專利名稱：溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，具體涉及一種溶組織內阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段及其制備方法和應用。
背景技術：
溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica,Ε. h)是引起阿米巴性結腸炎和腸外膿腫的病原體，具有侵入宿主組織或器官、適應宿主免疫反應和表達致病因子的能力。全世界約有五千多萬人感染溶組織內阿米巴，每年有10萬患者死于阿米巴病(amoebiasis)，為僅次于瘧疾的第二種致死性原蟲病。我國的平均感染率為0.949%，感染人數(shù)估計為1069萬 (1992年數(shù)據(jù))。溶組織內阿米巴的感染性包囊經(jīng)口攝入，通過胃和小腸，在回腸末端或結腸脫囊為滋養(yǎng)體。滋養(yǎng)體通過它表面的半乳糖/乙酰氨基半乳糖(Gal/GalNAc)可抑制性凝集素等粘附于腸上皮細胞，然后釋放阿米巴穿孔素和半胱氨酸蛋白酶等致病因子，通過接觸依賴性細胞溶解作用使細胞壞死，滋養(yǎng)體也可誘導與之接觸的細胞發(fā)生凋亡。同時腸上皮細胞在此過程中分泌的細胞因子和趨化因子可吸引中性粒細胞和巨噬細胞到達感染部位，中性粒細胞與滋養(yǎng)體作用，釋放炎性介質進一步破壞臨近的腸上皮細胞；而滋養(yǎng)體釋放的半胱氨酸蛋白酶可溶解細胞外基質，使滋養(yǎng)體穿越粘膜層，侵入粘膜下層，在粘膜下層中縱向延伸，形成特征性的口小底大燒瓶狀潰瘍。滋養(yǎng)體亦可侵入周圍血管，隨血液循環(huán)進入其他組織引起腸外膿腫。診斷阿米巴感染的傳統(tǒng)方法是從糞便中檢出溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體或包囊，但是此方法的檢出率不高，對于阿米巴肝膿腫病例也不易從膿液中檢出滋養(yǎng)體。而血清學檢驗對于診斷侵襲性阿米巴病具有其高敏感性和無創(chuàng)傷性的特點，而且大多數(shù)無癥狀包囊攜帶者和阿米巴結腸炎患者血清中存在抗溶組織內阿米巴抗體。因此血清學診斷是重要的阿米巴病實驗室診斷方法之一。已有不少文獻報道重組溶組織內阿米巴抗原用于血清學診斷， 其中滋養(yǎng)體表面重要的粘附和致病分子Gal/GalNAc可抑制性凝集素重組蛋白是目前最有前景的診斷用重組蛋白之一。研究證實，溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體表面存在兩種不同分子量的Gal/GalNAc可抑制性凝集素，一種分子量為260kDa，另一種分子量為150kDa。分子量為150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素與260kDaGal/GalNAC可抑制性凝集素通過非共價鍵連接。分子量 260kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素是由170 kDa的跨膜重鏈亞單位和31 kDa /35 kDa 的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定嵌入雙層表膜的輕鏈亞單位，由二硫鍵連接組成的異二聚體。分子量為150kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素又被稱為Gal/GalNAc可抑制性凝集素的中間亞單位(intermediate subunit，Igl)。Igl由兩個獨立的基因編碼(igll和 igl2)，編碼的蛋白含有1，101個氨基酸與260 kDa Gal/GalNAc可抑制性凝集素的氨基酸有81%的一致性，富含半胱氨酸，并有GPI錨定的膜蛋白氨基和羧基末端疏水信號序列的特征，是具CXXC和CXC重復序列的阿米巴基因家族中的一員，與滋養(yǎng)體的吸附和細胞毒性有關[1，3，6]。Igl能被免疫系統(tǒng)識別，在蛋白免疫印跡中阿米巴感染者的血清能夠識別純化的Igl ；天然的Igl不僅能夠被阿米巴病患者的血清識別，而且能夠被無癥狀的包囊攜帶者血清識別。而抗Igl的鼠單克隆抗體能夠抑制滋養(yǎng)體粘附哺乳動物細胞、對哺乳動物細胞的細胞毒作用以及吞噬紅細胞作用，但中間亞單位在整個凝集素中的作用仍然不清楚。全長Igl的重組蛋白雖然已經(jīng)制備成功并可以被阿米巴患者血清識別，但由于全長Igl分子量比較大，表達量低，因而大量制備比較困難。此外，全長Igl蛋白中部分氨基酸序列已被證實不含有被病人血清識別的抗原表位，所以以全長Igi蛋白作為血清診斷抗原容易出現(xiàn)交叉反應。因而，僅含有阿米巴患者血清的識別抗原表位的Igi蛋白片段不僅可以提高特異性和敏感性，而且由于分子量減小，有利于表達和制備，適于臨床診斷的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對阿米巴病的診斷的不足，提供溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，尤其是一種溶組織內阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段及其制備方法和在診斷中的應用。本發(fā)明通過基因工程手段，從溶組織內阿米巴中提取其150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因，構建表達載體，在大腸桿菌中誘導表達重組150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素蛋白的C末端多肽片段，該多肽片段可用于阿米巴病的血清學診斷。本發(fā)明所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因如SEQ ID No 1所示。所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。本發(fā)明提供了所述的重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的制備方法，其特征在于，其包括步驟
