一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括：細(xì)菌纖維素改性處理的步驟；制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟；以及將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟；本發(fā)明的有益效果為：通過結(jié)構(gòu)、成分雙重仿生設(shè)計，將活體細(xì)胞衍生材料、改性納米纖維及導(dǎo)電納米材料復(fù)合，獲得的支架具有高含水率，綜合力學(xué)性能和穩(wěn)定性優(yōu)良，且具有生物活性和電活性，同時具有有利于促進(jìn)血旺細(xì)胞生長增值，引導(dǎo)軸突再生的功能；制備方法簡單，制備的產(chǎn)品形狀和尺寸易調(diào)控，可滿足神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的各項要求、應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】
一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]周圍神經(jīng)缺損和脊髓損傷一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點，全球每年新增加的創(chuàng)傷病例中，周圍神經(jīng)損傷病例可達(dá)1.5%?4.0%，大量患者需要進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)。再生神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)的重建取決于多種因素，包括近端的軸突支芽是否生長旺盛；雪旺細(xì)胞的“鋪路”是否完備；再生神經(jīng)纖維與靶器官間的性質(zhì)是否相適應(yīng)，三者缺一不可。盡管周圍神經(jīng)修復(fù)的歷史已有150余年的歷史，但其修復(fù)結(jié)果卻十分有限。隨著神經(jīng)科學(xué)和組織工程學(xué)的研究進(jìn)展，人們認(rèn)識到解決這一難題的契機(jī)在于神經(jīng)組織工程技術(shù)。
[0003]目前，神經(jīng)修復(fù)支架材料有三種:1、天然支架材料;主要以自體或異體的神經(jīng)、靜脈、骨骼肌及羊膜等，但以上材料由于其來源有限，取材困難，又存在交叉?zhèn)鬟f病原微生物的危險，難以批量生產(chǎn)。2、天然生物材料;主要有膠原、明膠、殼聚糖、藻酸鹽、纖維素、透明質(zhì)酸、氨基葡聚糖、脂質(zhì)體、脫細(xì)胞外基質(zhì)等，這些材料的優(yōu)點主要體現(xiàn)在生物相容性好、抗原性低，部分材料具有天然的孔隙結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，利于細(xì)胞黏附、生長和增殖，但力學(xué)性能較差，缺乏足夠的物理強(qiáng)度。3、非生物活性原材料;制作的組織工程神經(jīng)支架?？色@得較好的物理性能，常用的材料主要有聚羥基乙酸、聚乳酸等。但非生物活性材料缺少各種生物信號，細(xì)胞黏附性差，降解產(chǎn)物也常在局部引起炎性反應(yīng)等。
[0004]膠原、透明質(zhì)酸、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等均為從活體細(xì)胞中提取出的衍生材料，他們能夠為細(xì)胞的生長提供了物理支持和適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞的粘附、生長、增殖和分化，因保留了生物組織天然的物理結(jié)構(gòu)。然而，這類衍生材料作為組織工程支架，存在力學(xué)性能較差、降解過快等缺點，限制了其使用。合成材料由于其機(jī)械性能和降解性能具有可控性，并且可重復(fù)生產(chǎn)，將活體細(xì)胞衍生材料與合成材料復(fù)合，則可以發(fā)揮兩種材料的優(yōu)勢，使支架的性能進(jìn)一步提升。然而大多合成材料缺乏生物活性，對組織的恢復(fù)重建沒有促進(jìn)作用，移植到體內(nèi)容易被組織纖維所包裹。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，針對神經(jīng)組織進(jìn)行成分仿生和結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計，采用活體細(xì)胞衍生材料、天然生物基材料和導(dǎo)電納米材料復(fù)合，使用冰晶定向凝固制孔法和冷凍真空干燥法，制備了一種具有特定三維取向多孔的仿生神經(jīng)導(dǎo)管及神經(jīng)組織工程支架，具有優(yōu)異的生物活性和電活性，支持引導(dǎo)軸突再生功能。
[0006]本發(fā)明一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
細(xì)菌纖維素改性處理的步驟;制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟；以及將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟。
[0007]進(jìn)一步的，所述細(xì)菌纖維素改性處理的步驟包括:
