專利名稱：一種組織工程血管的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程血管的構(gòu)建方法，更具體地說是一種自體活組織材料體 外構(gòu)建血管移植物的方法，屬于組織工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景目前，心血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，特別是血管閉塞性疾 病最終必須依靠外科手術(shù)的方法置換病變血管。目前常用的血管移植材料包括以不可 降解的人工合成材料制作的人工血管、以及經(jīng)過不同方法處理過的同種或異種血管和 自體血管。人工血管材料的主要問題是存在血栓形成、凝血問題；同種或異種血管主 要存在排異反應(yīng)、鈣化、耐久性差等問題。自體血管目前仍然是中小血管移植材料的 主要來源，但自體血管來源受限，數(shù)量有限，特別是老年患者、腎臟疾病患者、糖尿 病、高血壓患者中，可移植的無病變血管更顯稀少，尤其是在需要多支旁路或在手術(shù) 病人中，更是如此。雖然經(jīng)過多年的努力，但目前仍未獲得突破性進(jìn)展。近年來，組織工程學(xué)方法的提出，有望徹底的解決這些問題，其原理是應(yīng)用細(xì)胞 種植的方法，將病人的活細(xì)胞在體外培育成為有活性的組織，再植入到病人體內(nèi)，活 細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分逐漸改造，最終實現(xiàn)活組織器官的再生。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)以可降解的高分子材料為支架，但高分子材料存在力學(xué)性能 差、難以塑形、降解產(chǎn)物在局部存在不同程度的毒性等缺點。因此，生物來源的材料 越來越受到重視。以膠原基架為代表的重組細(xì)胞外基質(zhì)材料在生物相容性上具傳統(tǒng)材 料無法比擬的優(yōu)勢，然而在力學(xué)性能、順應(yīng)性等方面存在的問題極大的制約了這類材 料在組織工程中的廣泛應(yīng)用。異種或異體來源的脫細(xì)胞材料在力學(xué)強度、順應(yīng)性上存 在著特有的優(yōu)勢，但同時存在傳染疾病、抗原殘留等問題。此外，組織鈣化已經(jīng)成為 制約此類材料應(yīng)用的重要原因。近年來，受體自身來源的組織材料以其獨具的優(yōu)勢， 引起了人們的注意。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以自體活組織材料構(gòu)建組織工程血管移植材料 的方法，在體外應(yīng)用該方法可以構(gòu)建適合于作為血管移植材料的組織工程血管移植物。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案(見圖l):一種組織工程血管的構(gòu)建方法，包括如下步驟 (1 )將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續(xù)灌流的生物反應(yīng)器 內(nèi)，管腔外貯滿培養(yǎng)液；血管培養(yǎng)生態(tài)模擬系統(tǒng)分內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)，分別由兩臺多檔 可調(diào)蠕動泵驅(qū)動。反應(yīng)器參照文獻(xiàn)設(shè)計(見圖2)(參見Mali JW, Philipp AW， Rademacher A， et al. Re-endothelialization of punctured ePTFE graft: an in vitro study under pulsed perfusion condition. Nephrol Dial Transplant, 2004， 19:61-67.)。內(nèi)夕卜循環(huán)分另U充盈自行配置的內(nèi)循環(huán)培養(yǎng)液和外循環(huán)培養(yǎng)液。圖中(A)內(nèi)循環(huán)的蓄液瓶；(B)內(nèi)循環(huán)的蠕 動泵，液流方向如箭頭所示；(C)內(nèi)循環(huán)的液容；(D)反應(yīng)器的灌流室；(E)外 循環(huán)的蠕動泵；(F)外循環(huán)的蓄液瓶。al、 a2分別為內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)的氣體交換進(jìn) 氣道，bl、 b2分別為內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)的氣體交換排氣道，均接有孔徑小于0.2um的 針式微孔濾器，過濾除菌。