(1)從培養(yǎng)的溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體中提取總RNA，通過RT-PCR合成cDNA；
(2)合成引物:
EH150-S749-XH0 :5’ - CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3’ EH150-AS1088-XH0 :5’ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT-3 ‘
(3)以cDNA為模板，通過PCR獲得150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因片段；
(4)將編碼基因克隆入原核表達載體中，轉化宿主菌，培養(yǎng)所得重組工程菌，然后誘導其表達目的蛋白；
(5)采用緩沖液對150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的包涵體進行洗滌，將其提純后，采用谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其復性，從而獲得重組150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段。本發(fā)明步驟(1)中，所分離總RNA來源于溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體。本發(fā)明步驟(3)中，所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因如SEQ ID No 1所示；所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本發(fā)明中，表達載體不限于特定的表達載體，只要它能夠與所述cDNA基因重組， 形成適宜表達質粒。本發(fā)明的實施例中優(yōu)選表達載體為原核表達載體，尤其是pET19b。本發(fā)明中，宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。本發(fā)明的實施例中優(yōu)選宿主細胞為大腸桿菌BL21 Star (DE3)pLysS。本發(fā)明方法中，培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基是LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度是20 37°C， 培養(yǎng)時間3 16小時。本發(fā)明方法中，菌體達到合適的濃度后用IPTG誘導表達，誘導條件為IPTG濃度為0. 1 ImM，誘導溫度為20 37°C，誘導時間為2 16小時。本發(fā)明方法中，重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的最終產(chǎn)物用過下述方法純化將150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段表達工程菌在37°C誘導3小時后，離心收集菌體，置于冰上超聲裂解，然后加入溶菌酶30°C 振搖30分鐘，離心，收集包涵體蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit對包涵體蛋白進行提純與復性后，HOOOrmp離心20分鐘，收集上清，冰箱保存。本發(fā)明中，采用Dolt bolt法檢測重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的 C末端多肽片段與阿米巴病患者血清的反應性。本發(fā)明中，采用ELISA方法比較重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C 末端的多肽片段、重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素和溶組織內阿米巴粗抗原的血清學診斷的敏感性與特異性。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明從培養(yǎng)的溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體中提取總RNAJf 增出重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段的編碼基因，從而構建表達載體。轉入大腸桿菌誘導后，重組重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C 末端的多肽片段以包涵體形式在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)過簡單的洗滌后，可以獲得高純度的蛋白。以谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其進行復性后，可獲得具有生物學活性的可溶性重組重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，可用于阿米巴病的血清學免疫診斷，克服阿米巴病診斷中糞檢溶組織內阿米巴的包囊和滋養(yǎng)體的漏檢與誤診，大大提高阿米巴病診斷特異性和敏感性。表1. E.h粗抗原、Igl重組蛋白片段與正常人、阿米巴感染者、無關病人血清 ELISA結果。表 1