步驟1.1、細(xì)菌纖維素的預(yù)處理;將細(xì)菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將膜浸泡于0.01~0.511101/1的氫氧化鈉溶液，80-100°(:下煮沸5?601^11，去除膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約7.1-7.5；將得到的細(xì)菌纖維素膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分；
步驟1.2、細(xì)菌纖維素的改性處理;將步驟1.1中得到細(xì)菌纖維素雙醛基化或羧甲基化。
[0008]進(jìn)一步的，步驟1.2中所述細(xì)菌纖維素雙醛基化，具體為:
采用高碘酸鈉雙醛基化工藝，配置0.01-0.5mol/L的高碘酸鈉溶液;將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維浸泡在上述高碘酸鈉溶液中，避光保存1-5天，得到雙醛基細(xì)菌纖維素(DBC);用去離子水將所述雙醛基細(xì)菌纖維素絮狀纖維反復(fù)浸泡離心沖洗，之后封裝置于陰涼處保存。
[0009]進(jìn)一步的，步驟1.2中所述羧甲基化，具體為:
步驟1.2.1、細(xì)菌纖維素的堿化:將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維加入異丙醇中，配制與細(xì)菌纖維素葡萄糖單元等摩爾比的10?30%的氫氧化鈉，將氫氧化鈉緩慢滴加進(jìn)入異丙醇中，同時劇烈攪拌，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)0.5?3h;
步驟1.2.2、細(xì)菌纖維素的醚化:加入纖維素葡萄糖單元3倍摩爾比的氯乙酸鈉，繼續(xù)攪拌，40-700C下反應(yīng)2?12h，冷卻后，棄去溶液，用60?90%的甲醇清洗薄膜，用醋酸調(diào)節(jié)PH至中性，溶液過濾后，繼續(xù)用60?80%的乙醇洗三次，再用無水乙醇洗滌，獲得羧甲基細(xì)菌纖維素(CMBC)薄膜。
[0010]進(jìn)一步的，所述制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟，具體為配置2-10%的膠原溶液、或配置2-10%的透明質(zhì)酸溶液、或從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)。
[0011 ]進(jìn)一步的，所述從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)，具體提取方法包括:
步驟2.1、組織前處理:無菌條件下去除血管組織和外膜組織，使用無菌PBS溶液反復(fù)沖洗干凈；制漿:用I?5%的雙氧水浸泡消毒10?60分鐘，繼續(xù)用PBS反復(fù)清洗，隨后放入組織粉碎機(jī)中制成勻漿；
步驟2.2、細(xì)胞破碎:加入勻漿體積5?20倍的無菌三蒸水，低滲混勻，放入-10 °0-40 °C冰箱內(nèi)冰凍，然后于常溫下融化，反復(fù)凍融3~5次，使細(xì)胞膜破碎；
步驟2.3、差速離心:通過差速離心方法分離出細(xì)胞組織勻漿中的細(xì)胞碎片，先在1500?2500r/min下離心15?40min，收集上層楽料;將收集的楽料于2500?3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心15~40111；[11，繼續(xù)收集上層楽料在3500~45001'/111；[11下離心15~40111；[11然后取上清液，如此反復(fù)數(shù)次，使細(xì)胞碎片充分沉淀并分離；
步驟2.4、涂片觀察:收集漿料涂片，顯微鏡下觀察無細(xì)胞碎片殘留后，將獲得的上層漿料在800CK12000r/min下離心15~40min，收集最終沉淀物；
步驟2.5、產(chǎn)物收集:將最終沉淀物用PBS清洗后，配制成2-5%(w/v)的白色乳膏狀細(xì)胞外基質(zhì)漿料。
[0012]進(jìn)一步的，所述將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟，具體包括:
步驟3.1、微管導(dǎo)向模具的預(yù)處理:設(shè)計和制作模具，所述模具底板為不銹鋼，外殼及導(dǎo)向管為聚乙烯，將模具放入-60?-20 °C的冰箱中冷凍3-12小時；
步驟3.2、漿料混合:將活體細(xì)胞衍生材料與改性細(xì)菌纖維素及碳基納米材料按比例均勻混合，加入去離子水，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散10-30分鐘;在2000-5000rmp轉(zhuǎn)速下離心5?30min，去除多余水分，獲得均勾膏狀勾楽；；
步驟3.3、冰晶定向凝固制孔:先將模具放入-60?-20°C冰箱中預(yù)冷12-24小時，然后將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，(由于模具的局部低溫，使模具中漿料形成定向溫度梯度，從而形成定向冰晶，)在空氣中放置10-60分鐘，待漿料完全凝固后放入-20?-10°C的冰箱中3-5小時，再放入-60—20 °C的冰箱中定型6-24小時；
