培養(yǎng)皿中添加誘導因子，置于37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)基礎誘導 培養(yǎng)液每3天換液一次，體外誘導培養(yǎng)4周。二 PGA材料支架的準備取直徑為15 μ 1的非編織PGA材料80mg，將其壓制成22mmX22mmX 1. 5mm的支架。 75%乙醇浸泡支架2小時，1 % PBS輕洗三遍，之后基礎誘導培養(yǎng)液浸泡兩遍，每次10分鐘， 移去培養(yǎng)液，在紫外燈照射下超凈臺內干燥30分鐘備用。三hAFCSCs與PGA材料支架邊誘導邊構建組織工程膀胱片的過程1)收集足夠量的hAFCSCs，調整細胞密度為4X IO7個/ml，取500 μ 1細胞懸液與 250 μ 1 matrigeld 1稀釋)混勻，均勻地種到PGA支架上，放入37°C，95%濕度，5% (X)2 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2) 4小時后待hAFCSCs貼附到PGA支架材料上后首次添加基礎誘導培養(yǎng)液，并每天 添加誘導因子，體外培養(yǎng)4周。四hAFCSCs與PGA材料支架復合物的體內種植在無菌操作環(huán)境下，將6-8周裸鼠背部做縱行切口，將上述三、幻培養(yǎng)的細胞-PGA 支架復合物種植到裸鼠背部皮袋內，縫合，繼續(xù)飼養(yǎng)，4天后拆線。4周后取材。在培養(yǎng)期間，需按常規(guī)細胞生長所需的各種條件，例如溫度(37°C )，二氧化碳濃 度(5% )，相對穩(wěn)定的pH值及適宜的濕度等。在倒置顯微鏡下觀察可見hAFCSCs在基礎誘導培養(yǎng)液和添加誘導因子的誘導 培養(yǎng)方案下，經誘導1周后細胞多角形逐漸消失，細胞形態(tài)變窄變長。4-5周后經誘導的 hAFCSCs呈典型的長梭狀平滑肌細胞樣，待細胞90%融合后形成特征性“峰”和“谷”樣排列 (圖1A)。例1 一中體外培養(yǎng)4周的hAFCSCs-PGA支架復合物增厚明顯，表面光滑且富于彈 性與韌性(圖2D)。實施例2對例1 一中得到的誘導細胞進行細胞熒光免疫染色，證實經上述誘導方案下誘導 的hAFCSCs表達平滑肌細胞的標志物平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA) (圖 2A)，肌鈣蛋白(calponin，CALP)(圖 2B)和肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC) (圖2C)，證明我們的誘導方法能夠成功地使hAFCSCs分化成平滑肌樣細胞。對例1四中取材得到的細胞-PGA組織塊進行冰凍切片后組織免疫熒光染色發(fā)現 平滑肌細胞的標志蛋白α "SMA, CALP, MHC均有表達(圖3箭頭所指)。對例1 二、三中得到的PGA材料支架和復合物進行掃描電鏡觀察可見非編織PGA 支架材料呈不規(guī)則網格狀結構(圖2A)，其網格大小有利于hAFCSCs向支架內部滲透、遷移； 1周時掃描電鏡下可見hAFCSCs與PGA材料貼附緊密，并開始分泌細胞外基質(圖2B) ；2周 時可見細胞包繞PGA材料大量增殖成片狀，分泌大量細胞外基質(圖2C)；并可見PGA材料 開始降解，出現斷痕(圖2C箭頭所示)。上述說明，hAFCSCs與PGA生物可降解支架具有良 好的生物相容性，能夠在支架材料上迅速增殖生長。實施例3體內種植的hAFCSCs與PGA材料支架復合物的力學效果評價
將例1四中取材得到的樣品修剪成約15mmX IOmmX 1. 5mm大小的類長方狀，標本 固定于萬能電子拉伸機(instron 5969)上，使用50N的拉力傳感器，以5mm/min速度加載 樣品，檢測最大拉伸應力(即最大載荷)，最大拉伸率，最大載荷處的變形量等指標，測量得 出的數據用統(tǒng)計學軟件SPSS. 11. 0進行分析處理，各組別的力學指標以均數士標準差表示 (表1)。各組樣品之間力學數據的比較用Mudent's t檢驗進行統(tǒng)計，P <0.05為差異具 有顯著性。結果顯示在最大載荷指標上力學陰性對照組與力學實驗組(P = 0. 0352)，力學 陽性對照組(P = 0. 