專利名稱：蛋白Com1在對貝氏柯克斯體的免疫保護中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白Coml在對貝氏柯克斯體的免疫保護中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)為專性吞噬細胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小桿菌。 該菌對外界環(huán)境抵抗力很強，對人和動物有極強的感染力，可通過氣溶膠擴散經(jīng)呼吸道進 入體內(nèi)導(dǎo)致人及動物發(fā)生感染并導(dǎo)致Q熱。Q熱是一種呈世界性分布的人獸共患病，在我國分布廣泛。人類Q熱臨床表現(xiàn)多 樣。急性Q熱表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等；慢性Q熱表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎、 肉芽腫性肝炎、骨髓炎等。近年來Q熱性腦膜炎、腎小球腎炎、孕婦流產(chǎn)等亦有報道。雖然 抗生素治療對Q熱有效，但由于Q熱能以氣溶膠的形式傳播，一旦流行難以控制。另外慢性 Q熱需要較長的療程(可長達12個月)，且易復(fù)發(fā)。因此采用有效的疫苗作預(yù)防接種是防 止Q熱發(fā)生和流行的最有效手段。在過去幾十年中，Q熱疫苗的研制主要集中在滅活疫苗和化學(xué)提取的亞單位疫苗 上。滅活疫苗和化學(xué)提取的亞單位疫苗均需要雞胚大量繁殖貝氏柯克斯體進行制備，但是 雞胚繁殖量低，提取純化貝氏柯克斯體的防護要求高，工藝復(fù)雜，成本昂貴，因此難以大量 制備和推廣使用。隨著對不同組織來源樹突狀細胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)DCs主要分為髓系 DCs和淋巴系DC樹突狀細胞兩大類。前者與單核細胞、粒細胞有共同的祖細胞，而后者與T 細胞、B細胞有共同的前體細胞。研究者在人胎肝、臍血、骨髓、脾臟、人外周血以及小鼠的 骨髓和外周血中分離出髓系前體，在體外合適的培養(yǎng)條件及刺激因素下獲得了具有典型形 態(tài)、表型及功能的樹突狀細胞。髓系樹突狀細胞的分化發(fā)育分為4個階段前體階段、未成 熟期、遷移期和成熟期。正常情況下絕大多數(shù)體內(nèi)髓系樹突狀細胞(主要位于非淋巴組織) 處于非成熟狀態(tài)，未成熟的樹突狀細胞表達低水平的協(xié)同刺激分子和粘附分子，體外激發(fā) 混合淋巴細胞反應(yīng)(mixed lympho2cyte reaction, MLR)的能力較弱，但具有極強的攝取 和加工處理抗原的能力。在外源性抗原、炎癥刺激因素等共同影響下，它們能從非淋巴組織 進入次級淋巴組織并逐漸成熟。在遷移過程中存在遷移期樹突狀細胞，這類樹突狀細胞主 要存在于輸入淋巴管、外周血、肝臟血液及淋巴組織，經(jīng)過淋巴和血液循環(huán)，從輸入淋巴管 進入淋巴結(jié)。進人次級淋巴組織后，在適當(dāng)?shù)拇碳ひ蛩叵?，樹突狀細胞逐漸成熟。成熟的樹 突狀細胞表達高水平MHC-I、MHC-II類分子、協(xié)同刺激分子(⑶80、⑶86)、粘附分子(C040、 CD44、CM4)、整合素及特征性標(biāo)記(CDla、CDllc、CD83)等，并能分泌 IL-12、IL-U IL-6、 IL-8、TNF- α等細胞因子，能分泌Thl型細胞因子，因而它們能有效地將抗原提呈給初始T 細胞并使之激活，促進細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)有研究中一般按照如下方法體外培養(yǎng)獲得未成熟期的髓系樹突狀細胞從小鼠 股骨骨髓分離出骨髓細胞，用RPMI1640全培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓細胞，培養(yǎng)7天，得到未成熟期的 樹突狀細胞。
RPMI 1640全培養(yǎng)基按照如下方法制備將小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子 GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基混合，小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子 GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基的配比為10mg小牛血清100 μ g鏈霉 素100U青霉素20ng GM-CSF 10ngIL-4 ImlRPMI 1640細胞培養(yǎng)基，得到的混合物 即為RPMI1640全培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供SEQ ID NO :1所示蛋白的新用途。本發(fā)明所提供的新用途為SEQ ID NO :1所示蛋白在制備Q熱疫苗中的應(yīng)用或 SEQID NO 1所示蛋白在制備針對Q熱的保護性抗原中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述Q熱是由貝氏柯克斯體弓丨起的。實際應(yīng)用中，SEQ ID NO :1所示蛋白可以與佐劑混合，制成Q熱疫苗，還可用SEQ ID NO :1所示蛋刺激白抗原呈遞細胞(樹突狀細胞)，將刺激后的樹突狀細胞作為Q熱疫