步驟3.4、冷凍真空干燥成型:將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，干燥12?48小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0013]進(jìn)一步的，步驟3.2中所述的碳基納米材料為酸化碳納米管或氧化石墨稀。
[0014]本發(fā)明還提供了一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架，所述支架由上述制備方法制得。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:通過結(jié)構(gòu)、成分雙重仿生設(shè)計，將活體細(xì)胞衍生材料、改性納米纖維及導(dǎo)電納米材料復(fù)合，設(shè)計和制作特定模具，使用冰晶定向凝固制孔法及冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管，所獲得的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架，具有高含水率，綜合力學(xué)性能和穩(wěn)定性優(yōu)良，且具有生物活性和電活性，同時具有有利于促進(jìn)血旺細(xì)胞生長增值，引導(dǎo)軸突再生的功能；制備方法簡單，制備的產(chǎn)品形狀和尺寸易調(diào)控，可滿足神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的各項要求、應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0016]圖1所示為本發(fā)明實施例中新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架模具示意圖。
[0017]圖2所示為本發(fā)明實施例中取向多孔神經(jīng)組織工程支架微觀結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖3所示為骨髓干細(xì)胞在多孔神經(jīng)支架上培養(yǎng)7天后的熒光照片圖。
【具體實施方式】
[0019]下文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。在下述實施例的附圖中，各附圖所出現(xiàn)的相同標(biāo)號代表相同的特征或者部件，可應(yīng)用于不同實施例中。
[0020]本發(fā)明實施例一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
細(xì)菌纖維素改性處理的步驟;制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟；以及將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟。
[0021 ]優(yōu)選的，所述細(xì)菌纖維素改性處理的步驟包括:
步驟1.1、細(xì)菌纖維素的預(yù)處理;將細(xì)菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將膜浸泡于0.01~0.511101/1的氫氧化鈉溶液，80-100°(:下煮沸5?601^11，去除膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測pH值，約7.1-7.5；將得到的細(xì)菌纖維素膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分；
步驟1.2、細(xì)菌纖維素的改性處理;將步驟1.1中得到細(xì)菌纖維素雙醛基化或羧甲基化。
[0022]優(yōu)選的，步驟1.2中所述細(xì)菌纖維素雙醛基化，具體為:
采用高碘酸鈉雙醛基化工藝，配置0.01-0.5mol/L的高碘酸鈉溶液;將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維浸泡在上述高碘酸鈉溶液中，避光保存1-5天，得到雙醛基細(xì)菌纖維素(DBC);用去離子水將所述雙醛基細(xì)菌纖維素絮狀纖維反復(fù)浸泡離心沖洗，之后封裝置于陰涼處保存。
[0023]優(yōu)選的，步驟1.2中所述羧甲基化，具體為:
步驟1.2.1、細(xì)菌纖維素的堿化:將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維加入異丙醇中，配制與細(xì)菌纖維素葡萄糖單元等摩爾比的10?30%的氫氧化鈉，將氫氧化鈉緩慢滴加進(jìn)入異丙醇中，同時劇烈攪拌，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)0.5?3h;
步驟1.2.2、細(xì)菌纖維素的醚化:加入纖維素葡萄糖單元3倍摩爾比的氯乙酸鈉，繼續(xù)攪拌，40-700C下反應(yīng)2?12h，冷卻后，棄去溶液，用60?90%的甲醇清洗薄膜，用醋酸調(diào)節(jié)PH至中性，溶液過濾后，繼續(xù)用60?80%的乙醇洗三次，再用無水乙醇洗滌，獲得羧甲基細(xì)菌纖維素(CMBC)薄膜。
[0024]優(yōu)選的，所述制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟，具體為配置2-10%的膠原溶液、或配置2-10%的透明質(zhì)酸溶液、或從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)。
