專利名稱：一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢桿菌。
背景技術(shù)：
腺苷(Adenosine)又稱腺嘌呤核苷，是人體細胞中具有重要生理功能的內(nèi)源性核苷，可直接進入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸而參與心肌的能量代謝，具有抗癲癇和強效擴張冠脈的作用，臨床上于治療冠狀血管障礙、心肌梗塞、動脈硬化、中風后遺癥、原發(fā)性高血壓、心絞痛等。同時腺苷還是重要的醫(yī)藥中間體，可合成8-氯腺苷、嘌呤毒素、高瓜氨基腺苷、賴氨酰氨基腺苷、S-甲硫腺苷、阿糖腺苷、環(huán)磷酸腺苷、三磷酸腺苷等。因此，腺苷具有廣闊的市場和開發(fā)前景。目前，腺苷的生產(chǎn)方法有化學合成法、酶解法和發(fā)酵法三種。化學合成法主要是以次黃嘌呤、肌苷、2-甲基硫代腺苷、2，8_二氯嘌呤、2' ,3' ,5'-三乙?；吸S苷等為起始原料，經(jīng)過多步反應(yīng)合成的。此方法溶劑損耗量大，收率低，成本高，產(chǎn)量小，且環(huán)境污染嚴重。酶解法就是用酶將RNA降解得到的腺苷，但是RNA降解過程產(chǎn)生4種核苷的混合物，給提取分離帶來很大困難，也增加了成本。腺苷發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)首推日本，早在70年代就開始了該領(lǐng)域的研究，取得了一系列成果，迄今已進入大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)階段。1968年Konishi等使用枯草桿菌的異亮氨酸缺陷型(lie-)，在異亮氨酸0.03%的培養(yǎng)基中可以累積腺苷U66g/L。1971年Haneda 等人由枯草桿菌誘變一株肌苷產(chǎn)生菌Bacillus sp. No. 1043，用MNNG(N-甲基-N'-硝基-N'-亞硝基胍)處理，得到缺失AMP脫氨酶的黃嘌呤缺陷型腺苷產(chǎn)生菌P53-18突變株，可以積累腺苷達16g/L。國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)腺苷起步較晚，但發(fā)展較快。高淑紅(工業(yè)微生物，2008,38 ) 42-46)等使用 Bacillus sp. ATCC 21616，最終積累腺苷 10. 37g/L，柏建新 (CN1657608A)等從肌苷菌株出發(fā)選育出B. subtilis CGMCC No. 1304，最高可積累腺苷達 23g/L，但是易產(chǎn)生回復(fù)突變，產(chǎn)量不穩(wěn)定。離子注入技術(shù)作為一種新穎、有效的生物品種改良新技術(shù)已在工業(yè)微生物育種、 農(nóng)作物誘變育種、植物轉(zhuǎn)基因、生命起源以及環(huán)境輻射與人類健康等方面取得了一系列重要研究成果。與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入除了具有能量沉積效應(yīng)外，還具有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷中和與交換效應(yīng)，是一種將物理誘變和化學誘變特性相結(jié)合的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成堿基的改變，誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異(余增亮，物理，1997，沈(6) :333-338)，產(chǎn)生比其它電離輻射更為豐富的生物學內(nèi)容和更為廣泛的誘變圖譜。因此，離子注入進行工業(yè)微生物育種已成為研究熱點，并取得了豐碩成果。虞龍(Acta Laser Biology Sinica，1999，8 (3) 17-220)等用離子注入誘變篩選到一株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌，使維生素C在300t發(fā)酵罐上糖-酸摩爾轉(zhuǎn)化率達到94. 8 %，重量轉(zhuǎn)化率為102%，被業(yè)內(nèi)專家喻為“自維生素C 二步法發(fā)酵發(fā)明以來的重大突破”。陳祖華(微生物學通報，2000，27 (3) :174-177)等用離子注入誘變處理熱帶假絲酵母，經(jīng)篩選，獲得了 1株能夠利用正十二烷烴發(fā)酵產(chǎn)生長鏈二元酸的高產(chǎn)菌，在底物濃度為15% (體積比)下產(chǎn)酸量由43. 5% g/L上升到73. 2% g/L。惠友權(quán)(西北大學學報，2001，31 (3) =251-254)等應(yīng)用離子注入對產(chǎn)黃嘌呤氧化酶的球形節(jié)桿菌進行離子誘變篩選，得到較出發(fā)菌株提高40%的突變菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌，以克服腺苷產(chǎn)量不高、傳代不穩(wěn)定、易出現(xiàn)回復(fù)突變的問題。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌，其分類命名為枯草芽孢菌(Bacillus subtilis) A409 ；其遺傳標記為鳥嘌呤營養(yǎng)缺陷型、黃苷酸氨化酶缺失，同時還具有8-氮黃嘌呤抗性；目前該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)， 保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為 100101，其保藏編號為CGMCC No. 4484，保藏日期為2010年12月17日。該菌株是通過對一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 301 (腺苷產(chǎn)量低，而傳代不穩(wěn)定，極易產(chǎn)生恢復(fù)突變)進行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉(zhuǎn)接于完全培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，采用雙平板技術(shù)和抗性平板技術(shù)篩到腺苷高產(chǎn)菌?？