田ο本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備針對Q熱的保護性抗原的方法。本發(fā)明所提供的制備針對Q熱的保護性抗原的方法，包括如下步驟用SEQ ID NO :1所示蛋白刺激離體的未成熟期的樹突狀細胞，刺激后的樹突狀細胞即為針對Q熱的保 護性抗原。上述方法中，所述刺激的方法包括如下步驟將所述SEQ ID NO 1所示蛋白、所述 樹突狀細胞和用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細胞培養(yǎng)基共同孵育。上述任一所述方法中，所述樹突狀細胞與所述SEQ ID NO :1所示蛋白的配比為 5 X IO5 個10ug。上述任一所述方法中，所述共同孵育的時間為Mh。上述任一所述方法中，所述共同孵育在溫度為37°C、二氧化碳體積濃度為5%的 條件下進行。上述任一所述方法中，所述用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細胞培養(yǎng)基按照如下方法制 備將小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基 混合，小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基 的配比為10mg小牛血清IOOyg鏈霉素100U青霉素20ng細胞因子GM-CSF IOng 細胞因子IL-4 Iml RPMI1640細胞培養(yǎng)基，得到的混合物即為用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細 胞培養(yǎng)基。上述任一所述方法中，所述Q熱是由貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)引起的。由上述任一所述方法得到的針對Q熱的保護性抗原也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種制備Q熱疫苗的方法。本發(fā)明所提供的制備Q熱疫苗的方法，包括如下步驟將SEQ ID NO :1所示蛋白與 佐劑混合，得到Q熱疫苗。由上述方法得到的Q熱疫苗也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明證明貝氏柯克斯體重組膜蛋白Coml可以作為一種抗原蛋白，能夠刺激機 體產(chǎn)生免疫應(yīng)答對抗貝氏柯克斯體毒株攻擊，為具有Q熱疫苗功能的保護性抗原。通過基因工程方法制備蛋白Coml，操作簡便，成本低，產(chǎn)量高。用蛋白Coml作為Q熱疫苗，克服了 現(xiàn)有技術(shù)中疫苗制備困難的缺陷。本發(fā)明屬于艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項中內(nèi)容，項目名 稱傳染病病原體診斷和組合檢測技術(shù)研究；課題編號2008ZX10004-002。本發(fā)明對國家利 益或公共利益具有重大意義，迫切需要采取專利方式予以保護。


圖1為蛋白電泳檢測。圖2為蛋白抗原Coml的免疫保護效果評價(實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠體 內(nèi)貝氏柯克斯體拷貝數(shù)。圖3為檢測刺激后的樹突狀細胞的分子表達。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。貝氏柯克斯體新橋株(Coxiella burnetii)Xinqiao strain 在文獻"Wen，B.， S. Yu, G. Yu, Q. Li, and X. Zhang. 1991. Analysis of proteins andlipopoIysaccharides from Chinese isolates of Coxiella burnetii with monoclonalantibodies. Acta Virol 35 :538-544. ”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲 得。實施例1、抗原蛋白Coml的制備載體pET_32a(+)購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為69015。