[0025]優(yōu)選的，所述從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)，具體提取方法包括:
步驟2.1、組織前處理:無菌條件下去除血管組織和外膜組織，使用無菌PBS溶液反復(fù)沖洗干凈；制漿:用I?5%的雙氧水浸泡消毒10?60分鐘，繼續(xù)用PBS反復(fù)清洗，隨后放入組織粉碎機(jī)中制成勻漿；
步驟2.2、細(xì)胞破碎:加入勻漿體積5?20倍的無菌三蒸水，低滲混勻，放入-10 °0-40 °C冰箱內(nèi)冰凍，然后于常溫下融化，反復(fù)凍融3~5次，使細(xì)胞膜破碎；
步驟2.3、差速離心:通過差速離心方法分離出細(xì)胞組織勻漿中的細(xì)胞碎片，先在1500?2500r/min下離心15?40min，收集上層楽料;將收集的楽料于2500?3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心15~40111；[11，繼續(xù)收集上層楽料在3500~45001'/111；[11下離心15~40111；[11然后取上清液，如此反復(fù)數(shù)次，使細(xì)胞碎片充分沉淀并分離；
步驟2.4、涂片觀察:收集漿料涂片，顯微鏡下觀察無細(xì)胞碎片殘留后，將獲得的上層漿料在800CK12000r/min下離心15~40min，收集最終沉淀物；
步驟2.5、產(chǎn)物收集:將最終沉淀物用PBS清洗后，配制成2-5%(w/v)的白色乳膏狀細(xì)胞外基質(zhì)漿料。
[0026]優(yōu)選的，所述將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟，具體包括:
步驟3.1、微管導(dǎo)向模具的預(yù)處理:設(shè)計和制作模具，所述模具底板為不銹鋼，外殼及導(dǎo)向管為聚乙烯，將模具放入-60?-20 °C的冰箱中冷凍3-12小時；
步驟3.2、漿料混合:將活體細(xì)胞衍生材料與改性細(xì)菌纖維素及碳基納米材料按比例均勻混合，加入去離子水，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散10-30分鐘;在2000-5000rmp轉(zhuǎn)速下離心5?30min，去除多余水分，獲得均勾膏狀勾楽；；
步驟3.3、溶膠澆注及定向凝固過程控制:將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置10-60分鐘，待漿料完全凝固后放入-20—10 °C的冰箱中3-5小時，再放入-60—20 °C的冰箱中定型6-24小時；
步驟3.4、冷凍真空干燥法成型:將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，干燥12?48小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0027]優(yōu)選的，步驟3.2中所述的碳基納米材料為酸化碳納米管或氧化石墨烯。
[0028]本發(fā)明實施例一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架，所述支架由上述的制備方法制得。
[0029]實施例1
一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
步驟一、取細(xì)菌纖維素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)再將膜浸泡于0.lmol/L的氫氧化鈉溶液，90°C下煮沸60min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約
7.1-7.5；將得到的BC膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分備用；
配置0.lmol/L的高碘酸鈉溶液;將預(yù)處理后的細(xì)菌纖維素浸泡在上述高碘酸鈉溶液中，避光保存三天，得到氧化雙醛基細(xì)菌纖維素(DBC)。用去離子水將氧化細(xì)菌纖維素膜反復(fù)浸泡沖洗，之后封裝置于陰涼處保存；
步驟二、溶解一定量的透明質(zhì)酸，配制成5mg/ml的透明質(zhì)酸溶液，取與透明質(zhì)酸等量的量酸化碳納米管粉末加入溶液中，放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲分散15分鐘；
步驟三、將模具放入-40 °C的冰箱中冷凍6小時，將氧化細(xì)菌纖維素加入分散好的碳納米管-透明質(zhì)酸溶液中，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散15分鐘。使用3000rmp轉(zhuǎn)速下離心1min去除上清液中多余的水分，獲得均勾的膏狀勾楽；
步驟四、將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置20分鐘，隨后放入-200C的冰箱中3小時，再放入-400C的冰箱中定型8小時。隨后將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，冷凍真空干燥24小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0030]實施例2
一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