莶菅挎邨U菌 (Bacillus subtilis) 301是本實驗室自行從土壤中篩選得到的菌株。本發(fā)明采用離子束照射技術(shù)進行菌體誘變，具體誘變過程如下菌體經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，用磷酸緩沖鹽洗下新鮮菌落，振蕩，使其充分分散，制成一定濃度的懸濁液，備用。取0. Iml菌懸液均勻涂布于滅過菌的平皿中，以無菌風吹至干燥后進行離子注入。離子注入機為LZD900多功能離子注入機。使用20KeVN+離子在不同劑量進行注入，靶室真空度為10-31^。將平皿置于靶臺上，以k脈沖式注入，間隔 15s，然后取出平皿，以Iml無菌水洗脫，涂布于完全培養(yǎng)基平板上，于30°C培養(yǎng)7 用于單菌落的挑選。本發(fā)明的鳥嘌呤缺陷型、黃苷酸氨化酶缺失菌株分離篩選方法為雙平板技術(shù)，具體操作方法為挑出完全培養(yǎng)基平板上圈大飽滿的菌落，對應(yīng)點在基本培養(yǎng)基、鳥嘌呤補充培養(yǎng)基平板上，挑選在基本培養(yǎng)基上不生長，而在含鳥嘌呤的補充培養(yǎng)基上生長的相對應(yīng)位置菌落。將檢出的菌株轉(zhuǎn)接于斜面，用于營養(yǎng)缺陷型的鑒定，以及進行發(fā)酵培養(yǎng)，從而篩選出產(chǎn)腺苷高的菌株。本發(fā)明的抗8-氮黃嘌呤菌株的分離篩選方法為用離子束照射上面篩選出的菌株的菌懸液，經(jīng)適當稀釋后涂布于8-氮黃嘌呤抗性培養(yǎng)基平板上，320C培養(yǎng)48小時挑取生長良好的菌落轉(zhuǎn)接于斜面，進行發(fā)酵培養(yǎng)，最終篩選到腺苷高產(chǎn)菌。本發(fā)明中的培養(yǎng)基配制為斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10-30，蛋白胨10-20，酵母膏10-20，玉米漿10-20， NaCl 3-5，瓊月旨 20，pH 6. 4-7. 5。基本培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖3-8，(NH4)2SO4 1-5，檸檬酸鈉 0. 5-2. 5，KH2PO4 5-10,Κ2ΗΡ04 · 3H20 2-5，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01-0. 05，MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05， 瓊脂 20，pH 6. 4-7. 5。完全培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏10，NaCl 3，瓊脂20，pH 6. 4-7. 5。鳥嘌呤補充培養(yǎng)基(g/L)基本培養(yǎng)基+鳥嘌呤0. 1-0. 5，pH 6. 4-7. 5?？剐耘囵B(yǎng)基(g/L)葡萄糖3-8，(NH4)2SO4 1_5，檸檬酸鈉 0. 5-2. 5，KH2PO4 5-10, Κ2ΗΡ04 · 3H20 2-5，MgSO4 · 7H20 0. 1-0. 5，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01-0. 05，MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05， 鳥嘌呤0. 1-0. 5，不同濃度8-氮黃嘌呤，瓊脂20，pH 6.4-7.5。種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10-30，蛋白胨5-15，酵母膏10-20，玉米漿10-20，NaCl 3-5，鳥苷 0. 01-0. 05，pH 6. 4-7. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖60-100，酵母膏 10-30，KH2PO4 1-5, MgSO4 · 7H20 3-8, 尿素 3-8，(NH4)2SO4 10-30，MnSO4 · H2O 0. 01-0. 05, KCl 1-10，豆餅水解液 10-30，鳥嘌呤 0. 1-0. 5，CaCO3 10-20，pH 6. 4-7. 5。上述所有培養(yǎng)基都是121 °C高壓蒸汽滅菌15min。利用上述高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，將CGMCC No. 4484接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)腺苷。平板、種子、發(fā)酵培養(yǎng)溫度均為25-40°C，優(yōu)選為32-35°C ；種子培養(yǎng)時間為12- 小時，優(yōu)選20 22小時；發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-72小時，優(yōu)選為60-66小時；培養(yǎng)基的pH在 6. 4-7. 5，最適為7.0 ；發(fā)酵罐通氣攪拌的溶氧范圍控制在30% -60%，優(yōu)選為45%。其中， 種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基時，種子液體積與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1-30 100，優(yōu)選接種量為 8-12 100。本發(fā)明的有益效果包括1.與傳統(tǒng)的輻射法及化學誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想新品種等特點。2.本發(fā)明獲得了一株鳥嘌呤缺陷型，黃苷酸氨化酶缺失及抗8-氮黃嘌呤的腺苷高產(chǎn)菌株。3.本發(fā)明的腺苷高產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A409 (CGMCCNo. 4484)，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的特點，該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)腺苷的性能保持穩(wěn)定。具有很強的工業(yè)使用性價值。4.本發(fā)明還獲得了發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的最優(yōu)發(fā)酵條件，使用本發(fā)明篩選的高產(chǎn)菌，選擇最適的酵母膏和豆餅水解液的濃度，最佳PH，在33°C下發(fā)酵66小時，腺苷的產(chǎn)量穩(wěn)定在 %g/L，操作方便簡單。