0047)比較，差異具有顯著性(圖4A)；力學實驗組與力學陽性對照組 (P = 0. 0103)比較，差異具有顯著性(圖4A)。在最大載荷處的變形量指標上力學陰性對照 組與力學實驗組(P = 0. 0176)，力學陽性對照組(P = 0. 0084)比較，差異具有顯著性(圖 4B)；力學實驗組與力學陽性對照組(P = 0. 4064)比較，無顯著性差異(圖4B)。在最大拉 伸率指標上力學陰性對照組與力學實驗組(P = 0. 0099)，力學陽性對照組(P = 0. 0054)比 較，差異具有顯著性(圖4C)；力學實驗組與力學陽性對照組(P = 0. 4715)比較，無顯著性 差異(圖4C)。綜上說明，力學實驗組在各項指標上較單純PGA支架力學陰性對照組具有明 顯的力學優(yōu)勢；力學實驗組同力學陽性對照組相比雖然在最大載荷上仍有一定差距，但二 者在最大載荷處的變形量和最大拉伸率上并無顯著性差異，說明細胞-PGA支架復合物與 正常膀胱組織平滑肌層具有相似的拉伸性能和力學特性。表1各測試組間生物力學指標測試的比較
權利要求
1.一種新生兒組織工程膀胱片，其特征在于其包含分化而來的平滑肌樣細胞和可 降解支架材料；所述平滑肌樣細胞包繞可降解支架材料，呈片狀；所述平滑肌樣細胞表達 α -SMA、CALP 禾口 MHC0
2.如權利要求1所述的新生兒組織工程膀胱片，其特征在于所述干細胞為人羊水來源 干細胞、人羊膜間充質干細胞或臍帶血間充質干細胞。
3.如權利要求2所述的新生兒組織工程膀胱片，其特征在于所述人羊水來源干細胞為 自體人羊水來源干細胞。
4.如權利要求1所述的新生兒組織工程膀胱片，其特征在于所述可降解支架材料為天 然生物材料或人工合成可降解材料。
5.一種權利要求1所述新生兒組織工程膀胱片的制備方法，包括下列步驟a)將可降解支架材料置于培養(yǎng)容器中，干細胞懸液均勻地種到降解支架材料，37°C， 95%濕度，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-4小時；b)加入基礎誘導培養(yǎng)液并添加誘導因子培養(yǎng)，每天更換基礎誘導培養(yǎng)液和誘導因子一 次，體外培養(yǎng)4周，所述基礎誘導培養(yǎng)液為低糖DMEM+10% FBS+1 %青鏈霉素+1 % L-谷氨酰 胺，所述誘導因子為 30 μ ML-Ascorbic acid+2. 5ng/ml TGF-β l+5ng/ml PDGF-BB。。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述干細胞懸液含有纖維蛋白、膠原、透 明質酸或基質膠。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述可降解支架材料為天然生物材料或 人工合成可降解材料。
8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述干細胞為人羊水來源干細胞、人羊 膜間充質干細胞或臍帶血間充質干細胞。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述人羊水來源干細胞為自體人羊水來 源干細胞。
10.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)容器是細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學組織工程技術領域，尤其涉及一種新生兒組織工程膀胱片及其制備方法。本發(fā)明提供了一種新生兒組織工程膀胱片，其特征在于其包含分化而來的平滑肌樣細胞和可降解支架材料；所述平滑肌樣細胞包繞可降解支架材料，呈片狀；所述平滑肌樣細胞表達α-SMA、CALP和MHC。本發(fā)明所述新生兒組織工程膀胱片在力學指標上具有和正常膀胱平滑肌組織類似的力學拉伸特征，這有助于恢復重建膀胱充盈時膀胱順應性的一致性。
文檔編號C12N5/0775GK102120046SQ20101060988
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2010年12月23日
發(fā)明者周君梅, 陳方, 高同斌 申請人:上海市兒童醫(yī)院