專利名稱：一種產(chǎn)堿假單胞菌及其制備l-薄荷醇的方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)堿假單胞菌(^PsGudomoims alcaligenes)以及制備1_薄荷醇 (即(-)_薄荷醇，化學(xué)名為(1民25，51 )-2-異丙基-5-甲基環(huán)己醇)的方法。
背景技術(shù)：
天然薄荷醇主要為1-薄荷醇，薄荷醇具有特征的薄荷香氣和強(qiáng)烈的清涼作用， 氣味更加新鮮輕快；薄荷醇具有更強(qiáng)的生理活性，它具有殺菌止癢、興奮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、防腐殺菌、治療疼痛等功效，因此具有更大的醫(yī)療價值。薄荷醇的這些性質(zhì)，使它比其他構(gòu)型的薄荷醇具有更高的工業(yè)價值。由于人們對于生活質(zhì)量的日益關(guān)注，對廠薄荷醇的需求量也日益增長。但是，天然提取的1-薄荷醇過度依賴人工栽培的薄荷植物，受地域、氣候的影響，越來越難以滿足生產(chǎn)與生活的需要。人們通過合成的手段制備薄荷醇來滿足需求，由于化學(xué)法制備的產(chǎn)品是由薄荷醇的8種異構(gòu)體組成的，分別為廠薄荷醇((1R，2S, 5R)-2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、7-異薄荷醇((1R，2S, 5S)-2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、1~新異薄荷醇 ((IS, 2S, 5S) -2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、1-新薄荷醇((1R, 2R, 5S) -2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、薄荷醇((1S，2R，5S) -2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、異薄荷醇 ((IS, 2R, 5R) -2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、d_新異薄荷醇((1R, 2R, 5R) -2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)、 /_新薄荷醇((lS，2S，5R)-2-異丙基-5-甲基-環(huán)己醇)。其中廠薄荷醇的含量較低，嚴(yán)重影響使用效果，從8種薄荷醇異構(gòu)體的混合物中分離出的1-薄荷醇產(chǎn)品， 價格低廉比天然來源的低，各項品質(zhì)相當(dāng)，因此工業(yè)化過程的一個主要環(huán)節(jié)就是分離I-薄荷醇?；瘜W(xué)制備技術(shù)、生物制備技術(shù)與天然原料提取技術(shù)，是目前制備I-薄荷醇研究的3個主要方面?；瘜W(xué)制備技術(shù)目前在工業(yè)上應(yīng)用的，主要是日本高砂公司利用發(fā)明的手性催化劑(S)-BINAP-Rh催化烯丙胺不對稱異構(gòu)化合成得到1-薄荷醇，該技術(shù)目前年產(chǎn)1000噸廠薄荷醇。從天然植物來源提取工藝是將薄荷草經(jīng)蒸氣蒸餾制得薄荷原油。 經(jīng)反復(fù)結(jié)晶得到I-薄荷醇，過程復(fù)雜，能耗高，生產(chǎn)率低。生物催化法制備I-薄荷醇的研究中，主要涉及到兩種拆分反應(yīng)，一種是利用微生物或酶催化的酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，另一種是利用微生物或酶催化的水解反應(yīng)。楊立榮等開發(fā)了一種利用蘇云金芽孢桿菌立體選擇性水解薄荷醇異構(gòu)體酯化的混合物的方法，以制備7-薄荷醇，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到74%， 選擇性d. e. =90. 1%(楊立榮，孟彥.一種蘇云金芽孢桿菌以及L-薄荷醇的制備方法 CN101671639A [P] 2009. 8. 13)。利用不對稱水解制備薄荷醇的方法中，由于薄荷醇與薄荷醇異構(gòu)體酯化的混合物極性差別不大，分離過程需要通過硅膠柱層析等繁瑣昂貴的過程(許建和，鄭高偉。枯草芽孢桿菌酯酶及其用于生產(chǎn)7-薄荷醇的應(yīng)用CN 101338287A [P] 2008. 7. 25)
上述的生物方法分離薄荷醇的研究雖然取得了一些進(jìn)展，但普遍存在產(chǎn)物的光學(xué)純度不高，轉(zhuǎn)化率低、生物催化劑種類少和生物催化劑成本高等缺點，并且分離純化過程不易實現(xiàn)，制約了工業(yè)化的應(yīng)用。如果利用高選擇性的微生物催化劑，則可大大降低原料成本，提高產(chǎn)品純度，目前尚未見有關(guān)于利用產(chǎn)堿假單胞菌(/^Wi/OMWM alcaligenes)對m 荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物進(jìn)行拆分的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)堿假單胞菌及其制備I-薄荷醇的方法和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人首次分離純化到一株能夠產(chǎn)選擇性轉(zhuǎn)酯化I-薄荷醇酯化物的新菌株。經(jīng)過16S rDNA和生理生化鑒定，該菌株為產(chǎn)堿假單胞菌屬(/^洲而^^浙 a/ca/i^^M)，命名為產(chǎn)堿假單胞菌 LMg^/^ei/t/offloaas alcaligenes LM99)。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為2010年12月3日，保藏號為CGMCC No. 4405。產(chǎn)堿假單胞菌CGMCC No. 4405可用于作為通過分離薄荷醇異構(gòu)體酯化的混合物來制備薄荷醇的催化劑。利用產(chǎn)堿假單胞菌CGMCC No. 4405制備1_薄荷醇的方法包括如下步驟