圖1為枯草芽孢菌A409和301中XMP氨化酶和sAMP合成酶酶活變化。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 以實驗室保藏的低產(chǎn)腺苷的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 301為出發(fā)菌株， 將經(jīng)N+離子束誘變(低能離子注入機靶室內(nèi)真空度為2X10_4，注入能量為20kev，劑量為 5 X 1013ions · cm_2. s—1)后的菌懸液經(jīng)無菌水稀釋100倍后，取0. Iml涂布于完全培養(yǎng)基平板上32°C下培養(yǎng)3天，從中挑選圈大飽滿的單菌落，對應(yīng)點在基本培養(yǎng)基、鳥嘌呤補充培養(yǎng)基平板上，挑選在基本培養(yǎng)基上不生長，而在含鳥嘌呤的補充培養(yǎng)基上生長的相對應(yīng)位置菌落。將檢出的營養(yǎng)缺陷型再劃斜面，轉(zhuǎn)接一環(huán)于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20g/ L，蛋白胨10g/L，酵母膏12g/L，玉米漿14g/L,NaCl 3g/L，鳥苷0. 02g/L)的500mL搖瓶中， 于32°C下IOOrpm往復(fù)式搖床培養(yǎng)18小時。再轉(zhuǎn)接2mL于裝有25mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖 100g/L，K2HP043g/L，(NH4)2SO4 12g/L，MgSO4 · 7H20 5g/L，MnSO4 · H2O 0.02g/L，KCl 3g/ L,尿素5g/L，酵母膏16g/L，鳥嘌呤0. lg/L，豆餅水解液15g/L，CaCO3 15g/L)的500mL搖瓶中，于33°C下260rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)66小時。經(jīng)過初篩，得到192株比出發(fā)菌株產(chǎn)量高的突變株。然后對這192菌株進行復(fù)篩，復(fù)篩時，將每株菌接3瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，復(fù)篩的條件和初篩相同，得到6株產(chǎn)量最高的腺苷菌株，實驗結(jié)果見表1。表 權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌，其分類命名為枯草芽孢菌(Bacillus subtilis) A409;其遺傳標記為鳥嘌呤營養(yǎng)缺陷型、黃苷酸氨化酶缺失，同時還具有8-氮黃嘌呤抗性；其保藏編號為CGMCC No. 4484，保藏日期為2010年12月17日。
2.利用權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于， 將CGMCC No. 4484接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)腺苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖10_30g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母膏10_20g/L， 玉米漿 10-20g/L, NaCl 3_5g/L，鳥苷 0. 01-0. 05g/L，其余為水，ρΗ6· 4-7. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖60-100g/L，酵母膏10-30g/L，KH2PO4 l-5g/L, MgSO4 · 7H20 3-8g/L,尿素 3_8g/L，(NH4)2SO4 10_30g/L，MnSO4 · H2OO. 01-0. 05g/ L，KCl l-10g/L，豆餅水解液 10_30g/L，鳥嘌呤 0. 1-0. 5g/L，CaCO3 10_20g/L，其余為水，pH 6. 4-7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間為12-24小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)時間為48-72小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法，其特征在于，種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基時，種子液體積與發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為1-30 100。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)腺苷的枯草芽孢菌，其分類命名為枯草芽孢菌(Bacillus subtilis)A409；其遺傳標記為鳥嘌呤營養(yǎng)缺陷型、黃苷酸氨化酶缺失，同時還具有8-氮黃嘌呤抗性；其保藏編號為CGMCC No.4484，保藏日期為2010年12月17日。上述枯草芽孢桿菌菌株腺苷產(chǎn)量能夠穩(wěn)定在25g/L，比出發(fā)菌株的腺苷產(chǎn)量提高了5倍多，該菌株經(jīng)過10代以上傳代，生產(chǎn)腺苷的性能保持穩(wěn)定，而且在5L發(fā)酵罐上也能夠維持較高水平，具有大規(guī)模工業(yè)化的潛力。
文檔編號C12P19/40GK102154165SQ20111000071
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者任華景, 吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 曹家明, 柏建新, 熊健, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學