(2) 將體外培養(yǎng)獲得的自體內(nèi)皮細(xì)胞以M199懸浮，或?qū)⒐撬鑶蝹€核細(xì)胞誘導(dǎo)生成 的自體內(nèi)皮樣細(xì)胞以內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內(nèi)表面；(3) 待內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮樣細(xì)胞黏附后接通管腔內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)，并模擬血液循 環(huán)逐漸給予適當(dāng)?shù)募羟辛Υ碳?5~15dyn/cm2)，壓力95/55mmHg，于37°C 5%二氧 化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培育5 7天，獲得組織工程血管樣復(fù)合物。所述自體活組織基架材料的構(gòu)建方法以微創(chuàng)小切口技術(shù)將適合長度的醫(yī)用硅膠 管埋植入實驗動物腹腔或皮下，做為異物模型，2~3周后，以無菌手術(shù)的方法將自體 活組織包裹形成的硅膠管莢囊完整取出。剪除封閉莢囊的兩端后，抽出硅膠管后，形 成管狀自體活組織結(jié)構(gòu)，作為組織工程血管構(gòu)建的基架材料。本發(fā)明首先以異物植入體內(nèi)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生包裹反應(yīng)，以構(gòu)建可供組織工程應(yīng)用 的血管基架材料(一般來說肌性管道及囊性器官的構(gòu)建都適宜用此方法)。同時在體 外擴增培養(yǎng)自體血管內(nèi)皮細(xì)胞或?qū)⒐撬鑱碓吹拈g充質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮方向誘導(dǎo)，作為種子 細(xì)胞。然后在靜態(tài)或旋轉(zhuǎn)條件下，將種子細(xì)胞接種于血管基架材料的內(nèi)表面。接著在 體外持續(xù)灌流情況下，給以脈動和搏動刺激，在保證基架材料存活的基礎(chǔ)上，促進(jìn)活 細(xì)胞的成熟和分化。最終形成可供移植的血管樣移植材料，達(dá)到應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu) 建血管移植材料的目的。我們以自體活組織為基架構(gòu)建的組織工程血管移植材料移植到細(xì)胞供體的股動 脈，l個月后隨訪，無明顯阻塞及血栓形成，組織學(xué)發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜無明顯增生表現(xiàn)。本發(fā)明的優(yōu)點是首次嘗試了以自體活組織作為組織工程基架材料構(gòu)建組織工程4器官，在保證自體活組織材料存活的基礎(chǔ)上，在材料表面進(jìn)行了細(xì)胞種植的研究。自 體來源的活組織基架管具有完美的細(xì)胞相容性和足夠的力學(xué)強度，且所構(gòu)建的器官可 完全排除異種、異體免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險,克服了異源性材料引起免疫排斥及炎癥 反應(yīng)等缺陷。本發(fā)明所需時間較短，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同類技術(shù)所需時間的3 6個月的周期。下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng) 域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作 出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為本發(fā)明基本原理的示意圖，將種植于腹腔內(nèi)獲得的自體活組織生物管連接于體外反應(yīng)器，于管腔面種植內(nèi)皮細(xì)胞，形成類似血管樣結(jié)構(gòu)。 圖2為本發(fā)明所使用的反應(yīng)器及血管生物模擬系統(tǒng)的示意圖。 圖3為自體活組織生物管的HE染色400倍普通光鏡照片。 圖4為經(jīng)本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化血管復(fù)合物的HE染色400倍普通光學(xué)顯微鏡照片。 圖5為種植細(xì)胞后的自體活組織生物管Masson染色的200倍普通光學(xué)顯微鏡照片。 圖6為天然血管的Masson染色的200倍普通光學(xué)顯微鏡照片。 圖7為經(jīng)本發(fā)明方法構(gòu)建的組織工程化血管復(fù)合物的地衣紅法彈力纖維染色的200倍普通光學(xué)顯微鏡照片。圖8為天然動脈血管的彈力纖維染色的200倍普通光學(xué)顯微鏡照片。圖9為未種植細(xì)胞前的新鮮自體活組織生物管表面結(jié)構(gòu)的200倍掃描電鏡照片?？梢姶罅坷w維結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)成分，偶見血細(xì)胞及成纖維細(xì)胞突起。圖10為旋轉(zhuǎn)高密度法接種內(nèi)皮6小時后管腔內(nèi)表面的200倍掃描電鏡照片。圖11為圖IO放大至IOOO倍的掃描電鏡照片?？梢姽芮粌?nèi)表面大量細(xì)胞黏附，多數(shù)細(xì)胞仍呈圓形，部分細(xì)胞伸展黏附呈梭形。