(1)將保藏號為CGMCCNo. 4405的產(chǎn)堿假單胞菌加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
(2)按以下第一方案、第二方案或第三方案對薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物進(jìn)行催化， 得到反應(yīng)液，所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物含有薄荷醇酯化物，且含有異薄荷醇酯化物、新異薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物、薄荷醇酯化物、異薄荷醇酯化物、 d-新異薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物中的任一種或任幾種
第一方案將所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物加入到步驟(1)得到的發(fā)酵液中，反應(yīng)后得到反應(yīng)液；
第二方案將步驟(1)得到的發(fā)酵液離心得到上清液，將所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物加入所述上清液中，反應(yīng)后得到反應(yīng)液；
方案B第三方案將步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行脫水處理得到發(fā)酵液的固體制劑，后將該發(fā)酵液的固體制劑與薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物一起加入到ρΗ為5 10的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)液；
(3)將所述反應(yīng)液進(jìn)行分離得到1-薄荷醇。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(2)中，所述的薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物是指薄荷醇異構(gòu)體混合物中的各薄荷醇異構(gòu)體與脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(2)的第三方案中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷_鹽酸緩沖液；所述發(fā)酵液的固體制劑相對于緩沖溶液的質(zhì)量濃度為Ig/廣100g/L。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的成分為酪蛋白廣IOg/ L、吐溫-80廣15g/L、酵母膏廣8g/L、硫酸銨(TlOg/L、磷酸氫二鉀廣6g/L、氯化鈣0 0. 5g/ L和無水硫酸鎂(Tlg/L ；培養(yǎng)基的ρΗ為5 10 ；所述產(chǎn)堿假單胞菌相對于培養(yǎng)基的接種量為 1% 10% (體積)；發(fā)酵時間為12 48小時；發(fā)酵溫度為15 50°C。進(jìn)一步地，本發(fā)明在步驟(3)中，所述分離是指對所述反應(yīng)液先進(jìn)行減壓蒸發(fā)、后用有機(jī)溶劑萃取得到1-薄荷醇。本發(fā)明方法相對于化學(xué)制備方法、生物制備方法和傳統(tǒng)的天然原料提取方法，具有以下優(yōu)點
(1) 采用傳統(tǒng)從天然薄荷植物中提取7-薄荷醇的方法，不僅生產(chǎn)過程效率比較低、能耗大，而且容易受到薄荷植物種植產(chǎn)量的影響；而化學(xué)制備方法由于催化劑本身昂貴易失活，且需要使用大量的有機(jī)溶劑與助劑，在生產(chǎn)成本與環(huán)境成本上都較高；而相比之下，本發(fā)明采用產(chǎn)堿假單胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)，選擇性水解薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物中的I-薄荷醇酯化物，不僅具有較高選擇性和轉(zhuǎn)化率的優(yōu)點，而且可以從工藝上大量減少有機(jī)溶劑的使用，對環(huán)境友好。(2)工業(yè)化的拆分制備薄荷醇方法中，都是采用薄荷醇異構(gòu)體的混合物作為初始原料，而現(xiàn)今大部分方法都采用將d-薄荷醇與1-薄荷醇這一對對映異構(gòu)體首先從薄荷醇異構(gòu)體的混合物中分離出來再進(jìn)行拆分。而本發(fā)明直接采用化學(xué)法合成得到的薄荷醇異構(gòu)體混合物作為底物，經(jīng)過簡單的酯化反應(yīng)，不再需要預(yù)先分離過程，方法簡單，在設(shè)備投資與操作費用方面優(yōu)勢明顯。 (3)本發(fā)明利用篩選的微生物制備薄荷醇，可以自行發(fā)酵制備，質(zhì)量穩(wěn)定，存儲穩(wěn)定，運輸方便，能大大降低原料成本，極具廣大應(yīng)用前景。(4)本發(fā)明采用預(yù)先減壓蒸發(fā)的方法將薄荷醇的酯化物與I-薄荷醇分離，大大簡化了分離過程，能夠直接制備高純度的1-薄荷醇，降低了分離的能耗，具備工業(yè)化前景。(5 )采用本發(fā)明的產(chǎn)堿假單胞菌/^eWiZoffloa3lS alcaligenes LM99進(jìn)行不對稱催化反應(yīng)，生成I-薄荷醇純度在95%以上，轉(zhuǎn)化率高可達(dá)90% ；且未反應(yīng)的底物可以直接回收， 重新外消旋化成為底物薄荷醇異構(gòu)體酯化的混合物，提高了底物利用率。生物材料樣品的保藏信息
