專利名稱：基于pcr的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法和專用引物對及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種串聯(lián)重復(fù)序列的構(gòu)建方法，尤指一種用PCR快速構(gòu)建串聯(lián)重復(fù)序列的方法及該方法在酵母單雜交中啟動子核心重復(fù)序列構(gòu)建中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
真核生物中各種轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達調(diào)控的主要方式。典型的轉(zhuǎn)錄因子都有DNA結(jié)合區(qū)與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(或抑制區(qū))，在特定的時間、部位或特定條件(如脅迫條件)下，特定的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子的順式作用元件特異性結(jié)合并相互作用， 就可以激活或抑制靶基因的表達。要闡明細胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達的機制，以及細胞對外界環(huán)境刺激引起的一系列信號傳遞與應(yīng)答基因表達調(diào)控等機理，鑒定各種調(diào)控基因表達的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。酵母單雜交方法是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報道基因表達的原理來克隆或鑒定轉(zhuǎn)錄因子基因。而該酵母單雜交方法中，構(gòu)建酵母報道子是用酵母單雜交方法鑒定特定轉(zhuǎn)錄因子中的一個重要內(nèi)容。報道子的結(jié)構(gòu)是將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子Pmin上游，Pmin啟動子下游連接報道基因。進行CDNA 融合表達文庫篩選時，編碼目的轉(zhuǎn)錄因子的cDNA融合表達載體轉(zhuǎn)化進入酵母細胞后，其編碼產(chǎn)物(轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件結(jié)合，就可以激活Pmin啟動子，并促使報道基因表達。 一般來說，需要在最基本啟動子Pmin上游構(gòu)建3個以上按同一方向串聯(lián)連接的順式元件的重復(fù)序列。但是，現(xiàn)有構(gòu)建順式元件重復(fù)序列通常采用在順式作用元件的兩端加同一酶切位點，進行酶切后回收再用T4連接酶連接。由于順式作用元件通常較小(小于IOObp)，回收的效率低，同時連接時會出現(xiàn)正向連接和反向連接兩種情況，出現(xiàn)3個以上的重復(fù)片段的機率很小，只有約2 %左右，篩選和鑒定相當麻煩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法和專用引物對及應(yīng)用，具體地說，就是用PCR的方法快速，構(gòu)建一系列重復(fù)基因，用于酵母單雜交中啟動子核心重復(fù)序列的構(gòu)建，也可用于構(gòu)建快速重復(fù)系列表達相同的蛋白結(jié)構(gòu)域。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用技術(shù)方案是一種用于擴增低拷貝方向相同的順式作用元件的串聯(lián)重復(fù)序列的引物對，其特點是所述引物對是根據(jù)目的順式作用元件的序列來設(shè)計，正向引物取目的順式作用元件序列的前20bp;反向引物由兩部分組成，前半部分27個堿基取目的順式作用元件序列的前27bp的反向互補序列，后半部分23 個堿基取目的順式作用元件序列的最后23bp的反向互補序列?！N基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法，該方法是以按上述引物對的設(shè)計方法，根據(jù)目的順式作用元件設(shè)計的引物對，對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯(lián)重復(fù)序列。本發(fā)明還可以上述低拷貝串聯(lián)重復(fù)序列為模板，以根據(jù)目的順式作用元件設(shè)計的引物對對其進行PCR擴增，可得到方向相同的目的順式作用元件的高拷貝串聯(lián)重復(fù)序列。 該高拷貝串聯(lián)重復(fù)序列在高分子重復(fù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)中應(yīng)用極廣。上述目的順式作用元件是DRE順式作用元件。上述引物對為正向引物5> CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA < 3 ；反向引物5 > TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA < 3。