圖12為靜態(tài)種植24小時后管腔內(nèi)表面的200倍掃描電鏡照片。圖13為圖12放大至IOOO倍的掃描電鏡照片?？梢婐じ郊?xì)胞貼壁生長，伸展，局部有一定的極向性，但總體極性不明顯。圖14為給予漸增的剪切力刺激后，種植72小時后管腔內(nèi)表面的200倍掃描電鏡照片。圖15為圖14放大至IOOO倍的掃描電鏡照片?？梢娂?xì)胞生長極向性明顯，細(xì)胞長 軸普遍沿液流方向排列，可見細(xì)胞間有匯合生長趨勢。圖16為動態(tài)灌流培養(yǎng)達(dá)5天時，管腔內(nèi)表面的200倍掃描電鏡照片。圖17為圖16放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見細(xì)胞極向性明顯，細(xì)胞排列緊密，管腔內(nèi)表面光滑，細(xì)胞生長匯合。圖18為天然犬股動脈血管內(nèi)腔面200倍掃描電鏡照片。圖19為圖18放大至IOOO倍的掃描電鏡照片?？梢娂?xì)胞匯合生長，表面光滑，細(xì) 胞排列極向性明顯。圖20為本方明構(gòu)建的組織工程化血管樣復(fù)合物的平滑肌特異性肌動蛋白(SM-ci-actin)免疫組化染色的400倍普通光學(xué)顯微鏡照片。圖21為天然股動脈的SM- a -actin免疫組化染色的400倍普通光學(xué)顯微鏡照片。 圖22為本方明構(gòu)建的組織工程化血管樣復(fù)合物的第W因子相關(guān)抗原免疫組化染色的400倍普通光學(xué)顯微鏡照片。圖23為天然動脈的第VDI因子相關(guān)抗原免疫組化染色的400倍普通光學(xué)顯微鏡照片。 圖24為以PKH-26標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞種植后，血管內(nèi)腔面的激光共聚焦顯微鏡200倍照片。圖25為圖24標(biāo)本的激光共聚焦顯微鏡400倍照片。圖26為圖24標(biāo)本的橫切面激光共聚焦顯微鏡200倍照片。圖27為圖24標(biāo)本的橫切面激光共聚焦顯微鏡的400倍照片?？梢姛晒鈽?biāo)記的細(xì) 胞種植并鋪展生長于管腔內(nèi)表面，呈單層排列。圖28為未種植細(xì)胞的自體活組織生物管與血小板作用后的內(nèi)表面的1000倍掃描 電鏡照片。未種植內(nèi)皮細(xì)胞的組織表面可見明顯的血小板黏附聚集，呈團(tuán)狀，難于分 辨單個血小板的形態(tài)。圖29為種植內(nèi)皮細(xì)胞后的組織工程復(fù)合物與血小板作用后的內(nèi)表面1000倍掃描 電鏡照片。種植內(nèi)皮細(xì)胞的組織工程復(fù)合物表面幾乎無明顯血小板黏附，表面依然保 持光滑。圖30為本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化血管復(fù)合物內(nèi)表面的6000倍透射電鏡照片?？梢妰?nèi)皮細(xì)胞間有緊密連接形成，細(xì)胞表面有絨毛樣結(jié)構(gòu)。圖31為本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化血管復(fù)合物管壁細(xì)胞的20，000倍透射電鏡照片。 圖32為本發(fā)明構(gòu)建的組織工程化血管復(fù)合物管壁細(xì)胞的30，000倍透射電鏡照片。可見細(xì)胞膜表面可見多個致密斑、細(xì)胞內(nèi)可見成束的細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)及吞飲小泡、細(xì)胞表面被覆蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)。
具體實施方式
實施例1.一. 試劑和材料1. 磷酸鹽緩沖液(PBS液)市售PBS粉末(Gibco) —小包，溶于1000ml蒸 餾水中，調(diào)整pH7.2，過濾除菌后，分裝，置4'C備用。2. M199培養(yǎng)液市售M199粉末(Gibco) —小袋，加碳酸氫鈉1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，調(diào)節(jié)pH至7.2，過濾除菌，按250ml分裝，置4。C貯存?zhèn)溆谩?. DMEM培養(yǎng)液市售DMEM粉末(Gibco)—小袋，加碳酸氫鈉1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，調(diào)節(jié)pH至7.2，過濾除菌，按250ml分裝，置4'C貯 存?zhèn)溆谩?. 內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)循環(huán)培養(yǎng)液含15 20。/。FBS和0.1mg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長補充物 (ECGS，購自中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所)的M199培養(yǎng)液。5. 