步驟一、取細(xì)菌纖維素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)再將膜浸泡于0.2mol/L的氫氧化鈉溶液，90°C下煮沸30min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約
7.1-7.5，將得到的BC膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分備用；
將細(xì)菌纖維素絮狀纖維加入異丙醇中，配制與細(xì)菌纖維素葡萄糖單元等摩爾比的20%的氫氧化鈉，將氫氧化鈉緩慢滴加進(jìn)入異丙醇中，同時劇烈攪拌，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)lh。細(xì)菌纖維素的醚化:加入纖維素葡萄糖單元3倍摩爾比的氯乙酸鈉，繼續(xù)攪拌，60°C下反應(yīng)6h，冷卻后，棄去溶液，用80%的甲醇清洗薄膜，用醋酸調(diào)節(jié)PH至中性，溶液過濾后，繼續(xù)80%的乙醇洗三次，再用無水的乙醇洗滌，獲得羧甲基細(xì)菌纖維素；
步驟二、溶解一定量的膠原，配制成5mg/ml的膠原溶液，取與膠原等量的量氧化石墨烯粉末加入溶液中，放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲分散15分鐘；
步驟三、將模具放入_50°C的冰箱中冷凍5小時，將氧化細(xì)菌纖維素加入分散好的氧化石墨烯-膠原溶液中，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散20分鐘。使用2000rmp轉(zhuǎn)速下離心20min去除上清液中多余的水分，獲得均勻的膏狀勻漿；
步驟四、將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置15分鐘，隨后放A-1O0C的冰箱中4小時，再放入-500C的冰箱中定型6小時。隨后將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，冷凍真空干燥24小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0031]實施例3
一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
步驟一、取細(xì)菌纖維素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)再將膜浸泡于0.lmol/L的氫氧化鈉溶液，90°C下煮沸60min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約
7.1-7.5；將得到的BC膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分備用；
配置0.lmol/L的高碘酸鈉溶液。將預(yù)處理后的細(xì)菌纖維素浸泡在上述高碘酸鈉溶液中，避光保存三天，得到氧化雙醛基細(xì)菌纖維素(DBC)。用去離子水將氧化細(xì)菌纖維素反復(fù)浸泡沖洗，之后封裝置于陰涼處保存；
步驟二、從醫(yī)院收集新鮮臍帶細(xì)胞組織，無菌條件下去除血管組織和臍帶外膜組織，使用無菌PBS反復(fù)沖洗干凈；用3%的雙氧水浸泡消毒30分鐘，繼續(xù)用PBS反復(fù)清洗，隨后放入組織粉碎機(jī)中制成勻漿;加入勻漿體積15倍的無菌三蒸水，低滲混勻，放入-20 °C冰箱內(nèi)冰凍，然后于常溫下融化，反復(fù)凍融5次，使細(xì)胞膜破碎；，先在2000r/min下離心30min，收集上層漿料;把將收集的漿料于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心30min，繼續(xù)收集上層漿料在4000r/min下離心30min然后取上清，如此反復(fù)數(shù)次，使細(xì)胞碎片充分沉淀并分離;收集漿料涂片，顯微鏡下觀察無細(xì)胞碎片殘留后，將獲得的上層漿料在lOOOOr/min下離心20min，收集最終沉淀，用PBS溶液清洗，得到細(xì)胞外基質(zhì)；
步驟三、溶解一定量的細(xì)胞外基質(zhì)，配制成5mg/ml的細(xì)胞外基質(zhì)楽料，取與細(xì)胞外基質(zhì)等量的量酸化碳納米管粉末加入漿料中，放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲分散10分鐘；
步驟四、將模具放入-60°C的冰箱中冷凍4小時，將氧化細(xì)菌纖維素加入分散好的碳納米管-細(xì)胞外基質(zhì)漿料中，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲再分散20分鐘。使用3000rmp轉(zhuǎn)速下離心1min去除上清液中多余的水分，獲得均勾的膏狀勾楽；
步驟五、將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置15分鐘，隨后放入-200C的冰箱中3小時，再放入-600C的冰箱中定型4小時。隨后將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，冷凍真空干燥24小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0032]實施例4
一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，包括:
步驟一、取細(xì)菌纖維素膜按照模具大小裁剪成一定尺寸，用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)再將膜浸泡于0.2mol/L的氫氧化鈉溶液，90°C下煮沸30min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約
7.1-7.5，將得到的BC膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分備用；
將細(xì)菌纖維素絮狀纖維加入異丙醇中，配制與細(xì)菌纖維素葡萄糖單元等摩爾比的20%的氫氧化鈉，將氫氧化鈉緩慢滴加入異丙醇中，同時劇烈攪拌，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)lh。細(xì)菌纖維素的醚化:加入纖維素葡萄糖單元3倍摩爾比的氯乙酸鈉，繼續(xù)攪拌，60°C下反應(yīng)6h，冷卻后，棄去溶液，用80%的甲醇清洗薄膜，用醋酸調(diào)節(jié)PH至中性，溶液過濾后，繼續(xù)80%的乙醇洗三次，再用無水的乙醇洗滌，獲得羧甲基細(xì)菌纖維素；
步驟二、溶解一定量的膠原，配制成5mg/ml的膠原溶液，再溶解一定量的透明質(zhì)酸，配制成5mg/ml的透明質(zhì)酸溶液，將透明質(zhì)酸溶液緩慢的滴入膠原溶液中，并不斷攪拌，使二者完全均勻混合，取膠原等量的氧化石墨烯粉末加入溶液中，放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲分散20分鐘；
步驟三、將模具放入_50°C的冰箱中冷凍5小時，將氧化細(xì)菌纖維素加入分散好的氧化石墨烯-透明質(zhì)酸-膠原溶液中，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散30分鐘。使用2000rmp轉(zhuǎn)速下離心20min去除上清液中多余的水分，獲得均勻的膏狀勻漿；
步驟四、將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置15分鐘，隨后放入-200C的冰箱中3小時，再放入-500C的冰箱中定型6小時。隨后將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，冷凍真空干燥24小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。
[0033]本發(fā)明的有益效果為:通過結(jié)構(gòu)、成分雙重仿生設(shè)計，將活體細(xì)胞衍生材料、改性納米纖維及導(dǎo)電納米材料復(fù)合，設(shè)計和制作特定模具，使用冰晶定向凝固制孔法及冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管，所獲得的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架，具有高含水率，綜合力學(xué)性能和穩(wěn)定性優(yōu)良，且具有生物活性和電活性，同時具有有利于促進(jìn)血旺細(xì)胞生長增值，引導(dǎo)軸突再生的功能；制備方法簡單，制備的產(chǎn)品形狀和尺寸易調(diào)控，可滿足神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的各項要求，應(yīng)用前景廣闊。
[0034]本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的幾個實施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本文的實施例進(jìn)行改變。上述實施例只是示例性的，不應(yīng)以本文的實施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
【主權(quán)項】
1.一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括: 細(xì)菌纖維素改性處理的步驟；制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟；以及將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟。2.如權(quán)利要求1所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌纖維素改性處理的步驟包括: 步驟1.1、細(xì)菌纖維素的預(yù)處理;將細(xì)菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)，再將膜浸泡于0.01~0.511101/1的氫氧化鈉溶液，80-100°(:下煮沸5?601^11，去除膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，此時膜呈乳白色半透明；用蒸餾水多次沖洗，用PH試紙輕壓膜測pH值，約7.1-7.5；將得到的細(xì)菌纖維素膜使用機(jī)械高速分散器打碎成絮狀纖維，離心去除水分； 步驟1.2、細(xì)菌纖維素的改性處理;將步驟1.1中得到細(xì)菌纖維素雙醛基化或羧甲基化。3.