本發(fā)明還提供了上述引物對在構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)啟動子核心重復(fù)序列中的應(yīng)用。以及本發(fā)明構(gòu)建法在構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)啟動子核心重復(fù)序列中的應(yīng)用。本發(fā)明主要解決了現(xiàn)有技術(shù)中多拷貝DRE(3個以上)串聯(lián)的問題?，F(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建串聯(lián)DRE序列通常采用酶切和連接的方法，將同一序列用Hind III進行單酶切后，由于兩端的酶切位點相同，出現(xiàn)反接的概率達到50%，要想篩選到同向串聯(lián)4個以上相當困難。采用本發(fā)明，設(shè)計一對引物，采用PCR法，不依賴于酶切和連接，就可以獲得3個同向串聯(lián)的克隆18%以上，而且，由于引物設(shè)計的原因，不會出現(xiàn)反接的現(xiàn)象。該方法快速、高效、簡單， 并且可能同時獲得2X、3X、4X等一系列同向串聯(lián)順式作用元件的重復(fù)序列，沒有顛倒連接的現(xiàn)象，也沒有反復(fù)回收的麻煩，鑒定和篩選非常快捷方便。從而，大大簡化了實驗程序， 加快了實驗速度。此外，本發(fā)明還能獲得200個以上的同向串聯(lián)子，對于獲得高拷貝重復(fù)序列，高拷貝高分子重復(fù)蛋白質(zhì)也有極廣泛的用途。


圖1是用PCR法構(gòu)建DRE串聯(lián)子的原理圖。圖2是低拷貝DRE串聯(lián)子產(chǎn)物的電泳圖。其中，泳道2-5 分別為反應(yīng)5，15，25，35循環(huán)后的產(chǎn)物；M =IOObp ladder ；泳道1 陰性對照。圖3是串連子4XDRE的測序結(jié)果圖，顯示無酶切位點。圖4是高拷貝DRE串聯(lián)子產(chǎn)物的電泳圖。其中，泳道1 反應(yīng)20循環(huán)后的產(chǎn)物；泳道2 反應(yīng)10循環(huán)后的產(chǎn)物；泳道3、4 反應(yīng)30循環(huán)后的產(chǎn)物；泳道5、6 反應(yīng)40循環(huán)后的產(chǎn)物；M IOObp ladder。圖5是將4XDRE串聯(lián)子分別連接到pHISi和pLacZi上的酶切結(jié)果電泳圖。其中，M:200bp Lad ；泳道 1 :pHISi_4XDRE酶切電泳圖；泳道2 :pLacZi_4XDRE酶切電泳圖。圖6是將含4XDRE序列的pHISi和pLacZi分別轉(zhuǎn)化YM4271酵母的結(jié)果圖。其中，右上圖含pHISi_4XDRE的YM4271酵母在缺陷培養(yǎng)基(SD/_His)上的生長情況，左上圖陰性對照；右下圖含pLacZi-4XDRE的YM4271酵母利用β -半乳糖苷酶活性進行藍色顯性反應(yīng)，左下圖陰性對照。
具體實施例方式以下將對本發(fā)明作進一步地說明。rd29A基因是Yamaguchi-Shinozaki等從干旱處理的擬南芥中克隆而成，它不僅受干旱的誘導(dǎo)，也受高鹽及低溫的誘導(dǎo)。rd29A基因的表達在干旱高鹽及低溫脅迫下，受 DREB類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。其啟動子序列鑒定出了 71bpDRE順式作用元件(其序列見SEQ ID NO. 1)，這個順式作用元件中含有TACCGACAT核心序列。一、用PCR法構(gòu)建低拷貝同向串聯(lián)DRE重復(fù)序列材料含rd29A啟動子71bp DRE順式作用元件的pCAMBIA1301質(zhì)粒(中科院遺傳
與發(fā)育研究所陳受宜教授提供)。1、引物對的設(shè)計是根據(jù)29A啟動子71bp DRE順式作用元件序列，用 PrimerPremier 5. 0程序設(shè)計。正向引物取29A啟動子71bp序列前20bp。反向引物由兩部分組成，前半部分27個堿基取29A啟動子71bp序列前27bp的反向互補序列，這部分序列在進行第一輪反應(yīng)后，其互補序列可以成為長引物成為正向引物，參與下一輪PCR反應(yīng)生成2X或nXDRE序列；反向引物的后半部分23個堿基取29A啟動子71bp序列最后23bp 的反向互補序列，這23bp可以在任一輪PCR中作為反向引物，生成2 X或η X DRE序列。正向引物為5> CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA < 3，見 SEQ ID NO. 2 ；反向引物為5 > TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA <3，見 SEQ IDW). 3。其中反向引物又可作為中間引物，將相同的兩個rd29A啟動子序列同向連接在一起。擴增rd29A啟動子序列的上述引物對由美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen 公司)合成。