外循環(huán)培養(yǎng)液含20%胎牛血清(FBS, Gibco) 、 2ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生 長因子(b-FGF, PeproTech) 、 50ng/ml血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB， PeproTech) 、 10ng/ml胰島素樣生長因子(IGF, PeproTech) 、 0.5ng/ml表皮細(xì)胞生 長因子(EGF， PeproTech)的DMEM溶液。6. 內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液將購自美國Canbrex bio science valkersville公司的 EBM-2加EGM-2MV SingleQuots無菌條件下按說明書混合，分裝后置4。C保存。7. 0.05。/。胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.4Na溶液:胰蛋白酶(1: 250) (Gibco) 0.5g， EDTA.4Na0.2g，加無Ca2+、 Mg2+BSS加至1L，過濾除菌，分裝小瓶，.20。C保 存。8. 醫(yī)用硅膠管選擇直徑4mm的醫(yī)用中空硅膠管，分別剪裁為長度2cm、 4cm、 6cm的小段，密封包裝后環(huán)氧乙烷消毒滅菌，室溫空氣中放置1周后備用。9. 青霉素/鏈霉素溶液(100倍濃度)青霉素1.0 106IU,鏈霉素lg，加0.9%生理 鹽水至100ml，過濾除菌，分裝小瓶，置-2(TC保存。10. 0.1%膠原酶溶液市售IV型膠原酶(Sigma) 100mg，加PBS溶液至100ml， 過濾除菌，分裝置-2(TC保存。二. 方法(一)內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)無菌手術(shù)條件下，切取實驗動物頸外靜脈血管組織約10cm，以0.1%的膠原酶腔 內(nèi)灌注消化后收集細(xì)胞，離心洗滌后，以1X10e個/ml細(xì)胞密度接種于預(yù)先以明膠鋪 底的培養(yǎng)瓶，加入20%胎牛血清、0.1mg/ml血管內(nèi)皮生長補充物(ECGS) 、 200U/ml 青霉素、0.2ug/ml鏈霉素的M199培養(yǎng)液，37°C 5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)帖壁培養(yǎng)，取第二 到六代細(xì)胞用于實驗。實驗細(xì)胞留取樣本進(jìn)行VI因子、CD31免疫組織化學(xué)染色鑒定。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮的誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒別試驗動物麻醉后，無菌條件下抽取骨髓lOml。以PBS 1: l稀釋后，鋪于密度為 1.073的淋巴細(xì)胞分離液表面，室溫下2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，吸取單個核細(xì)胞層，以 PBS液稀釋后1500轉(zhuǎn)離心洗滌5 10分鐘，以EBM-2 EGM-2V培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)并 調(diào)整細(xì)胞密度，按5X10S/cr^接種于預(yù)先以纖維連接蛋白(Fn)鋪底的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置 于37°C 5%C02飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化為內(nèi)皮細(xì) 胞。接種培養(yǎng)后每2~3天換液一次，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞長滿瓶底80% 時用0.05y。胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA.4Na (Gibco)溶液消化傳代。第二代細(xì)胞種植 于蓋玻片上，進(jìn)行V111因子、CD31、 FLK-1免疫組化染色鑒定。(二) 自體活組織生物材料的獲得實驗動物麻醉后，無菌條件下，作一長l 2cm切口，將適合長度的醫(yī)用硅膠管埋 植入實驗動物腹腔內(nèi)或背部皮下。2~3周后，同樣以微創(chuàng)的方法將腹膜或皮下組織包 裹的硅膠管莢囊完整取出。于無菌條件下適當(dāng)修整后，剪除封閉莢囊的兩端后，抽出 硅膠管后，形成管狀結(jié)構(gòu)。