專利名稱：利用植物病毒載體進行miRNA靶標模擬序列構(gòu)建和表達的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用植物病毒載體進行miRNA靶標模擬序列構(gòu)建和表達的方法。
背景技術(shù)：
在2007年,Franco-Zorrilla等人報道了擬南芥中的一個基因IPSl (Induced byPhosphate Starvationl)。該基因?qū)儆赥PSI家族的成員。IPSl基因的表達受低磷脅迫誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ー種非編碼RNA，其中包含一段與miR399互補的區(qū)域。但是與該家族其他成員不同的是，IPSl的這段區(qū)域在關(guān)鍵的結(jié)合位點含有突變，因而其轉(zhuǎn)錄得到的RNA雖然能被miR399識別并結(jié)合，但是無法被含有miR399的RISC復(fù)合體切割并降解，更重要的是，這種miRNA和mRNA的相互作用會影響miR399正常功能的發(fā)揮，例如抑制miR399介導(dǎo)的對PH02基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解，從而起到關(guān)閉miRNA功能的作用。通過對IPSl基因中miRNA的結(jié)合區(qū)域序列的改造，F(xiàn)ranco-Zorrilia等人成功的得到了抑制擬南芥miR319和miR156的 轉(zhuǎn)基因植物，并研究了 miRNA功能關(guān)閉對擬南芥植株發(fā)育的影響。在隨后的幾年中，這種稱為miRNA祀標模擬(target mimicry)的技術(shù)在擬南芥中得到了更為廣泛的應(yīng)用。2010年，Todesco等人報道了一系列利用miRNA靶標模擬技術(shù)構(gòu)建的不同miRNA沉默轉(zhuǎn)基因擬南芥，并研究了這些miRNA的沉默對擬南芥葉片、花和果實發(fā)育的影響。以上結(jié)果說明，作為ー種抑制miRNA的技術(shù)，miRNA靶標模擬在研究植物內(nèi)源miRNA功能方面具有重要的價值。目前miRNA靶標模擬序列的構(gòu)建是通過搭橋PCR完成的，此過程中需要兩輪PCR反應(yīng)，最終將得到的目標片段連入載體。這ー克隆方法操作較為繁瑣且在PCR反應(yīng)中容易出現(xiàn)突變從而影響下一歩的實驗操作；另一方面，目前在植物中進行miRNA靶標模擬實驗需要將構(gòu)建好的含有miRNA靶標模擬序列的T-DNA載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入植物進而構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，這ー過程在ー些植物中實驗周期較長，技術(shù)要求高且難于實現(xiàn)。以上兩方面問題限制了 miRNA靶標模擬技術(shù)在植物miRNA功能研究方面的運用。因而發(fā)展一種不需PCR反應(yīng)的ー步構(gòu)建miRNA靶標模擬序列的方法以及ー種不需要轉(zhuǎn)基因而利用植物病毒載體進行快速miRNA靶標模擬序列表達的方法是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用植物病毒載體進行miRNA靶標模擬序列構(gòu)建和表達的方法，具有簡單、快速的優(yōu)點。本發(fā)明提供構(gòu)建miRNA靶標模擬序列表達載體的方法，包括如下步驟I)化學合成編碼所述miRNA靶標模擬序列的雙鏈DNA分子，所述雙鏈DNA分子的兩端均帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端或平末端；2)將所述雙鏈DNA分子插入載體的所述限制性內(nèi)切酶位點間，得到表達所述miRNA靶標模擬序列的重組表達載體。所述miRNA具體可為序列表序列2所示的miRNA158或序列表序列3所示的miRNA172。所述miRNA靶標模擬序列可為所述miRNA反向互補序列5’端第10位和第11位之間插入3個隨機堿基得到的核苷酸序列；在本發(fā)明實施例I中miRNA158靶標模擬序列為5’ -agcuuugucacuaacauuuggga-3，；在本發(fā)明實施例2中miRNA172靶標模擬序列為5， -augcagcaucgaguucaagauucu-3> 所述載體為植物病毒表達載體，具體可為序列表序列I所示的植物病毒表達載體 PTY102。