2、用長引物PCR法獲得低拷貝DRE串聯(lián)子以上述引物對rd29A啟動子序列進行PCR擴增，以下試劑中的Taq酶、10 X Buffer 5、及dNTP購自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN公司)；50 μ 1反應(yīng)體系包括Taq酶0. 3微升(2. 5U/微升)，IOXBuffer 5微升， dNTP (2. 5mmol)2. 5μ l，pCAMBIA1301 質(zhì)粒 25ng，正向引物加 0. 25 μ 1，終濃度約為 0. 05 μ Μ, 反向引物加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ，雙蒸水補至所需體積。PCR 程序為① 94°C，預(yù)變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環(huán)數(shù)設(shè)5，15，25，35四個梯度)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環(huán))。該反應(yīng)體系中可能會發(fā)生的反應(yīng)有多步，如圖1所示。取擴增產(chǎn)物按常規(guī)技術(shù)進行電泳測定，電泳結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，前25個循環(huán)主要發(fā)生的是圖1的第II步反應(yīng)，35個循環(huán)就可明顯看出有3X和4XDRE和產(chǎn)生，說明當1 X、2XDRE較多時，就會發(fā)生第III、IV步以后的反應(yīng)。3、ηXDRE 的亞克隆切取上述擴增產(chǎn)物中的3Χ或4XDRE條帶，采用QIAGEN公司的MinEluteGel Extraction Kit試劑盒，按說明書進行回收，插入pGEM_T載體。插入pGEM-T載體的亞克隆步驟包括①準備選擇性培養(yǎng)基配500ml LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2. 5g，NaC15g, pH7. 0)，高壓滅菌，待冷至60°C左右加入氨芐(Amp)儲存液使終濃度為50mg/L，然后搖勻后倒平板；
②準備含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基X_gal儲液(20mg/ml)用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液，包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞，儲存于-20°C;IPTG 儲液(200mg/ml)在800 μ 1蒸餾水中溶解200mg IPTG后，用蒸餾水定容至lml，用0. 22 μ m 濾膜過濾除菌，分裝于印pendorf管并儲于_20°C ；在①步驟中制備好的含50mg/L Amp的 LB平板表面加40ml X-gal儲液和4 μ 1 IPTG儲液，用無菌玻棒將溶液涂勻，置于37°C下放置3-4小時，使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收，置于暗處備用；

③將PCR回收產(chǎn)物插入pGEM-T載體10μ 1反應(yīng)體系包括連接反應(yīng)緩沖液 2XBuffer(60mM Tris-HCl(pH 7.8),20mM MgC12,20mM DTT，2mM ATP, 10% polyethylene glycol (MW8000, ACS Grade) 5 μ 1、T4DNA 連接酶(T4DNAligase) 1 μ l、pGEM_T 載體 1μ 1、回收產(chǎn)物3μ 1，4°C連接16小時；④將連接產(chǎn)物加入T0P10感受態(tài)細胞(購自TIANGEN公司)中，輕輕混勻，立即置冰上30min ；將管置42°C恒溫水浴中熱激90s，然后迅速置于冰上l-2min ；加入800 μ 1預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37 °C預(yù)表達培養(yǎng)45-60min ；⑤將上一步培養(yǎng)基涂于加有Amp且含X_gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)12-16小時；⑥每個培養(yǎng)皿里能長出200個左右的白斑和幾個藍斑，篩選白斑進行一步實驗。4、陽性克隆的PCR檢測和測序驗證隨機挑選50個白斑，每個分別加入含有 50mg/L Amp的lml LB液體培養(yǎng)基搖菌12小時至液體混濁。以混濁菌液為模板用pGEM_T 載體的通用測序引物T7和SP6進行PCR檢測。引物 T7 5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，，SP6 :5， -ATTTAGGTGACACTATAG-3，； 50 μ IPCR 反應(yīng)體系包括 Taq 酶 0. 3 μ 1 (2. 5U/ 微升)，10 X Buffer 5 μ 1，新鮮混濁菌液1μ l，dNTP(2. 5mmol)2. 5μ 1，用T7和SP6引物作正反向引物(各加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ)，加雙蒸水至50 μ 1進行PCR檢測。