專利名稱：一種表達(dá)豬瘟病毒e0、e2基因的重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組腺病毒，尤其是一種能在同一腺病毒中表達(dá)豬瘟病毒EO基因和E2基因的重組腺病毒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟是一種傳染性非常強(qiáng)的傳染病，常給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性損失。目前，免疫接種仍是豬瘟防治的主要措施，而且是根除豬瘟病和阻止野毒傳向無(wú)豬瘟病豬群的必要手段。 豬瘟疫苗無(wú)論在過(guò)去、現(xiàn)在還是將來(lái)，對(duì)控制和消滅豬瘟病都具有極其重要的作用，各國(guó)學(xué)者對(duì)豬瘟疫苗的研制和開(kāi)發(fā)一直沒(méi)有放棄。傳統(tǒng)的豬瘟疫苗有滅活疫苗和弱毒疫苗，其中滅活苗免疫效力低，保護(hù)期短，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫力的速度慢，到目前為止，組織培養(yǎng)豬瘟毒的產(chǎn)量以及滅活疫苗所造成的病毒有效抗原的損失，仍是制造滅活疫苗的二大障礙；豬瘟弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用，對(duì)于控制豬瘟的流行起到了關(guān)鍵作用，但是弱毒疫苗也存在下列不足首先近年來(lái)豬瘟的流行特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，呈現(xiàn)周期性、波浪形的地區(qū)性散發(fā)和溫和性豬瘟病，發(fā)病后的臨床癥狀有無(wú)名高熱、癥狀不典型、持續(xù)性感染、出生仔豬先天性震顫和母豬繁殖性障礙，用傳統(tǒng)疫苗免疫常常造成免疫失敗，即使將劑量增加到750個(gè)兔體反應(yīng)(國(guó)家規(guī)定150個(gè)兔體反應(yīng))也不能預(yù)防其感染，而且有蔓延的趨勢(shì)，在妊娠早期接種疫苗還會(huì)發(fā)生疫苗毒通過(guò)胎盤(pán)感染胎兒，造成死胎或弱仔并成持續(xù)性帶毒者，產(chǎn)生新的疫源；其次，弱毒疫苗已經(jīng)沿用了近40年，豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化，說(shuō)明豬瘟病毒的抗原性可能存在著變異，特別是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用單克隆抗體對(duì)C-株檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有不同的反應(yīng)模式，表明經(jīng)過(guò)多年在不同細(xì)胞上的馴化，C-株已經(jīng)產(chǎn)生變異，這種流行毒株的變化趨勢(shì)國(guó)內(nèi)外情況基本一致，流行毒往往逃避免疫，導(dǎo)致免疫失敗的嚴(yán)重后果；第三，接種弱毒疫苗還會(huì)影響到國(guó)際貿(mào)易，歐盟已禁止使用豬瘟弱毒疫苗，而采用嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫制度， 撲殺豬瘟感染豬和血清學(xué)陽(yáng)性豬來(lái)控制和消滅豬瘟，采用撲殺政策需要大量的人力、物力和巨額資金，發(fā)展中國(guó)家是難以承受的，這就促使人們研究和開(kāi)發(fā)新型的豬瘟疫苗來(lái)防控本病。近年來(lái)，基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開(kāi)發(fā)提供了工具，目前， 豬瘟基因工程疫苗的研制已經(jīng)成為新的研究方向和熱點(diǎn)。人-5型腺病毒載體與其他動(dòng)物病毒載體相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起輕微的癥狀，腺病毒重組后，毒力進(jìn)一步降低，并且克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因隨機(jī)整合可能導(dǎo)致插入突變的潛在風(fēng)險(xiǎn)；其次是宿主范圍廣，腺病毒可感染多種細(xì)胞包括分裂與非分裂細(xì)胞；第三是穩(wěn)定，腺病毒粒子十分牢固，不易突變，并且容易大量制備并純化，得到高滴度的病毒，在體外可獲得IOllPfuAiL ；第四就是對(duì)于腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能目前研究得比較清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大，在基因治療構(gòu)建重組疫苗中大多采用缺失El和E3區(qū)基因的腺病毒載體，通常復(fù)制缺陷型腺病毒可容納約71Λ 81Λ的外源基因，比逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒的容量大很多；還有就是免疫途徑簡(jiǎn)便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接種簡(jiǎn)便，可口服或氣霧吸入而不需注射，并且經(jīng)口服后能產(chǎn)生局部黏膜免疫應(yīng)答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易推廣使
非復(fù)制型腺病毒不僅更安全有效，而且以低劑量的方式產(chǎn)生抗原蛋白而不裂解細(xì)胞，故表達(dá)抗原的時(shí)間更持久，有利于激發(fā)長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)。目前，已經(jīng)有多種產(chǎn)品已經(jīng)上市，例如“安柯瑞——重組人5型腺病毒注射液”；“重組人Y-干擾素腺病毒注射液 (ElOB) ”;“今又生(重組人p53腺病毒注射液)”;“人禽流感重組腺病毒疫苗臨床前安全評(píng)價(jià)方法的研究”取得階段性成果；“重組腺病毒-胸苷激酶基因制劑”；另外“豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒和疫苗”已經(jīng)被南京農(nóng)業(yè)大學(xué)申請(qǐng)專利。