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圖1 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳。圖2 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端基因與表達質粒連接后的歷ii/ III單酶切鑒定電泳圖。
圖3 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端氨基酸序列與全長150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素(AAK92361. 1)氨基酸序列對比。圖4重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，
其中M 低分子量標準蛋白質；1 未加入IPTG的3h培養(yǎng)細菌裂解液；2 =IPTG誘導3h 后的細菌裂解液；3: C-末端多肽片段包涵體；4: C-末端多肽片段包涵體透析、復性后蛋白。圖5重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段特異性的Dolt blotting 檢測，
其中1 與阿米巴感染者血清反應；2 與正常人血清反應；3 與惡性瘧原蟲病人血清反應。圖6溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體粗抗原與患者血清的ELISA結果。圖7重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素與患者血清的ELISA結果。圖8重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段與患者血清的 ELISA結果。圖9重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素與溶組織內阿米巴粗抗原相關性。圖10重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素C末端多肽片段與溶組織內阿米巴粗抗原相關性。
具體實施例方式實施例1溶組織內阿米巴的培養(yǎng)
溶組織內阿米巴HM-I IMSS株以含15%成牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的BI-S-33培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)。阿米巴滋養(yǎng)體培養(yǎng)在6ml的有蓋玻璃培養(yǎng)管中，蓋緊管蓋，并呈5°的角度放置在36. 5 ！細胞培養(yǎng)箱中。
實施例2 PCR反應擴增igll C-末端基因
按照試劑盒說明，使用Rneasy Total RNA試劑盒提取無菌培養(yǎng)的溶組織內阿米巴 HM-I IMSS 株總 RNA。使用 GeneAmp RNA PCR Kit 進行 RT-PCR，獲得 cDNA。以 cDNA 為模板， 用引物 EH150-S749-XH0 (5，- CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3，)和 EH150-AS1088-XH0 (5‘ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT- 3)擴增 C-末端基因。PCR 執(zhí)行程序94°C 2min ； 94°C 15sec，55°C 30sec,72°C lmin，共 30 個循環(huán)；72°C 3min。反應結束后各取 PCR 產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，C-末端基因大小為IlOObp (如圖1所示)。
實施例3 構建pET19b-Ehl50-C質粒
以QIAquick PCR Purification Kit提純PCR擴增產(chǎn)物后，再以Xho I酶切PCR擴增產(chǎn)物。經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，用QIAEXII Agaose Gel Extraction Kit提純DNA。以 TAKARA DNA Ligation Kit將載體pET19b與Igl基因的C-末端基因片段，16°C連接過夜。 將連接產(chǎn)物轉化JM109感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)過夜，提取質粒后，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示重組基因片段都與質粒連接成功，重組質粒大小為6. Skb,(如圖2所示)，測序鑒定證實目的基因插入位點及插入片段大小均正確。采用Vector NTI 10軟件，推定氨基酸序列，并與全長Igl蛋白氨基酸序列(AAK92361. 1)進行比對，結果顯示C末端多肽片段為全長Igl 蛋白的749位至1088位之間的氨基酸多肽序列片段(如圖3所示)。
實施例4重組蛋白的表達和純化