(三) 自體活組織基架管的體外培養(yǎng)及細(xì)胞種植 將獲得的自體活組織生物材料管以3-0絲線無菌條件下連接于體外持續(xù)灌流的血管生物反應(yīng)器內(nèi)，管腔外腔注滿外循環(huán)液，采用高密度種植法將體外培養(yǎng)獲得的自體 頸靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以內(nèi)循環(huán)培養(yǎng)液懸浮，按5X106/1111濃度接種于試驗管腔內(nèi)，于二氧 化碳溫箱內(nèi)(5%C02 37°C)以手工翻轉(zhuǎn)或勻速緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2 4小時，以使細(xì)胞充分 黏附，然后接通內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)，首先靜態(tài)培養(yǎng)24小時，然后模擬血液循環(huán)，調(diào)節(jié)灌 流速度，3天內(nèi)逐漸由增加到3~9ml/s，剪切力剌激(5~15dyn/cm2)，壓力95/55mmHg。 于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培育至5天，即得組織工程血管。實施例2.結(jié)果評價對實施例1涉及的新鮮自體活組織生物管及組織工程血管分別留取標(biāo)本，依下法進(jìn)行力學(xué)測定和生物學(xué)檢測。 一.方法(一) 力學(xué)檢測1. 斷裂拉伸強度的測定將標(biāo)本裁成板材狀，在拉力機上將其拉斷，所測的最大 拉力除以實驗材料的橫截面積，即為標(biāo)本的材料拉伸強度，表示自體活組織材料的抗 拉伸能力。2. 斷裂伸長率的測定將標(biāo)本裁成板材狀，在拉力機上將其拉斷，記錄樣品從被 拉伸到被拉斷的長度變化，除以樣品的原始長度，所的百分比即為標(biāo)本材料的斷裂伸 長率，表示材料的變形能力。3. 標(biāo)本的爆破強度測定將自體活組織管標(biāo)本連接于爆破壓測量表，游離端封閉， 裝置內(nèi)充盈PBS液，調(diào)節(jié)加壓螺栓壓縮腔內(nèi)液體，以壓力表記錄管道系統(tǒng)內(nèi)增加的壓 力。爆破壓被定義為管型材料破裂前所達(dá)到的最高壓力，表示材料對壓力變化的耐受 能力。4. 標(biāo)本的縫合強度測定實驗標(biāo)本一端夾在拉力機上，另一端以6-0的尼龍縫線連接于拉力機的另一個夾具上。然后以lmm/min的速度勻速牽拉，記錄完全斷裂時的 拉力。表示材料的可縫合性。(二) 生物學(xué)檢測1. 標(biāo)本的基本結(jié)構(gòu)用10%的中性福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋，切成4微米厚的薄片，經(jīng)二甲苯脫蠟、系列酒精脫水、蘇木素-伊紅染色，觀察標(biāo)本的大致細(xì)胞組成和排列分布。2. 標(biāo)本的纖維結(jié)構(gòu)用10%的中性福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋，切成4微米 厚的薄片，經(jīng)二甲苯脫蠟、系列酒精脫水、Masson染色及地衣紅法彈力纖維染色，觀 察標(biāo)本的纖維排列和組成。3. 標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)標(biāo)本用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，乙醇逐級脫水，二 氧化碳臨界點干燥,真空噴金，掃描電鏡(SEM)觀察生物管內(nèi)腔面的超微結(jié)構(gòu)。4. 標(biāo)本的免疫組化染色檢査用中性福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋，切成4微 米厚的薄片，經(jīng)二甲苯脫蠟、系列酒精脫水，抗原修復(fù)，按二步法依次加一抗及二抗 后，滴加顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，觀察特定VII因子、a-actin的表達(dá)情況。5. 內(nèi)皮細(xì)胞的熒光標(biāo)記示蹤用PKH26-GL預(yù)標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，按3X1(^M劑量標(biāo)記1X10"個細(xì)胞。按前述方法將標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞種植于自體活組織血管基架材料的表面。所得組織管行2.5%的戊 二醛固定。將管樣結(jié)構(gòu)修剪為片狀，內(nèi)腔面朝下，置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察，并 攝像。同時取部分標(biāo)本，以O(shè)CT膠包埋，液氮冰凍15秒，冰凍切片機內(nèi)-25'C切片， 厚度為8um，載玻片上甘油指甲油封片后，置共聚焦顯微鏡下觀察。6. 血小板黏附試驗以置入反應(yīng)器經(jīng)相同條件處理而未種植內(nèi)皮細(xì)胞的基架管為對照，將血小板懸液 與種植內(nèi)皮后的血管樣類似物靜態(tài)孵育，2小時后取出，以PBS沖洗管腔面3遍，2.5% 戊二醛固定后，行SEM觀察。7. 組織工程血管的透射電鏡觀察將2.5%戊二醛固定過夜的標(biāo)本，PBS沖洗3次后，1%的四氧化鋨4'C媒染固定 30min，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片制備，甲苯胺藍(lán)染色，選擇興趣區(qū) 域，切成8納米的超薄切片，電鏡下觀察。