所述植物病毒表達載體為可在植物中表達外源基因的病毒載體。本發(fā)明提供ー種抑制植物miRNA表達量的方法，包括將使用上述構(gòu)建miRNA靶標模擬序列表達載體的方法得到的重組表達載體導(dǎo)入所述植物中，使所述植物中所述miRNA靶基因的表達量升高；所述構(gòu)建miRNA靶標模擬序列表達載體的方法中的所述載體為植物病毒表達載體，具體可為所述植物病毒表達載體PTY102。當所述植物病毒表達載體為所述植物病毒表達載體pTY102時，所述植物可為煙草脆裂病毒(TRV)的宿主植物，如煙草、番茄、擬南芥、棉花、枸杞和草莓等，具體可為煙草。當所述miRNA 為 miRNA158 時，所述 miRNA 靶基因為 BP525786 和/或 DV159037，當所述 miRNA 為 miRNA172，所述 miRNA 靶基因為 NbAP2_like。本發(fā)明還保護序列表序列I所示的植物病毒表達載體PTY102。實驗證明，化學合成編碼miRNA158或miRNA172靶標模擬序列的DNA分子插入植物病毒表達載體PTY102得到的重組表達載體再導(dǎo)入煙草葉片中，3周后即可檢測到煙草的表型變化和miRNA靶標基因表達量的升高。本發(fā)明不需進行搭橋PCR，方法簡單；本發(fā)明利用了病毒所具有的表達量高、寄主范圍廣及在整株植物上擴散快速的特點，可快速和方便的降低植物內(nèi)源miRNA的表達水平，為研究植物內(nèi)源miRNA功能提供了一個新的途徑。


圖I為植物病毒表達載體pTY102的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖。其中，LB和RB為T-DNA的左右邊界；2X35S Pro為啟動子;Rz為核酶切割位點；N0St為轉(zhuǎn)錄終止子；CP為編碼煙草脆裂病毒(TRV)外殼蛋白的基因；PEBV CP Pro為來自豌豆早褐病毒(PEBV)的亞基因組中外殼蛋白基因CP的啟動子；IPS1 5’和IPSl 3’為IPSl基因的5’和3’部分序列；ccdB為負向篩選因子，ChmE為氯霉素抗性基因；為保證酶切位點的唯一性，IPSl基因5’部分的XbaI位點已被突變?yōu)閏ctaga，且該突變不影響miRNA靶標模擬的效果。圖2為利用載體PTY102構(gòu)建miRNA靶標模擬序列重組表達載體的過程。圖3為導(dǎo)入miRNA158靶標模擬序列后的煙草植株表型。其中，左圖為對照組，右圖為實驗組。圖4為導(dǎo)入miRNA158靶標模擬序列后煙草中miRNA158靶基因的RT-PCR電泳圖。其中，從上到下三行圖的擴增的目的基因依次為BP525786、DV159037和actin ;左列為對照組，右列為實驗組；M為分子量標準(從上到下依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp)，C為水空白對照，1-6分別代表樣品經(jīng)過循環(huán)數(shù)為13、16、19、21、24、27的RT-PCR 結(jié)果。圖5為導(dǎo)入miRNA172靶標模擬序列后的煙草花器官表型。其中，左列為花的側(cè)視圖，右圖為花的俯視圖；從上到下三行圖中，前兩行分別來自實驗組中兩株不同的煙草植株，第三行來自對照組的煙草植株。圖6為導(dǎo)入miRNA172靶標模擬序列后煙草中miRNA172靶基因的RT-PCR電泳圖。其中，從上到下兩行圖的擴增的目的基因分別為NbAP2-like和actin;左列為對照組，右列為實驗組”為分子量標準(從上到下依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，C為水空白對照，1-6分別代表樣品經(jīng)過循環(huán)數(shù)為13、16、19、21、24、27的RT-PCR 結(jié)果。
具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、miRNA158靶標模擬序列重組表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用l、miRNA158靶標模擬序列重組表達載體(pTY102_MM158)的構(gòu)建(圖2)I)根據(jù)序列表序列2所示的miRNA158序列,化學合成編碼miRNA158靶標模擬序列的雙鏈DNA分子的兩條單鏈DNA(序列I和II所示，其中的大寫字母堿基代表添加的粘性末端序列，下劃線標記的堿基為添加的3個隨機堿基)序列I :5’ -CTAGAAAagctttgtcactaacatttggga-3 ,序列II :5，-AGCTtcccaaatgttagtgacaaagctTTT-3> ；2)將植物病毒表達載體pTY102 (其序列如序列表序列I所示,其T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所示)用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III進行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物，對該酶切產(chǎn)物進行DNA分離純化，獲得含有植物病毒表達載體PTY102的載體骨架片段的溶液；上述雙酶切的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下在50 μ I體系中含1-2 μ g植物病毒表達載體pTY102，2. 5 μ I Xba I (IOU/μ Ι,ΝΕΒ)和 2· 5μ I Hind III (IOU/μ 1，NEB)以及 5 μ I Buffer 2 (ΝΕΒ)，其余為 ddH20，37°C、2h至過夜酶切；上述酶切產(chǎn)物的DNA分離純化方法如下在上述50 μ I體系的酶切產(chǎn)物加入50 μ I苯酚氯仿混合液，劇烈震蕩2min，14000rpm離心lOmin，取上層水相，加入5 μ 13Μ醋酸鈉和125 μ I無水こ醇混勻后于_80°C浄置20min, 14000rpm離心IOmin,沉淀用200 μ I 70%こ醇懸浮，14000rpm離心IOmin,沉淀于室溫干燥后加入20 μ I去離子水溶解；3)取步驟I)合成的兩條單鏈DNA (10 μ Μ)各O. 25 μ I、步驟2)得到的含植物病毒表達載體ΡΤΥ102載體骨架片段的溶液4. 5 μ I和5 μ I快速連接mix (TAKARA)于16°C連接反應(yīng)lh，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有卡那霉素平板中篩選抗性單菌落，提取質(zhì)粒獲得重組表達載體PTY102-MM158，經(jīng)測序證實，該重組表達載體為在植物病毒表達載體 pTY102 的 Xba I 和 Hind III位點間插入了如下序列5’-agctttgtcactaacatttggga_3’。2、利用重組植物病毒載體(pTY102-MM158)抑制miRNA158I)重組根瘤農(nóng)桿菌菌液的制備
分別將pTRVl (長沙贏潤生物技術(shù)有限公司)、PTY102和步驟I得到的重組表達載體PTY102-MM158轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (Clontech)中，獲得含有pTRVl的重組根癌農(nóng)桿菌A，含有pTY102的重組根瘤農(nóng)桿菌B和含有pTY102-MM158的重組根瘤農(nóng)桿菌C，分別制備這三種重組根癌農(nóng)桿菌的菌液，0D600均在O. 5-1. O之間。2)侵染煙草設(shè)如下兩個處理(每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)4株煙草)處理I (實驗組):將步驟I)制備的菌液A和菌液C按I: I的體積比混合，5000rpm離心5分鐘，沉淀用注射緩沖液(IOmM MgCl2, IOmM MES, 200mMこ酰丁香酮)重懸，室溫放置4小時后，注射到發(fā)育到6葉期至7葉期本生煙草(玉溪中煙種子有限責任公司)第3或4片真葉上；處理2 (對照組)將菌液C換為菌液B，其它均與處理I相同；3周后觀察經(jīng)上述兩種處理的煙草的發(fā)育表型，結(jié)果如圖3所示；同時采集經(jīng)上述兩種處理的煙草葉片，用Trizol方法提取總RNA,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,以該 cDNA 為模板，對經(jīng) WMD3 (網(wǎng)址http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi)預(yù)測為 miRNA158 靶標基因的 BP525786 (GenBank:BP525786)和 DV159037(GenBank:DV159037)進行PCR擴增，以actin為內(nèi)參基因，將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示；上述擴增BP525786的引物序列如下，預(yù)測產(chǎn)物大小為312bp 5， -AAACGGCAGATTTCATACGG-3，，5， -GGTTCCGACGAGCAAATAGA-3，；上述擴增DV159037的引物序列如下，預(yù)測產(chǎn)物大小為392bp 5，-TTGGACAGCAGAAGATGCAC-3，，5’ -TCTCCCGTACGACAGGATTC-3’ ；上述擴增內(nèi)參基因actin的引物序列如下，預(yù)測產(chǎn)物大小為550bp 5，-CCATTGGTGCTGAGAGATTCC-3，，5， -GCAGCTTCCATTCCGATCA-3，。