保藏的生物材料樣品產(chǎn)堿假單胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)； 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)； 保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所 (郵編100101)； 保藏日期2010年12月3日； 保藏登記號CGMCC No. 4405。


圖1是產(chǎn)堿假單胞菌LM99催化反應(yīng)的反應(yīng)液的氣象色譜圖，圖中共有8個峰信號，由左向右依次為1-薄荷醇，1-異薄荷丙酸酯，d-異薄荷丙酸酯，dl-新薄荷丙酸酯， 1-薄荷丙酸酯，d-薄荷丙酸酯，1-新異薄荷丙酸酯，d-新異薄荷丙酸酯；8個信號峰的出峰時間依次為16. 440分鐘、22. 323分鐘、22. 665分鐘、24. 323分鐘、24. 757分鐘、25. 323分鐘、27. 540分鐘、27. 790分鐘。圖2是不同反應(yīng)時間下轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物非對映體過量值的變化曲線。
具體實施例方式在實施例中，在對薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物進(jìn)行催化過程中，對反應(yīng)液進(jìn)行底物轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物非對映體過量值(d. e.p)的測定方法具體如下(其中，所述底物為薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物)在反應(yīng)過程中，5mL反應(yīng)液與5ml乙酸乙酯振蕩萃取，然后離心(10000 X g，5min)得到乙酸乙酯相，進(jìn)行手性氣相色譜分析。該手性氣相色譜分析的體系如下 檢測儀器GC-950氣相色譜儀； 手性氣相柱CP-CYCLODEXTRIN β -2，3，6-Μ-19 (50mX0. 25mmX0. 25 μ m)；
檢測條件柱溫130°C，檢測器和進(jìn)樣器溫度分別為260°C與250°C，載氣(N2) 25mL/ min，空氣 3mL/min，氧氣 7mL/min。

計算公式
底物轉(zhuǎn)化率(%)=(初始底物濃度-剩余底物濃度)/初始底物濃度X100% ； d. e. s=c X d. e. J (l_c) X 100% d. e. p (%) = [ (Ae-As) / (As+Ae) ] X 100%
其中，c為底物轉(zhuǎn)化率，d. e. p為產(chǎn)物非對映體過量值，其中As、Ak分別為氣相色譜所測樣品中(7)_薄荷醇和非(乃_薄荷醇的峰面積之和。實施例1 菌種的篩選及鑒定
本實施例在杭州地區(qū)采集土壤，進(jìn)行產(chǎn)堿假單胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)的篩選。方法如下
富集培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為(g/L)蛋白胨5. 0，酵母膏3. 0，1-薄荷醇丙酸酯10. 0，硫酸銨4.0，磷酸氫二鉀10，硫酸鎂0.2，pH為7.0。121°C滅菌20min。稱取新鮮土樣Ig加入到裝有50ml富集培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，置于30°C、200r/min搖床中培養(yǎng)。按1%的接種量， 每隔一天進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，重復(fù)三次。初篩平板培養(yǎng)基成分為(g/L)酵母膏1. 0，硫酸銨2. 0，磷酸氫二鉀2. 0，氯化鈉 2. 0，硫酸鎂0.5,7-薄荷醇丙酸酯20. 0，瓊脂20. 0，ρΗ為7. 0。120°C滅菌20min。采用劃線法，將富集菌液在平板培養(yǎng)基上均勻劃線，30°C培養(yǎng)廣2天。將有水解透明圈的菌體標(biāo)記， 置于4°C冰箱保存。復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基成分為(g/L):蛋白胨5. 0，葡萄糖5. 0，酵母膏5. 0，橄欖油50. 0， 硫酸銨5. 0，磷酸氫二鉀2. 0，氯化鈉1. 0，硫酸鎂0. 2，pH為7. 0。120滅菌20min。將初篩獲得的單菌落接入20mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 0C，200rpm下生長24小時后，取新鮮發(fā)酵液5ml， 加入薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物，薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物濃度為20g/L，30°C振蕩反應(yīng)24小時，加入乙酸乙酯振蕩萃取水解產(chǎn)物，用于手性氣相色譜進(jìn)行分析，將底物選擇性較高的和產(chǎn)物非對映體過量值均較高的菌株保藏備用。菌種鑒定16S rDNA鑒定和生理生化鑒定。經(jīng)過篩選，編號為LM99的菌株，其非對映體對量值最高，且具有相對較好的轉(zhuǎn)化率，氣相譜圖見圖1。從圖1可知，產(chǎn)物7-薄荷醇出峰位置在16.440min。對菌株LM99作 16S rDNA PCR測序分析和生理生化實驗(見表1)，測序結(jié)果如SEQ No. 1所示，由測序分析和生理生化實驗的結(jié)果可確定所篩選出的菌株為產(chǎn)堿假單胞菌屬，該菌株命名為產(chǎn)堿假單 Ifelii LM99 {Pseudomonas alcaligenes LM99)。表1產(chǎn)堿假單胞菌LM99 (.Pseudomonas alcaligenes LM99)的生理生化實驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)堿假單胞菌，其特征是其保藏號為CGMCC No. 4405。