將重組質粒pET19b-Ehl50-C轉入BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞后，涂布于LB瓊脂板 (含氨芐青100mg/ml，氯霉素34mg/ml)，37°C溫箱中培養(yǎng)過夜。挑選單一菌落入800ml LB 培養(yǎng)液(含氨芐青50mg/ml，氯霉素34mg/ml)中，37°C 220rmp振搖，培養(yǎng)至0D600約為0. 5 時，加入ImM的IPTG，37°C誘導3小時，4°C 8000rpm離心10分鐘，棄上清，收集細菌沉淀。 經(jīng)10%的SDS-PAGE檢測，IPTG誘導的菌液在分子量大約53kDa。重組Igl蛋白C-末端以包涵體的形式表達。細菌沉淀中，加入40ml IB wash buffer和40ml IM PMSF，冰上超聲后，加入溶菌酶(終濃度為200mg/ml)混勻后，30°C IOOrmp振搖30分鐘后，再次冰上超聲， 離心IOOOOrmp 10分鐘；棄上清，加入40ml IB wash buffer重新懸浮后，IOOOOrmp離心 10分鐘，重復該步驟，直至沉淀的顏色一致。經(jīng)10%的SDS-PAGE檢測重組Igl蛋白C-末端蛋白的包涵體純度可達到95%以上(如圖4所示)。實施例5斑點印跡(Dot Blotting)
將Igl全長、C-末端重組蛋白各分別加樣于硝酸纖維素膜上，室溫干燥，以5%脫脂奶一 PBS于濕盒中封閉lh。分別與阿米巴感染者混合血清(1:200稀釋)、正常人的對照血清(1:200稀釋)、惡性瘧原蟲病人血清(1:200稀釋)在濕盒中孵育lh。以PBS (含0. 05% Tween)洗膜后，與HRP標記的山羊抗人IgG (1:300稀釋)濕盒中孵育Ih后以PBS (含0. 05% Tween)洗膜。使用Konica Immunostaining HRP-1000顯色，結果顯示Igl全長重組蛋白、 C-末端重組蛋白能與阿米巴感染者血清反應，與正常人血清和惡性瘧原蟲病人的血清不發(fā)生反應。(如圖5所示)
實施例6重組蛋白敏感性與特異性檢測
96孔酶標板每孔加入含Img溶組織內阿米巴HM-I IMSS株滋養(yǎng)體粗抗原或者IOOng Gal/GalNAc可抑制性凝集素中間亞單位全長或重組C末端蛋白的Coating Buffer 100ml, 4 °C濕盒中過夜。PBS (含0. 05% Tween20)洗板后每孔加入含3%脫脂奶的PBS 400ml，濕盒中室溫封閉lh。每孔中分別加入100ml健康人或病人血清(1:400稀釋)，陰性對照為健康人血清(1:400稀釋)濕盒中室溫孵育lh。PBS (含0.05% Tween20)洗板后每孔中加入 IOOrnl辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG (1:1000稀釋)100ml，濕盒中室溫孵育lh。PBS (含0.05% Tween20)洗板后加入顯色液200ml/孔，室溫下避光反應30min，最后每孔加入 2M H2S04 50ml終止顯色反應。酶標儀490nm測定吸光度。0D490讀數(shù)高于健康陰性對照組人群平均OD值3個標準差以上為陽性。將標本信息及ELISA結果等輸入計算機，建立數(shù)據(jù)庫。應用統(tǒng)計軟件STATA 7.0進行統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計結果均以P<0. 05作為差別有統(tǒng)計學意義的標準。ELISA檢測結果顯示，Igl全長重組蛋白和C-末端重組蛋白與20名健康人、59名溶組織內阿米巴感染者(包括29名阿米巴結腸炎患者(AC)、21名阿米巴肝膿腫患者(ALA)、 9名無癥狀阿米巴包囊攜帶者(ACP))、9名惡性瘧原蟲感染者(Pf)、6名剛地弓形蟲感染者(Tg),3名藍氏賈第鞭毛蟲感染者(Gla)和20名人芽囊原蟲感染者(Bh)血清的反應性，并與阿米巴粗抗原比較，結果如表1所示。阿米巴粗抗原與59名E. h感染者的血清反應均為陽性，敏感性為100% ；58例陰性對照(包括20名健康人和38名其他原蟲感染者)中只有1 例弓形蟲感染者血清與阿米巴粗抗原反應陽性，特異性為98% (如圖6所示)。以Igl全長重組蛋白作為抗原時，它與21名阿米巴肝膿腫患者和9名無癥狀包囊攜帶者血清反應為陽性，29名結腸炎患者中有1例血清反應為陰性，敏感性為98% ；58例陰性對照中僅有1名人芽囊原蟲感染者血清與全長Igl反應為陽性，特異性為98%(如圖7所示)。用C-末端重組蛋白作為抗原與血清反應的實驗中，三者與阿米巴病人血清反應0D490的讀數(shù)(平均值士標準差)為2. 00士 1.081。C-末端作為抗原，59名阿米巴感染者中只有一名阿米巴肝膿腫患者與它的反應為陰性，敏感性98%;陰性對照中只有一名藍氏賈第鞭毛蟲感染者血清與它的反應為陽性，特異性也是98% (如圖8所示)。 敏感性和特異性較高的Igl全長、C-末端重組蛋白ELISA的OD讀數(shù)分別與阿米巴粗抗原的ELISA結果相比較。兩者與粗抗原都存在線形相關性，Igl全長r=0. 8804， Ρ<0· 0001 (如圖 9 所示)；C-末端 r=0. 7969，Ρ<0· 0001 (如圖 10 所示)。
權利要求
1.溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，其特征在于，所述的多肽片段為溶組織內阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，150kDa的 Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因如SEQ ID No :1所示；所述的150kDa的Gal/ GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