PCR 程序為① 940C，預(yù)變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環(huán)數(shù)為30)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環(huán))。結(jié)果表明，50個菌中的2XDRE菌為26個，3XDRE為6個，4XDRE為3個。3個以上重復(fù)的達到18%以上。將獲得PCR驗證含有4XDRE的一個白斑進行進一步搖菌，用高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，DP107-02)提取質(zhì)粒，送Irwitrogen公司測序。測序結(jié)果見圖3所示，4個DRE序列連接準確，連接部位沒有酶切位點。4個ACCGAC 框沒有堿基突變。二、用長引物PCR法獲得高拷貝DRE串聯(lián)子所用PCR試劑及量、引物對同低拷貝DRE串聯(lián)子所用的相同，不同的是模板采用上一步提取的含4 X DRE質(zhì)粒約25ng。PCR 程序為① 940C，預(yù)變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1.5min(第②步到第④步循環(huán)數(shù)調(diào)整為10，20，30，40)；⑤72°C，延長7min(—個循環(huán))。取PCR擴增產(chǎn)物按常規(guī)技術(shù)進行電泳測定，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，20個循環(huán)后主要發(fā)生的是第V步反應(yīng)，20-30個循環(huán)內(nèi)，產(chǎn)物的拷貝數(shù)主要分布在500-1500bp之間。 30個循環(huán)以后nXDRE的長度遠遠超過了 1500bp，說明DRE的串聯(lián)拷貝數(shù)超過了 200個。 三、低拷貝同向串聯(lián)DRE重復(fù)序列在酵母單雜交中的應(yīng)用材料pHISi、pLacZi載體、YM4271酵母及DH5a感受態(tài)購自 MATCHMAKEROne-Hybrid System 試劑盒(Clontech，K1603-1)，T4DNA 連接酶和 Buffer 購自 Promega0l、pHISi_4XDRE 和 pLacZi_4XDRE 載體的構(gòu)建參照Clontech公司提供的用戶手冊，將獲得測序驗證的pGEM-T-4XDRE通過酶切和連接，將4XDRE序列分別連接到pHISi和pLacZi載體上。參照Clontech公司提供的用戶手冊，將獲得測序驗證的pGEM-T-4XDRE用T7 (帶 Xho I 酶切位點，由 Invitrogen 公司合成，5，-CCGCTCGAGCGGGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，，劃線部分為Xho I酶切位點)和SP6引物擴增4XDRE序列和pGEM-T載體上的多克隆位點50 μ 1 PCR 反應(yīng)體系包括 Taq 酶 0. 3 μ 1 (2. 5U/ 微升)，IOXBuffer 5 μ 1，含 4XDRE質(zhì)粒25ng，dNTP (2. 5mmol) 2. 5 μ 1，用Τ7引物(含Xho I酶切位點)和SP6引物作正反向引物(各加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ)，加雙蒸水至50 μ 1進行PCR檢測。PCR 程序為① 94°C，預(yù)變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環(huán)數(shù)為30)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環(huán))。用超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，DP203-02)回收純化擴增條帶用于下一步酶切連接實驗。(1)酶切一用Xho I和Sal I (TaKaRa)分別雙酶切帶兩位點的4XDRE序列PCR 擴增產(chǎn)物和PLacZi空載體，分別用TIANGEN膠回收試劑盒切膠回收。酶切體系如下(20 μ L)4 X DRE 或載體 pLacZi 約 1 μ gIOXHigh buffer2μ 1Xho I1 μ 1Sail1 μ 1_______________________________________________________加雙蒸水至20 μ 1 (Total)酶切二 用Sac I和Sac II (TaKaRa)分別雙酶切帶兩位點的4XDRE序列PCR擴增產(chǎn)物和PHISi空載體，分別用TIANGEN膠回收試劑盒切膠回收。酶切體系如下(20 μ L)4XDRE 或載體 pHISi約 1μg10XHigh buffer2μ 1Sac I1 μ 1Sac II1 μ 1_______________________________________________________加雙蒸水至20 μ 1 (Total)37°C放置2h，的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物分別切膠后，用試劑盒純化。