2.—種權(quán)利要求1的產(chǎn)堿假單胞菌的應(yīng)用，其特征是用于作為通過分離薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物來制備I-薄荷醇的催化劑。
3.一種利用權(quán)利要求1的產(chǎn)堿假單胞菌制備薄荷醇的方法，其特征是，包括如下步驟(1)將保藏號為CGMCCNo. 4405的產(chǎn)堿假單胞菌加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；(2)按以下第一方案、第二方案或第三方案對薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物進(jìn)行催化， 得到反應(yīng)液，所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物含有薄荷醇酯化物，且含有異薄荷醇酯化物、新異薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物、薄荷醇酯化物、異薄荷醇酯化物、 d-新異薄荷醇酯化物、新薄荷醇酯化物中的任一種或任幾種第一方案將所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物加入到步驟(1)得到的發(fā)酵液中，反應(yīng)后得到反應(yīng)液；第二方案將步驟(1)得到的發(fā)酵液離心得到上清液，將所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物加入所述上清液中，反應(yīng)后得到反應(yīng)液；第三方案將步驟(1)得到的發(fā)酵液進(jìn)行脫水處理得到發(fā)酵液的固體制劑，后將該發(fā)酵液的固體制劑與薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物一起加入到ρΗ為5 10的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)，得到反應(yīng)液；(3)將所述反應(yīng)液進(jìn)行分離得到1-薄荷醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備薄荷醇的方法，其特征在于所述薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物是指薄荷醇異構(gòu)體混合物中的各薄荷醇異構(gòu)體與脂肪族羧酸或芳香族羧酸形成的酯的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備1-薄荷醇的方法，其特征在于在步驟(2)的第三方案中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液；所述發(fā)酵液的固體制劑相對于緩沖溶液的質(zhì)量濃度為lg/L 100g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備1-薄荷醇的方法，其特征在于在步驟(3)中，所述分離是指對所述反應(yīng)液先進(jìn)行減壓蒸發(fā)、后用有機(jī)溶劑萃取得到1-薄荷醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備薄荷醇的方法，其特征在于在步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基的成分為酪蛋白廣10g/L、吐溫-80廣15g/L、酵母膏廣8g/L、硫酸銨(TlOg/ L、磷酸氫二鉀廣6g/L、氯化鈣(TO. 5g/L和無水硫酸鎂(Tlg/L ；培養(yǎng)基的ρΗ為5 10 ；所述產(chǎn)堿假單胞菌相對于培養(yǎng)基的接種量為19Γ10% (體積)；發(fā)酵時間為12 48小時；發(fā)酵溫度為15 50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產(chǎn)堿假單胞菌及其制備l-薄荷醇的方法和應(yīng)用。其制備l-薄荷醇的方法包括如下步驟(1)將產(chǎn)堿假單胞菌加入到培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；(2)將發(fā)酵液處理，將底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，得到反應(yīng)液，底物指薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物；薄荷醇異構(gòu)體酯化物的混合物含有l(wèi)-薄荷醇酯化物，且含有l(wèi)-異薄荷醇酯化物、l-新異薄荷醇酯化物、l-新薄荷醇酯化物、d-薄荷醇酯化物、d-異薄荷醇酯化物、d-新異薄荷醇酯化物、d-新薄荷醇酯化物中的任一種或任幾種；(3)將反應(yīng)液減壓蒸發(fā)，分離反應(yīng)底物與產(chǎn)物，萃取得到l-薄荷醇。
文檔編號C12P41/00GK102154166SQ20111000084
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者吳堅平, 李牧, 楊立榮 申請人:浙江大學(xué)