一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌及應(yīng)用。該產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida?zk1)保藏編號為CCTCC?NO：M2013280。惡臭假單胞菌用于制備細(xì)菌漆酶時，將惡臭假單胞菌接種倒富含銅離子的LB培養(yǎng)基中，在35‐39攝氏度之間培養(yǎng)48‐96h后，在離心機(jī)上離心處理，棄上清液收集菌體，用水將菌體重新懸浮，用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，再次離心處理，收集上清液，得細(xì)菌漆酶。該細(xì)菌漆酶可應(yīng)用于印染廢水處理或客家釀酒澄清處理。本發(fā)明惡臭假單胞菌分離自農(nóng)業(yè)堆肥，能產(chǎn)生大量細(xì)菌漆酶，其漆酶最適作用pH為堿性、能氧化多種酚類和非酚類底物，應(yīng)用價值大。
【專利說明】一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種漆酶,特別是涉及一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，該惡臭假單胞菌是從自然界中篩選、分離、純化得到，能氧化多種酚類及人工染料的漆酶；本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(EC.1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，以氧為電子受體，氧化包括酚類，多酚類，苯胺、木質(zhì)素，多環(huán)芳香烴等一系列化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，在反應(yīng)過程中生成的唯一副產(chǎn)物就是水。
[0003]第一種漆酶是由日本人Yoshida在1883年在植物漆樹(Rhus vernicifera)樹脂中發(fā)現(xiàn)，隨后在多種植物和多種真菌檢測到漆酶的活性。到2008年學(xué)者統(tǒng)計已經(jīng)超過了上百中真菌漆酶并被分離提純，并且這個數(shù)字還在快速的增加。但直到1993年，Givaudan才首次在水稻根圍中分離得到一株產(chǎn)漆酶的脂固氮螺菌，這是第一次在原核生物檢測到漆酶活性。2000年，Alexandre通過生物信息學(xué)分析技術(shù),證實(shí)漆酶也普遍存在于原核生物中。迄今為止已經(jīng)在多種原核微生物中如Marinomonas mediterranea、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌中檢測到漆酶活性。細(xì)菌漆酶與真菌漆酶在氨基酸序列上具有較大差異，因此也被定義為類漆酶。研究表明細(xì)菌漆酶與真菌漆酶往往具有穩(wěn)定性好、PH作用范圍廣泛，不含糖基，易于異源表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。但是關(guān)于細(xì)菌漆酶的研究報道還是非常少。
[0004]漆酶具有多種優(yōu)點(diǎn)。漆酶氧化底物特異性不強(qiáng)，可以氧化包括酚類和非酚類多種底物，據(jù)不完全統(tǒng)計，其可以氧化底物超過了 250種；漆酶與其他過氧化物酶比較，無需額外添加如H2O2輔助因子，對環(huán)境友好；漆酶在添加化學(xué)介質(zhì)的條件下，可以將氧化還原電位高于漆酶的化學(xué)物質(zhì)，或者無法接觸到漆酶催化中心的大分子物質(zhì)有效氧化。
[0005]漆酶的優(yōu)點(diǎn)使得漆酶在印染廢水處理、多酚廢水的處理、木質(zhì)素的降解與生物能源、紙漿漂白、有機(jī)物合成、果汁澄清、生物傳感、生物檢測等多個方面具有重要的應(yīng)用潛力aPeralta利用云芝漆酶在酸性條件下對多種染料進(jìn)行脫色(Peralta-Zamora P, PereiraC M, Tiburtius E R L, et al.Decolorization of reactive dyes by immobilizedlaccase [J].Applied Catalysis B:Environmental, 2003, 42 (2): 131-144),研究表明云芝漆酶在固定化或者添加化學(xué)介導(dǎo)物的情況對靛藍(lán)、偶氮染料活性黑G、孔雀石綠等染料具有良好的脫色效果。
[0006]Galliano等對木硬孔菌(Rigidoporus Iignosus)產(chǎn)生的漆酶和猛過氧化物酶進(jìn)行了體外研究，證實(shí)二者協(xié)同作用降解木質(zhì)素；Ibarra-Escutia等將白腐菌產(chǎn)生的漆酶成功地固定到絲網(wǎng)印刷石墨電極上設(shè)計出安培生物傳感器，能夠準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測茶中酚化合物的含量；Ikeda等在不添加甲醛等有毒助劑的水溶液中，利用漆酶催丙烯酰胺聚合形成高分子量的化合物。因而，尋找能夠新的能夠產(chǎn)漆酶的細(xì)菌菌株微生物就顯得非常有意義。
[0007]但現(xiàn)在普遍使用的漆酶均為真菌漆酶，適合作用的環(huán)境為酸性環(huán)境，對某些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定染料的脫色需要額外添加化學(xué)介導(dǎo)物，限制了使用范圍，增加應(yīng)用成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌及應(yīng)用，利用從自然環(huán)境中分離篩選出一株新的能夠產(chǎn)細(xì)菌漆酶的菌株，產(chǎn)生的細(xì)菌類漆酶適于PH為堿性，對靛藍(lán)等染料可以直接脫色，無需添加化學(xué)介導(dǎo)物，為細(xì)菌漆酶的生產(chǎn)制備提供一種新的可利用的微生物，為人工染料降解、酚類廢水處理、木質(zhì)素降解、生物傳感等領(lǐng)域提供新的技術(shù)手段。
[0009]本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一株產(chǎn)新型產(chǎn)漆酶的惡臭假單胞菌，建議的分類命名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl);本發(fā)明提供的菌株從農(nóng)村堆肥中分離得到，能夠產(chǎn)生一種新型作用PH范圍，可以直接氧化多種頑固類染料的細(xì)菌漆酶，經(jīng)微生物學(xué)鑒定和基因?qū)W歸屬后證實(shí)屬惡臭假單胞菌,保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for TypeCultureCollection，簡稱CCTCC M2013280，湖北省武漢市，洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，郵政編碼430072，電話027-68752319)，保藏日為2013年6月23日。