2.權利要求1的溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段的制備方法，其特征在于，其包括步驟(1)從培養(yǎng)的溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體中提取總RNA，通過RT-PCR合成cDNA；(2)合成引物:EH150-S749-XH0 :5’ - CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3’EH150-AS1088-XH0 :5’ -CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT-3 ‘ ；(3)以cDNA為模板，通過PCR獲得150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端編碼基因片段；(4)將編碼基因克隆入原核表達載體中，轉化宿主菌，培養(yǎng)所得重組工程菌，然后誘導其表達目的蛋白；(5)采用緩沖液對150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的包涵體進行洗滌，將其提純后，采用谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其復性，獲得重組150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端多肽片段。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所分離的總RNA來源于溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端編碼基因如SEQ ID No 1所示。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，150kDa的Gal/GalNAc 可抑制性凝集素的C末端編碼基因，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表達載體不限于特定的表達載體， 只要它能夠與所述cDNA基因重組，形成適宜表達質粒。
7.根據(jù)權利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為原核表達載體。
8.根據(jù)權利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為pET19b。
9.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。
10.根據(jù)權利要求2或8所述的方法，其特征在于，所述的宿主細胞為大腸桿菌BL21 Star (DE3)pLysS0
11.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基是LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度是20 37°C，培養(yǎng)時間3 16小時。
12.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，菌體達到合適的濃度后用IPTG誘導表達，誘導條件為IPTG濃度為0. 1 ImM，誘導溫度為20 37°C，誘導時間為2 16小時。
13.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的最終產(chǎn)物通過下述方法純化將150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段表達工程菌在37°C誘導3小時后，離心收集菌體，置于冰上超聲裂解，然后加入溶菌酶30°C振搖30分鐘，離心，收集包涵體蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit對包涵體蛋白進行提純與復性后，HOOOrmp離心20分鐘，收集上清，冰箱保存。
14.權利要求1的溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制備與阿米巴病患者血清反應制劑中的用途。
15.權利要求1的溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制備溶組織內阿米巴粗抗原的血清診斷制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，涉及溶組織內阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段及其制備方法和應用。本發(fā)明從培養(yǎng)的溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體中提取總RNA，擴增出重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段的編碼基因，構建表達載體，轉入大腸桿菌誘導后，重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段以包涵體形式在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)洗滌后，獲得高純度的蛋白。以谷胱甘肽還原系統(tǒng)對其進行復性后，可獲得具有生物學活性的可溶性重組重組150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，可用于阿米巴病的血清學免疫診斷，克服阿米巴病診斷中糞檢溶組織內阿米巴的包囊和滋養(yǎng)體的漏檢與誤診，明顯提高阿米巴病診斷特異性和敏感性。
文檔編號C12N15/09GK102167747SQ20111000109
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權日2011年1月5日
發(fā)明者付永鋒, 橘裕司, 程訓佳 申請人:復旦大學