pQE30購自qiagen公 司，產(chǎn)品目錄號為33203。大腸桿菌BL21購自Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為69450。大腸桿菌M15購自 Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為；34210。蛋白Coml的編碼基因制備以貝氏柯克斯體新橋株(Coxiella burnetii)的基因 組DNA為模板，用引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶BamHI和McI 酶切PCR擴增產(chǎn)物，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶BamHI和McI酶切載體pQE30，回 收載體大片段；將目的基因片段和載體大片段連接，得到重組載體；PCR擴增的條件94°C 預(yù)變性 5min,95°C 30sec、55°C 30sec、72°C 1. 5min，循環(huán) 35 次，72°C延伸 7min。5， CGGGATCCGTGAAGAACCGTTTGACTGCA 3， (BamHI)；5， CCGAGCTCTTTTTGAAGGTTTTGTTGTGA 3， (SacI)重組菌的制備將重組載體轉(zhuǎn)入出發(fā)菌大腸桿菌M15中，得到重組菌。驗證將重 組菌接入含有安芐(Amp+)和卡那(Kan+)雙抗性的固體LB平板培養(yǎng)基中，抗性篩選，挑取單 性克??；將單克隆接入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行測序，結(jié)果在載體pQE30的 BamHI和McI酶切位點間插入的基因序列如SEQ ID NO 2所示，表明構(gòu)建的載體正確。該 基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO :1所示，將該蛋白記作Coml。蛋白表達將陽性重組菌接入安芐(Amp+)和卡那(Kan+)雙抗性的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C震搖過夜，次日按1 100接種新鮮安芐(Amp+)和卡那(Kan+)雙抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C震搖至OD6tltl = 0. 4，加入誘導(dǎo)劑IPTG，濃度為0. 4mM，于37°C繼續(xù)震搖4小時，得 到發(fā)酵液。蛋白純化取誘導(dǎo)表達的發(fā)酵液100ml，8000rpm/min離心5min，集菌，棄上清。用 30ml裂解緩沖液重懸菌體，以25%振幅超聲破碎(超3s，停9s) 1小時。取出超聲裂解物， 以12000rpm離心20min，棄掉沉淀，收集上清液。向上清液中加入IOml回收緩沖液后混勻， Ih后以12000rpm離心20min，棄掉沉淀，收集上清液。將上清液與^il Ni-NTA混合，室溫 200rpm振蕩混勻4h，使目的蛋白與Ni-NTA完全結(jié)合。吸掉上清，依次加入含6M OM(6M、 5M、4M、3M、2M、1M、0M)尿素的復(fù)性緩沖液逐級復(fù)性；每次加入復(fù)性緩沖液后混勻，室溫靜置 作用4h。待加入含OM尿素的復(fù)性緩沖液作用4h后，倒入純化空柱中，加入IOml洗滌緩沖 液洗滌，并控制流速為3ml/min。待液體流凈，加入洗脫緩沖液，共洗脫4次，每次0. 5ml，將 每次收集的洗脫液合并，即得到目的蛋白溶液。每1升裂解緩沖液按照如下方法制備將50mmol NaH2PO4 · H2O、300mmol NaCl、 IOmmol咪唑和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到裂解緩沖液。0. lmol/L Tris-Cl 緩沖液配制將 12. llgTris、800mL ddH20 禾口 49mL HCl 混合，滴 加濃鹽酸調(diào)PH至8. 0，用ddH20定溶至IOOOmL,得到0. lmol/L Tris-Cl緩沖液。每1升回收緩沖液按照如下方法制備將IOOmmol NaH2PO4 ·Η20、0. IL Tris-Cl緩 沖液(即IOmmol Tris)、8mol尿素和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到 回收緩沖液。復(fù)性緩沖液制備每1升含6M尿素復(fù)性緩沖液按照如下方法制備將500mmol NaCl,0. 2L Tris-Cl 緩沖液、6mol尿素、0. 2L甘油和水混合，調(diào)節(jié)pH至7. 4，用水定容至1升，得到含6M尿素復(fù) 性緩沖液。每1升無尿素復(fù)性緩沖液按照如下方法制備將500mmOl NaCl,0. 2L Tris-Cl緩 沖液、0. 