發(fā)明內(nèi)容
為解決豬瘟弱毒疫苗長(zhǎng)期接種導(dǎo)致的病毒返祖、毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象和弱毒疫苗株與野毒發(fā)生重組等問(wèn)題，以及豬瘟病毒E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)存在的產(chǎn)量低和保護(hù)效果弱的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種能在同一腺病毒中表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒。本發(fā)明提供的是這樣一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)的Bgl II和KpnI酶切位點(diǎn)中插入豬瘟病毒EO基因， 在Bio I和^CbaI酶切位點(diǎn)中插入腺病毒CMV啟動(dòng)子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。所述豬瘟病毒為常規(guī)的市購(gòu)病毒，豬瘟病毒的EO基因在GenBank中的登錄號(hào)為 AF058715. 1，豬瘟病毒的E2基因在GenBank中的登錄號(hào)為AY775178. 2所述腺病毒為常規(guī)的市購(gòu)人-5型非復(fù)制型腺病毒。所述在腺病毒中同時(shí)分別表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，包括下列構(gòu)建步驟A.從市購(gòu)的豬瘟病毒和豬瘟病毒中分別擴(kuò)增出EO和E2基因；B.將步驟A獲得的豬瘟病毒EO基因通過(guò)BglII和KpnI酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO ；C.將步驟A獲得的豬瘟病毒E2基因通過(guò)Kpn I和Not I酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體PAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；D.將步驟C的腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2按常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出含有CMV啟動(dòng)子的CMV-E2基因，通過(guò)Biol I和)(ba I酶切位點(diǎn)插入至步驟B的腺病毒穿梭載體PAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位點(diǎn)中，形成重組腺病毒穿梭載體 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.將步驟D的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2經(jīng)RiieI酶切線性化后， 轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAd-easy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，形成重組腺病毒骨架載體 pAd-easy-E0-CMV_E2 ；F.將重組腺病毒骨架載體pAd-eaSy-E0-CMV-E2經(jīng)I3acI線性化后，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK293中，包裝出重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案獲得的重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2，能在同一腺病毒中分別表達(dá)豬瘟病毒EO蛋白和豬瘟病毒E2蛋白，解決了 E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)量低和保護(hù)效果弱的問(wèn)題，本發(fā)明僅通過(guò)一次免疫接種就能夠使免疫后的豬獲得對(duì)豬瘟病毒的抗體，對(duì)豬瘟具有較強(qiáng)的抵抗能力，生產(chǎn)成本是常規(guī)疫苗的一半，大大降低了疫苗成本。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2屬于非復(fù)制型病毒，在豬體內(nèi)不繁殖，解決了弱毒疫苗長(zhǎng)期接種導(dǎo)致的病毒返祖，毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2僅含有豬瘟病毒的主要保護(hù)基因，不含病毒的其它基因，因此，本發(fā)明提供的重組腺病毒與野毒株之間不會(huì)發(fā)生重組。采用上述方案構(gòu)建獲得的重組腺病毒制成的疫苗，免疫豬后對(duì)致死量100 倍TCID5tl的豬瘟病毒強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)效果為100%。既解決了豬瘟疫苗和豬瘟野毒同源重組后毒力返強(qiáng)的問(wèn)題，也解決了弱毒疫苗生產(chǎn)成本高的問(wèn)題。