如權(quán)利要求2所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，步驟1.2中所述細(xì)菌纖維素雙醛基化，具體為: 采用高碘酸鈉雙醛基化工藝，配置0.01-0.5moI/L的高碘酸鈉溶液;將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維浸泡在上述高碘酸鈉溶液中，避光保存1-5天，得到雙醛基細(xì)菌纖維素；用去離子水將所述雙醛基細(xì)菌纖維素絮狀纖維反復(fù)浸泡離心沖洗，之后封裝置于陰涼處保存。4.如權(quán)利要求2所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，步驟1.2中所述羧甲基化，具體為: 步驟1.2.1、細(xì)菌纖維素的堿化:將步驟1.1中預(yù)處理后得到的細(xì)菌纖維素絮狀纖維加入異丙醇中，配制與細(xì)菌纖維素葡萄糖單元等摩爾比的10?30%的氫氧化鈉，將氫氧化鈉緩慢滴加進(jìn)入異丙醇中，同時劇烈攪拌，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)0.5?3h; 步驟1.2.2、細(xì)菌纖維素的醚化:加入纖維素葡萄糖單元3倍摩爾比的氯乙酸鈉，繼續(xù)攪拌，40-700C下反應(yīng)2?12h，冷卻后，棄去溶液，用60?90%的甲醇清洗薄膜，用醋酸調(diào)節(jié)PH至中性，溶液過濾后，繼續(xù)用60?80%的乙醇洗三次，再用無水乙醇洗滌，獲得羧甲基細(xì)菌纖維素薄膜。5.如權(quán)利要求1所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述制備活體細(xì)胞衍生材料的步驟，具體為配置2-10%的膠原溶液、或配置2-10%的透明質(zhì)酸溶液、或從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)。6.如權(quán)利要求5所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述從活體細(xì)胞中提取細(xì)胞外基質(zhì)，具體提取方法包括: 步驟2.1、組織前處理:無菌條件下去除血管組織和外膜組織，使用無菌PBS溶液反復(fù)沖洗干凈；制漿:用I?5%的雙氧水浸泡消毒10?60分鐘，繼續(xù)用PBS反復(fù)清洗，隨后放入組織粉碎機(jī)中制成勻漿； 步驟2.2、細(xì)胞破碎:加入勻漿體積5?20倍的無菌三蒸水，低滲混勻，放入-10 °0-40°C冰箱內(nèi)冰凍，然后于常溫下融化，反復(fù)凍融3~5次，使細(xì)胞膜破碎； 步驟2.3、差速離心:通過差速離心方法分離出細(xì)胞組織勻漿中的細(xì)胞碎片，先在1500?2500r/min下離心15?40min，收集上層楽料;將收集的楽料于2500?3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心15~40min，繼續(xù)收集上層楽料在3500?4500r/ min下離心15~40min，然后取上清液，如此反復(fù)數(shù)次，使細(xì)胞碎片充分沉淀并分離； 步驟2.4、涂片觀察:收集漿料涂片，顯微鏡下觀察無細(xì)胞碎片殘留后，將獲得的上層漿料在800CK12000r/min下離心15~40min，收集最終沉淀物； 步驟2.5、產(chǎn)物收集:將最終沉淀物用I3BS清洗后，配制成2-5%(w/v)的白色乳膏狀細(xì)胞外基質(zhì)漿料。7.如權(quán)利要求1所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述將改性后的細(xì)菌纖維素與活體細(xì)胞衍生材料進(jìn)行均勻混合、注入模具、通過冰晶定向凝固制孔法、冷凍真空干燥法制備神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的步驟，具體包括: 步驟3.1、微管導(dǎo)向模具的預(yù)處理:設(shè)計和制作模具，所述模具底板為不銹鋼，外殼及導(dǎo)向管為聚乙烯，將模具放入-60?-20 °C的冰箱中冷凍3-12小時； 步驟3.2、漿料混合:將活體細(xì)胞衍生材料與改性細(xì)菌纖維素及碳基納米材料按比例均勻混合，加入去離子水，使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲分散10-30分鐘;在2000-5000rmp轉(zhuǎn)速下離心5?30min，去除多余水分，獲得均勾膏狀勾楽；； 步驟3.3、冰晶定向凝固制孔:先將模具放入-60?-20°C冰箱中預(yù)冷12-24小時，然后將混合好的漿料緩慢的倒入預(yù)冷好的模具中，在空氣中放置10-60分鐘，待漿料完全凝固后放Λ-20—10C的冰箱中3-5小時，再放入-60—20 °C的冰箱中定型6_24小時； 步驟3.4、冷凍真空干燥成型:將模具從冰箱中取出，使用冷凍干燥機(jī)，干燥12?48小時，脫出模具獲得管狀取向多孔支架。8.如權(quán)利要求7所述的新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架的制備方法，其特征在于，步驟3.2中所述的碳基納米材料為酸化碳納米管或氧化石墨稀。9.一種新型神經(jīng)修復(fù)組織工程支架，其特征在于，所述支架由如權(quán)利要求1-8任一項所述的制備方法制得。
【文檔編號】A61L27/20GK105854077SQ201610327773
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】鄭裕東, 喬堃, 溫曉曉, 彭江, 吳健, 趙振江
【申請人】北京科技大學(xué)