2L甘油和水混合，調(diào)節(jié)pH至7. 4，用水定容至1升，得到無尿素復(fù)性緩沖液。5M-1M尿素復(fù)性緩沖液由6M尿素復(fù)性緩沖液和無尿素復(fù)性緩沖液不同體積配比 得到。每1 升洗滌緩沖液組成將 50mmol NaH2PO4 'H2O^OOmmol NaCl、20mmol 咪唑和水 混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗滌緩沖液。每1 升洗脫緩沖液組成將 50mmol NaH2PO4 · H20、300mmol NaCl、250mmol 咪唑、 0. 3L甘油和水混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，用水定容至1L，得到洗脫緩沖液。每1升LB液體培養(yǎng)基組成將IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化鈉和水混 合，用水定容至1L，得到LB液體培養(yǎng)基。將得到的蛋白溶液進行電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。Coml蛋白的分子量大小為 27KD，與預(yù)期一致。同時以轉(zhuǎn)入空載體pQE30的M15作為對照重組菌。發(fā)酵該對照重組菌沒有得到任 何蛋白。同時以轉(zhuǎn)入空載體pET_32a(+)的BL21(DE3)作為對照重組菌。發(fā)酵該對照重組 菌得到的蛋白為載體pET-32a(+)上的標(biāo)簽蛋白TrxA，其大小為17KD。表明制備的蛋白正確。
實施例2、抗原蛋白Coml的應(yīng)用一、制備針對Q熱的保護性抗原1、未成熟期的樹突狀細胞的制備BALB/c小鼠購自購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。從BALB/c小鼠股骨骨髓分離出骨髓細胞取BALB/c小鼠股骨，用眼科剪剪掉兩側(cè) 股骨頭，將吸滿ImlPBS緩沖液的注射器針頭插入骨腔中，并緩慢推動注射器沖洗，從骨腔 中沖洗出單一骨髓細胞懸液。用RPMI1640全培養(yǎng)基調(diào)整骨髓細胞數(shù)至IX 106/ml，并轉(zhuǎn)入六孔培養(yǎng)板 (9. 6X6cm2)，在溫度為37°C、二氧化碳體積濃度為5%的條件下培養(yǎng)，于培養(yǎng)第3，5天每孔 分別更換:3mlRPMI1640全培養(yǎng)基，如此培養(yǎng)7天，得到未成熟期的樹突狀細胞。RPMI 1640全培養(yǎng)基按照如下方法制備將小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子 GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基混合，小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子 GM-CSF、細胞因子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基的配比為10mg小牛血清100 μ g鏈霉 素100U青霉素20ng GM-CSF 10ngIL-4 lmlRPMI1640細胞培養(yǎng)基，得到的混合物 即為RPMI1640全培養(yǎng)基。RPMI1640細胞培養(yǎng)基購自Hyclone，產(chǎn)品目錄號為SH30809. 01。小牛血清購自 Hyclone，產(chǎn)品目錄號為SH30087. 02。鏈霉素購自Sigma，產(chǎn)品目錄號為3810_74_0。青霉素 購自Sigma，產(chǎn)品目錄號為69-52-3。細胞因子GM-CSF購自P印rol^ech公司，產(chǎn)品目錄號為 315-03-20。細胞因子IL-4購自P印rol^ech公司，產(chǎn)品目錄號為214-14-20。2、用抗原蛋白Coml刺激未成熟期的樹突狀細胞將5X IO5個未成熟期的樹突狀細胞用RPMI1640全培養(yǎng)基按照每孔Iml接種于六 孔板，分別于不同孔內(nèi)加入IOug的ComlUOug TrxA、2ug大腸桿菌脂多糖LPS、25ul蛋白洗 脫緩沖液，同時設(shè)置未加任何物質(zhì)的細胞培養(yǎng)孔，將其置37°C、5% CO2孵育Mh，得到刺激 后的樹突狀細胞。將接受不同抗原刺激M小時后的樹突狀細胞按5X 106cellS/ml重懸于 PBS緩沖液，得到細胞懸液，用此細胞懸液進行接種。每1升磷酸鹽緩沖液(PBS)按照如下方法制備將8gNaCl、0. 2g KCl、 3. 53gNa2HP04. 12H20、0. 24g KH2PO4 和水混合，用水定容至 1 升。大腸桿菌脂多糖LPS購自Sigma，產(chǎn)品目錄號為L2880。