圖3的結(jié)果顯示，對照組煙草均發(fā)育正常，而實驗組煙草均出現(xiàn)植株矮化及葉片畸形等發(fā)育異常表型；圖4的結(jié)果顯示，實驗組miRNA158的靶標基因BP525786和DV159037的表達量均明顯高于對照組；這說明將重組表達載體PTY102-MM158導(dǎo)入煙草后，表達了miRNA158的靶標模擬序列，使煙草中miRNA158的表達量降低，最終導(dǎo)致miRNA158靶基因的
表達量升高。實施例2、miRNA172靶標模擬序列重組表達載體的構(gòu)建與應(yīng)用l、miRNA172靶標模擬序列重組表達載體(pTY102_MM172)的構(gòu)建(圖2)I)根據(jù)序列表序列3所示的miRNA172序列，化學合成編碼miRNA172靶標模擬序列的雙鏈DNA分子的兩條單鏈DNA(序列III和IV所示，其中的大寫字母堿基代表添加的粘性末端序列，下劃線標記的堿基為添加的3個隨機堿基) 序列III:5，-CTAGAAAatgcagcatcgagttcaagattct-3 ,序列IV:5，-AGCTagaatcttgaactcgatgctgcatTTT-3> ；2)將植物病毒表達載體pTY102 (其序列如序列表序列I所示,其T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所示)用限制性內(nèi)切酶Xba I和Hind III進行雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物，對該酶切產(chǎn)物進行DNA分離純化，獲得含有植物病毒表達載體PTY102的載體骨架片段的溶液；上述雙酶切的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實施例I相同；上述酶切產(chǎn)物的DNA分離純化方法與實施例I相同；3)取步驟I)合成的兩條單鏈DNA (10 μ M)各O. 25 μ I、步驟2)得到的含植物病毒表達載體ΡΤΥ102載體骨架片段的溶液4. 5 μ I和5 μ I快速連接mix (TAKARA)于16°C連接反應(yīng)lh，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，在含有卡那霉素平板中篩選抗性單菌落，提取質(zhì)粒獲得重組表達載體PTY102-MM172，經(jīng)測序證實，該重組表達載體為在植物病毒表達載體pTY102 的 Xba I 和 Hind III位點間插入了如下序列:5，-atgcagcatcgagttcaagattct-3，。2、利用重組植物病毒載體(pTY102-MM172)抑制miRNA172I)重組根癌農(nóng)桿菌菌液的制備分別將pTRVl、pTY102和步驟I得到的重組表達載體pTY102_MM172轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌GV3101 (Clontech公司)中，獲得含有pTRVl的重組根瘤農(nóng)桿菌A，含有pTY102的重組根癌農(nóng)桿菌B和含有ρΤΥ102-ΜΙΜ172的重組根癌農(nóng)桿菌D，分別制備這三種重組根癌農(nóng)桿菌的菌液，0D600均在O. 5-1. O之間。2)侵染煙草設(shè)如下兩個處理(每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)4株煙草)處理I (實驗組):將步驟I)制備的菌液A和菌液D按I: I的體積比混合，5000rpm離心5分鐘，沉淀用注射緩沖液(IOmM MgCl2, IOmM MES, 200mMこ酰丁香酮)重懸，室溫放置4小時后，注射到發(fā)育到6葉期至7葉期本生煙草(玉溪中煙種子有限責任公司)第3或4片真葉上；處理2 (對照組)將菌液D換為菌液B，其它均與處理I相同；3周后觀察經(jīng)上述兩種處理的煙草的發(fā)育表型，結(jié)果如圖5所示；同時采集經(jīng)上述兩種處理的煙草葉片，按照與實施例I相同的方法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以該cDNA 