本組試驗標(biāo)本均送首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇 醫(yī)院電子顯微鏡室完成。三.實驗結(jié)果(一) 力學(xué)檢測結(jié)果1. 斷裂拉伸強度新鮮自體活組織管拉伸強度4.7士2.3MPa，培養(yǎng)后血管類似物 為4.5土1.8MPa，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。2. 斷裂伸長率新鮮自體活組織管的斷裂伸長率為34.2±8.3%，培養(yǎng)后血管類 似物為33.1±10.2%，統(tǒng)計學(xué)無明顯差異。3. 爆破強度新鮮自體活組織管的爆破強度1100土187mmHg，種植細(xì)胞后的組 織工程血管復(fù)合物為1070土115mmHg，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。4. 縫合耐受強度新鮮活組生物管的縫合耐受強度為2.5士0.3N，種植細(xì)胞后的 組織工程血管復(fù)合物為2.4士0.7N，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。(二) 生物學(xué)檢測結(jié)果1. 基本結(jié)構(gòu)新鮮自體活組織生物管的普通HE染色染色顯示由大量呈同心圓狀排列的梭形細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞呈長梭形，內(nèi)層較外層細(xì)胞稀薄，管壁內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞浸潤(見圖3)。種植后的組織工程復(fù)合物可見管腔內(nèi)表面單層扁平細(xì)胞覆蓋，管壁亦 由大量同心圓狀排列的梭形細(xì)胞組成，而炎性細(xì)胞明顯減少，僅偶見(見圖4)。2. 纖維結(jié)構(gòu)種植細(xì)胞后的組織工程復(fù)合物經(jīng)Masson染色可見膠原纖維呈波浪 狀排列，類同心圓樣結(jié)構(gòu)，其間可見平滑肌樣細(xì)胞，與天然血管結(jié)構(gòu)相似(見圖5、6)。兩者相比較可以看出，兩者的細(xì)胞外基質(zhì)成分均有大量的膠原纖維構(gòu)成，呈同心圓樣 排列，膠原纖維成波浪狀排列，圖中染為藍(lán)色；纖維間可見的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，平滑肌細(xì)胞 染成發(fā)紫紅色；但圖6中表層細(xì)胞下可見明顯的連續(xù)的基底膜結(jié)構(gòu)形成，圖中呈粉紅 色線狀，而圖5中無此結(jié)構(gòu)。地衣紅法彈力纖維染色可見組織工程復(fù)合管中無明顯彈 力板樣結(jié)構(gòu)(見圖7、 8)。兩者相比較可以看出，圖7中無明顯的彈力纖維板樣結(jié)構(gòu) 形成，而圖8中可見明顯的彈力纖維板樣結(jié)構(gòu)。3. 表面結(jié)構(gòu)新鮮自體活組織生物管表面可見纖維狀結(jié)構(gòu)，及大量的細(xì)胞外基質(zhì) 成分，偶見血細(xì)胞成分及成纖維細(xì)胞突起(見圖9)。種植細(xì)胞后的組織工程復(fù)合物 表面由內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，且細(xì)胞隨液流方向規(guī)律排列，且隨時間延長而漸趨匯合，表面 光滑，與天然血管類似(見圖10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19)。4. 免疫組化染色種植細(xì)胞后的組織工程血管復(fù)合物具有與天然血管類似的結(jié)構(gòu)，管壁均含有大量的a-actin陽性細(xì)胞，內(nèi)腔面被覆單層細(xì)胞，VIII因子染色陽性(見圖 20、 21、 22、 23)?？梢钥闯?，本發(fā)明構(gòu)建的組織工程樣血管復(fù)合物與天然血管類似， 內(nèi)腔面被覆的單層細(xì)胞染色陽性，呈棕黃色。5. 內(nèi)皮細(xì)胞的熒光標(biāo)記示蹤顯示PKH26示蹤免疫熒光陽性的細(xì)胞被覆于組織 工程血管復(fù)合物內(nèi)腔面，共聚焦顯微鏡顯示內(nèi)腔面被覆細(xì)胞彼此匯合，幾乎覆蓋全部 內(nèi)腔面，橫切面上可見熒光標(biāo)記陽性的細(xì)胞呈單層狀，局限被覆于管腔內(nèi)表面(見圖 24、 25、 26、 27)。6. 血小板黏附實驗種植內(nèi)皮細(xì)胞后的組織工程復(fù)合物表面幾乎無明顯血小板黏 附，而在反應(yīng)器內(nèi)經(jīng)同樣條件處理的未種植細(xì)胞的自體活組織生物管表面，則可見明 顯的血小板黏附聚集成團(tuán)，難于分辨單個血小板的形態(tài)(見圖28、 29)。7. 透射電鏡檢測種植的內(nèi)皮細(xì)胞呈單層排列于管腔表面，細(xì)胞間有緊密聯(lián)結(jié)， 可見細(xì)胞表面有微絨毛樣結(jié)構(gòu)(見圖30)。內(nèi)皮下管壁中層細(xì)胞具有明顯的平滑肌樣 結(jié)構(gòu)，如成束的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)、吞飲小泡、細(xì)胞表面被覆的蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分(見圖31、 32)。