[0011]該惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)為革蘭陰性菌,短桿狀,有鞭毛,該菌菌株的菌落為中等大小、圓形，規(guī)則，高突起，邊緣呈葉狀，白色、不產(chǎn)生黑色素等。
[0012]所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)用于制備細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)接種倒富含銅離子的LB培養(yǎng)基中，在35_39攝氏度之間培養(yǎng)48-96h后，在離心機(jī)上離心處理，棄上清液收集菌體，用水將菌體重新懸浮，用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì) [0013]優(yōu)選地,所述在離心機(jī)上離心處理的轉(zhuǎn)速為6000r/min,時間10min-20min。所述再次離心處理的轉(zhuǎn)速為13000r/min ;時間為15_min25min。
[0014]一種細(xì)菌漆酶，由應(yīng)用所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)制得。
[0015]所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)在添加銅離子的LB培養(yǎng)基中，可以產(chǎn)生大量的細(xì)菌漆酶，產(chǎn)生的細(xì)菌漆酶為胞內(nèi)酶。該漆酶是一種堿性漆酶，最適作用PH在7-10之間，且在堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性，能夠氧化愈創(chuàng)木酚、α -萘酚、靛藍(lán)、孔雀石綠、剛果紅、橙黃I等多種底物，不同于己經(jīng)報道的其他漆酶酶。該細(xì)菌漆酶可應(yīng)用于印染廢水處理或客家釀酒澄清處理。
[0016]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明惡臭假單胞菌分離自農(nóng)業(yè)堆肥，能產(chǎn)生大量細(xì)菌漆酶，其漆酶最適作用PH為堿性、能氧化多種酚類和非酚類底物，該菌株應(yīng)用價值大。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為菌株zkl漆酶活性的pH值曲線圖。
[0018]圖2為zkl漆酶對客家釀酒穩(wěn)定性的影響效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，需要說明的是，實(shí)施例并非對本發(fā)明保護(hù)范圍構(gòu)成限制。[0020]實(shí)施例1:zkl菌株的分離、篩選及鑒定
[0021]一、zkl菌株的分離
[0022]從廣州市白云區(qū)沙龍新朗頭村農(nóng)村堆肥取樣。添加到含有CuS04質(zhì)量濃度為0.05%的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)箱進(jìn)行富集培養(yǎng)48小時，利用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后用固體LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋平板法分離單個菌落，利用含有1%質(zhì)量愈創(chuàng)木酚的乙醇溶液和1%質(zhì)量的α -萘酚的乙醇溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，挑選呈現(xiàn)粉紅色或灰黑色菌落進(jìn)行反復(fù)劃線篩選獲取純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。所得Zkl菌株的菌落為中等大小、圓形、凸起、邊緣整齊濕潤的光滑型菌落，培養(yǎng)24h為白色，不產(chǎn)色素。
[0023]二、Zkl菌株的形態(tài)特征
[0024]取37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)zkl菌24h后，進(jìn)行革蘭染色和透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株zkl為革蘭陰性菌,短桿狀,大小約為0.5~1.0 μ mX2~4 μ m,有鞭毛。
[0025]三、zkl菌株的生理生化特征
[0026]將zkl菌種接種的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，利用VITEK全自動細(xì)菌鑒定儀，采用革蘭氏陰性鑒定卡，7h后讀取鑒定結(jié)果，zkl菌種生化結(jié)果如表1所示。
[0027]表1Zhl的生化鑒定結(jié)果
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)細(xì)菌漆酶的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl),其特征在于:其保藏編號為 CCTCC NO:M2013280o
2.權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制備細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，其特征在于，將惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)接種倒富含銅離子的LB培養(yǎng)基中，在35 - 39攝氏度之間培養(yǎng)48 - 96h后，在離心機(jī)上離心處理，棄上清液收集菌體，用水將菌體重新懸浮，用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，再次離心處理，收集上清液，得細(xì)菌漆酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制備細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，其特征在于，所述在離心機(jī)上離心處理的轉(zhuǎn)速為6000r/min,時間IOmin -20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida zkl)用于制備細(xì)菌漆酶的應(yīng)用，其特征在于，所述再次離心處理的轉(zhuǎn)速為13000r/min ;時間為15 - min25min。
5.一種細(xì)菌漆酶，其特征在于，其由應(yīng)用權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida zkl)制得。
6.權(quán)利要求5所述的細(xì)菌漆酶在印染廢水處理或客家釀酒澄清處理中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/40GK103789237SQ201410036635
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月25日
【發(fā)明者】劉銳, 白衛(wèi)東, 劉巖, 趙文紅, 馮柏源 申請人:仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院