3、檢測刺激后的樹突狀細胞的分子表達情況將刺激后的樹突狀細胞分別用不同標(biāo)記的單抗染色FITC-抗⑶11c，PE-抗 CDllb, PE/Cy5-抗 CD40、CD80、CD86 及 MHC-II，包括同型對照 FITC-Hamster IgG, PE-Rat IgG2b, PE/Cy5-Rat IgG2a, Hamster IgG及IgG2b。染色前加入Fc受體阻斷劑孵育。染色 后細胞經(jīng)FACScalibur流式細胞儀分析，樹突狀細胞至少收集10000個。最后用CellQuest 軟件分析數(shù)據(jù)。Mock表示未接受任何抗原刺激的樹突狀細胞，ElutionbufTer表示接受蛋 白洗脫緩沖液刺激的樹突狀細胞。FITC-標(biāo)記的抗 CDllc (N418) BioLegend 公司 117305FITC-標(biāo)記的 Hamster IgG BioLegend 公司 402006PE-標(biāo)記的抗 CDllb(Ml/70) BioLegend 公司 101207PE-標(biāo)記的 Rat IgG2bBioLegend 公司 40060權(quán)利要求
1.SEQ ID NO :1所示蛋白在制備Q熱疫苗中的應(yīng)用或SEQ ID NO :1所示蛋白在制備針 對Q熱的保護性抗原中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述Q熱是由貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)引起的。
3.一種制備針對Q熱的保護性抗原的方法，包括如下步驟用SEQ ID NO :1所示蛋白 刺激離體的未成熟期的樹突狀細胞，刺激后的樹突狀細胞即為針對Q熱的保護性抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述刺激的方法包括如下步驟將所述 SEQ ID NO :1所示蛋白、所述樹突狀細胞和用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細胞培養(yǎng)基共同孵育。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述樹突狀細胞與所述SEQIDNO=I 所示蛋白的配比為5X IO5個IOug;和/或所述共同孵育的時間為Mh。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述共同孵育在溫度為37°C、二 氧化碳體積濃度為5%的條件下進行。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述用于培養(yǎng)樹突狀細胞的 細胞培養(yǎng)基按照如下方法制備將小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子GM-CSF、細胞因子 IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基混合，小牛血清、鏈霉素、青霉素、細胞因子GM-CSF、細胞因 子IL-4和RPMI1640細胞培養(yǎng)基的配比為10mg小牛血清IOOyg鏈霉素100U青霉 素20ng細胞因子GM-CSF IOng細胞因子IL-4 Iml RPMI1640細胞培養(yǎng)基，得到的混 合物即為用于培養(yǎng)樹突狀細胞的細胞培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述Q熱是由貝氏柯克斯體 (Coxiella burnetii)弓丨起的。
9.一種制備Q熱疫苗的方法，包括如下步驟將SEQ ID NO :1所示蛋白與佐劑混合，得 到Q熱疫苗。
10.由權(quán)利要求3-8中任一所述方法得到的針對Q熱的保護性抗原；由權(quán)利要求9所 述方法得到的Q熱疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了蛋白Com1在對貝氏柯克斯體的免疫保護中的應(yīng)用。該應(yīng)用為SEQ IDNO1所示蛋白在制備Q熱疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明證明貝氏柯克斯體重組膜蛋白Com1可以作為一種抗原蛋白，能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答對抗貝氏柯克斯體毒株攻擊，為具有Q熱疫苗功能的保護性抗原。通過基因工程方法制備蛋白Com1，操作簡便，成本低，產(chǎn)量高。用蛋白Com1作為Q熱疫苗，克服了現(xiàn)有技術(shù)中疫苗制備困難的缺陷。
文檔編號C12N5/0784GK102139101SQ20111000142
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者溫博海, 熊小路, 王錫樂 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所