權(quán)利要求
1. 一種組織工程血管的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續(xù)灌流的生物反應(yīng)器內(nèi)，管腔外貯滿培養(yǎng)液，血管培養(yǎng)生態(tài)模擬系統(tǒng)分內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)；(2)將體外培養(yǎng)獲得的自體內(nèi)皮細(xì)胞以M199懸浮，或?qū)⒐撬鑶蝹€核細(xì)胞誘導(dǎo)生成的自體內(nèi)皮樣細(xì)胞以內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內(nèi)表面；(3)待內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮樣細(xì)胞黏附后接通管腔內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)，并模擬血液循環(huán)，調(diào)節(jié)灌流速度，給予適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳?、剪切力刺激，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培育5～7天，獲得組織工程血管樣復(fù)合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程血管的構(gòu)建方法，其特征在于所述自體 活組織基架材料的構(gòu)建方法為以微創(chuàng)小切口技術(shù)將適合長度的醫(yī)用硅膠管埋植入實 驗動物腹腔或皮下，做為異物模型，2~3周后，以無菌手術(shù)的方法將自體活組織包裹 形成的硅膠管莢囊完整取出；剪除封閉莢囊的兩端后，抽出硅膠管后，形成管狀自體 活組織結(jié)構(gòu)，作為組織工程血管構(gòu)建的基架材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程血管的構(gòu)建方法，其特征在于所述壓力 為95/55mmHg 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程血管的構(gòu)建方法，其特征在于所述剪切 力刺激為5 15dyn/cm2。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程血管的構(gòu)建方法，其特征在于所述調(diào)節(jié) 灌流速度為3天內(nèi)逐漸增加到3 9ml/s。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程血管的構(gòu)建方法，屬于組織工程領(lǐng)域。一種組織工程血管的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續(xù)灌流的生物反應(yīng)器內(nèi)，管腔外貯滿培養(yǎng)液；(2)將體外培養(yǎng)獲得的自體內(nèi)皮細(xì)胞以M199懸浮，或?qū)⒐撬鑶蝹€核細(xì)胞誘導(dǎo)生成的自體內(nèi)皮樣細(xì)胞以內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內(nèi)表面；(3)待內(nèi)皮細(xì)胞或者內(nèi)皮樣細(xì)胞黏附后接通管腔內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)，并模擬血液循環(huán)給予適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳ぁ⒓羟辛Υ碳?，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培育5～7天。本發(fā)明的優(yōu)點是具有完美的細(xì)胞相容性和足夠的力學(xué)強度，克服了異源性材料引起免疫排斥及炎癥反應(yīng)等缺陷，制備需時間較短。
文檔編號A61L27/00GK101259292SQ200710064210
公開日2008年9月10日 申請日期2007年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月6日
發(fā)明者俞衡錫, 吳應(yīng)鋒, 崔世軍, 建 張, 東 徐, 李學(xué)鋒, 李建新, 濤 羅, 谷涌泉, 郭連瑞, 兵 陳, 陳曉松, 齊力行 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院