為模板，對經(jīng) WMD3 (網(wǎng)址http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi)預(yù)測為 miRNA172 靶標基因的 NbAP2_like (GenBank :CK287095)進行 PCR 擴增，以 actin 為內(nèi)參基因，將擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示；上述擴增NbAP2-like的引物序列如下，預(yù)測產(chǎn)物大小為440bp 5，-GCGGCCTGATCTGGTAATAG-3，，5， -AAGGATGGGGAGTTTCCAGT-3，；上述擴增內(nèi)參基因actin的引物序列如下，預(yù)測產(chǎn)物大小為IOOObp 5，-TGGCTTACATTGCTCTTGA-3，，5’ -TTCCTTGCTCATCCTATCAG-3’。圖5的結(jié)果顯示，對照組煙草發(fā)育正常，而實驗組煙草出現(xiàn)花發(fā)育異常表型；圖6的結(jié)果顯示，實驗組miRNA172的靶標基因NbAP2_like的表達量明顯高于對照組；這說明將重組表達載體PTY102-MM172導(dǎo)入煙草后，表達了 miRNA172的靶標模擬序列，使煙草中 miRNA172的表達量降低，最終導(dǎo)致miRNA172靶基因的表達量升高。
權(quán)利要求
1.構(gòu)建miRNA靶標模擬序列表達載體的方法，包括如下步驟 1)化學合成編碼所述miRNA靶標模擬序列的雙鏈DNA分子，所述雙鏈DNA分子的兩端均帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端或平末端； 2)將所述雙鏈DNA分子插入載體的所述限制性內(nèi)切酶位點間，得到表達所述miRNA靶標模擬序列的重組表達載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述miRNA為序列表序列2所示的miRNA158或序列表序列3所示的miRNA172。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述載體為植物病毒表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述植物病毒表達載體為序列表序列I所示的植物病毒表達載體PTY102。
5.ー種抑制植物miRNA表達量的方法，包括將使用權(quán)利要求3或4所述方法得到的重組表達載體導(dǎo)入所述植物中，使所述植物中所述miRNA靶基因的表達量升高。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于當所述植物病毒表達載體為所述植物病毒表達載體pTY102時,所述植物為煙草脆裂病毒的宿主植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述煙草脆裂病毒的宿主植物為煙草。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于當所述miRNA為miRNA158時，所述miRNA靶基因為BP525786和/或DV159037，當所述miRNA為miRNA172，所述miRNA靶基因為 NbAP2-like。
9.序列表序列I所示的植物病毒表達載體PTY102。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用植物病毒載體進行miRNA靶標模擬序列構(gòu)建和表達的方法。實驗證明，化學合成編碼miRNA158或miRNA172靶標模擬序列的DNA分子插入植物病毒表達載體pTY102得到的重組表達載體再導(dǎo)入煙草葉片中，3周后即可檢測到煙草的表型變化和miRNA靶標基因表達量的升高。本發(fā)明不需進行搭橋PCR，方法簡單；本發(fā)明利用了病毒所具有的表達量高、寄主范圍廣及在整株植物上擴散快速的特點，可快速和方便的降低植物內(nèi)源miRNA的表達水平，為研究植物內(nèi)源miRNA功能提供了一個新的途徑。
文檔編號C12N15/66GK102703500SQ20121017488
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者劉玉樂, 湯旸, 沙愛華 申請人:清華大學