(2)連接用T4DNA連接酶(Promega)進行連接反應(yīng)，目的基因片段與載體的摩爾數(shù)之比約為3 1。 反應(yīng)體系(10 μ L)，酶切一和酶切二的4XDRE序列分別與相應(yīng)的酶切載體進行連接4 °C連接過夜。(3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α :將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α (步驟參考用戶手冊，篩選抗生素用Amp)，步驟如下①準備選擇性培養(yǎng)基(含50mg/L Amp)配500ml LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2. 5g, NaCl 5g，pH7. 0)，高壓滅菌，待冷至60°C左右加入氨芐 (Amp)儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后倒平板；②將連接產(chǎn)物加入DH5 α感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，立即置冰上30min ；將管置 42°C恒溫水浴中熱激60s，然后迅速置于冰上Ι-aiiin ；加入800 μ 1預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基， 37 °C預(yù)表達培養(yǎng)45-60min ；③將上一步培養(yǎng)基涂于含有50mg/L Amp的篩選培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)12-16小時，用PCR篩選陽性重組子；對陽性重組子用堿裂解法提取質(zhì)粒，進一步做雙酶切鑒定， 的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。各挑選一個陽性克隆菌，進一步搖菌，并提取質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。結(jié)果經(jīng)雙酶切驗證，4XDRE序列分別連接到pHISi和pLacZi載體上，參見圖5。2、酵母單雜交試驗將含4 X DRE序列的pHISi和pLacZi分別轉(zhuǎn)化YM4271酵母，參照Clontech公司提供的用戶手冊進行酵母單雜交試驗。(1)酵母YM4271感受態(tài)細胞的制備挑單菌落接種于IOml YPD液體培養(yǎng)基(配方1 % Yeast Extract (酵母膏),2% Peptone (蛋白胨)，2% Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉)中，30°C，250rpm培養(yǎng)過夜；測定過夜培養(yǎng)物的 0D600值為3. 0 5. 0之間；將IOml YPD過夜培養(yǎng)物稀釋至0D600值為0. 2 0. 4 ；在28 30°C搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3 6hr，使其0D600值達到0. 6 1. 0 ；于室溫1500g離心Siiin收集酵母細胞，棄上清；用IOml洗液洗酵母細胞，隨后于室溫1500g離心5min離心收集細胞，棄上清；用Iml TE/LiAc重懸酵母細胞，以每管50 μ 1分裝。(2)重組質(zhì)粒DNA對酵母ΥΜ4271的轉(zhuǎn)化將感受態(tài)細胞離心，棄去上清，然后依次加入240ul50% PEG4000、36ul lMlicl、及50ul用水溶解的質(zhì)粒DNA5_10ug(上一步提取的陽性克隆質(zhì)粒)，劇烈震蕩，混勻；30°C溫育30分鐘，平穩(wěn)放置；42°C熱激20-25分鐘； 6000-8000rpm離心，棄去上清；用Iml滅加水輕輕重懸；(3)含pHISi_4XDRE重組質(zhì)粒酵母YM4271的篩選參照Clontech公司提供的用戶手冊，將質(zhì)粒pHISi-4XDRE轉(zhuǎn)化至酵母菌株YM4271的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/_His營養(yǎng)缺酶切回收4 X DRE序列載體雙酶切回收片段(pHISi或pLacZi)2XT4 DNA Ligase BufferT4 DNA Ligase_
約 50ng 約 300ng 5 μ 1 0. 5μ 1 加雙蒸水至
10 μ 1 (Total)
8陷型培養(yǎng)基上來篩選陽性克隆，利用3-AT競爭性實驗對YM4271(pHISi-4XDRE)進行本底表達活性檢測，預(yù)期結(jié)果為，在SD/-His培養(yǎng)皿上，陽性酵母生長良好。(4)含pLacZi-4XDRE重組質(zhì)粒酵母YM4271的篩選參照Clontech公司提供的用戶手冊，將質(zhì)粒pLacZi-4XDRE轉(zhuǎn)化至酵母菌株YM4271的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/_Ufa培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4天，篩選陽性菌株。利用β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)對YM4271(pLacZi-DRE4) 菌株進行本底表達活性檢測，預(yù)期結(jié)果應(yīng)為，含有pLacZi-4XDRE質(zhì)粒的酵母過夜后變成藍色，由此可以說明LacZ基因表達，可用于酵母單雜交系統(tǒng)的篩選。結(jié)果表明，參見圖6，4XDRE序列能與酵母的激活蛋白結(jié)合，啟動下游HIS3和LacZ 基因表達，而不含4 X DRE序列的酵母不能啟動HIS3和LacZ基因表達。該酵母表達系統(tǒng)可用于酵母單雜交鑒定DRE綁定蛋白的功能。因此，本發(fā)明用PCR方法構(gòu)建重復(fù)序列可用于同一序列快速串聯(lián)，沒有顛倒現(xiàn)象， 特別用于酵母表達系統(tǒng)順式串聯(lián)子的構(gòu)建是成功的。
權(quán)利要求
1.一種用于擴增低拷貝方向相同的順式作用元件的串聯(lián)重復(fù)序列的引物對，其特征在于所述引物對是根據(jù)目的順式作用元件的序列來設(shè)計，正向引物取目的順式作用元件序列的前20bp ；反向引物由兩部分組成，前半部分27個堿基取目的順式作用元件序列的前 27bp的反向互補序列，后半部分23個堿基取目的順式作用元件序列的最后23bp的反向互補序列。
2.一種基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法，其特征在于該方法是以權(quán)利要求1所述的根據(jù)目的順式作用元件設(shè)計的引物對對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯(lián)重復(fù)序列。
3.如權(quán)利要求2所述的基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法，其特征在于以權(quán)利要求1所述的根據(jù)目的順式作用元件設(shè)計的引物對對低拷貝串聯(lián)重復(fù)序列進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的高拷貝串聯(lián)重復(fù)序列。
4.如權(quán)利要求2或3所述的基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法，其特征在于所述目的順式作用元件是DRE順式作用元件。
5.如權(quán)利要求4所述的基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法，其特征在于所述引物對為正向引物5 > CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA < 3 ；反向引物5 > TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA < 3。
6.權(quán)利要求1所述的引物對在構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)啟動子核心重復(fù)序列中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求2所述的基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法在構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)啟動子核心重復(fù)序列中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求3所述的基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法在高分子重復(fù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
一種基于PCR的串聯(lián)重復(fù)序列快速構(gòu)建法和專用引物對及應(yīng)用，該方法是以根據(jù)目的順式作用元件設(shè)計的引物對對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯(lián)重復(fù)序列，該方法僅用一個PCR快速構(gòu)建3個以上同向串聯(lián)子，陽性克隆率達到18％，用兩個PCR和一個亞克隆，可以獲得200個同向串聯(lián)子。低拷貝串聯(lián)子在酵母雜交中用于重復(fù)順式元件的構(gòu)建快速有效，而獲得的高拷貝串聯(lián)在高分子重復(fù)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)具有極廣泛的用途。
文檔編號C12N15/113GK102154269SQ20111000164
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者熊興耀, 鄧子牛, 陳己任 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)