圖1為ELISA檢測(cè)的豬瘟病毒抗體的水平。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例A.豬瘟病毒EO基因和E2基因的擴(kuò)增(I)PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)在豬瘟病毒EO基因的上、下游引物中分別加入Bgl II和Kpn I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述豬瘟病毒EO基因的上、下游引物分別設(shè)計(jì)為上游引物P1 5，-AAAAGATCTATGGAAAATATAACTCAATGG-3，下游引物P2 5，-CACGGTACCGTAAGGCGATAGGGCATAG-3，在豬瘟病毒E2基因的上、下游引物中分別加入Kpn I和NotI和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，所述豬瘟病毒E2基因的上、下游引物分別設(shè)計(jì)為上游引物P1 5，-AAAGGTACCATGAGGGGACAGATCGTGC-3，下游引物P2 :5，-CCC GCGCCCGCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3’(2)豬瘟病毒EO基因片段的體外擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化將含有豬瘟病毒EO基因的pMDIS-T-EO質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1 μ L為模板， 用豬瘟病毒EO基因的引物擴(kuò)增編碼EO蛋白的目的片段，其中PCR反應(yīng)體系如下模板IyL10XPCR 緩沖液5 μ L2. 5mmol/L dNTP5μ LEO 基因上游引物(50ymol/L)2yLEO 基因下游引物(50ymol/L)2yLEx Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 1 μ L滅菌去離子水；34 μ L反應(yīng)總體系為50 μ LPCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin,54°C lmin，72°C lmin，共；35 個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸10min，4°C儲(chǔ)存；將PCR產(chǎn)物置于8g/L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收豬瘟病毒EO基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)豬瘟病毒E2基因片段的體外擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化 將含有豬瘟病毒E2基因的pMD18-T-E2質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍，取1 μ L為模板，用豬瘟病毒E2基因的引物擴(kuò)增編碼E2蛋白的目的片段，其中PER反應(yīng)體系如下
模板l u L
10×PER緩沖液5 u L
2．5mm01／L dNTP5 u L
E2基因上游引物(50 u mol／L)2 u L
E2基因下游引物(50 u mol／L)2 u L
Ex Taq DNA聚合酶(5u／u L) l u L
滅菌去離子水34 u L
反應(yīng)總體系為50 u L
PER反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；94℃lmin，54℃lmin，72℃lmin 30see，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃儲(chǔ)存；將PER產(chǎn)物置于8g／L瓊脂糖凝膠，于60V電泳20min后切取目的條帶大小的片段，回收豬瘟病毒E2基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；
B．腺病毒穿梭載體pAd／rack—E0的構(gòu)建
(1)豬瘟病毒Eo基因的PER擴(kuò)增產(chǎn)物的Bgl II和Kpn工雙酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
E0基因PER產(chǎn)物15 u L
10×Buffer5 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。024 u L
總體積為50M1，充分混勻后瞬時(shí)離心
以37℃水浴6h后，用8g／L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；
(2)穿梭載體pAd／rack—CMV的Bgl II和Kpn工雙酶切
向1．5mL Eppendorf管中依次加入
pAd／rack—CMV質(zhì)粒l o u L
10×Buffer6 u L
Bgl II3 u L
Kpn工3 u L
H。038 u L
總體積為60 u L，充分混勻后，瞬時(shí)離心
以37℃水浴6h后，用8g／L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；
(3)豬瘟病毒Eo基因與穿梭質(zhì)粒載體pAd／rack—CMV的連接
連接反應(yīng)體系
E0基因片段 4 u L
pAdTrack—CMV2 u L
10×Bufferl u L
T4DNA連接酶l u L
H。03 u L
總體積為lo u L，充分混勻后瞬時(shí)離心
16 °C水浴連接過(guò)夜；(4)豬瘟病毒EO基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備將_70°C甘油保種的DH5a接種于不含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜， 挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落，接種于3mL新配置的不含抗生素的LB培養(yǎng)液中，370C 250r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，約14h;取100 μ L培養(yǎng)物，按1 100比例接種于IOOmL新鮮LB培養(yǎng)液中， 300r/min劇烈振蕩培養(yǎng)約3h，至OD6tltl為0. 6 ；無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移細(xì)菌培養(yǎng)物至兩個(gè)預(yù)冷的 50mL離心管中，冰浴IOmin ；4°C下1600r/min離心lOmin，棄上清，倒置離心管浙干液體，加入預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液10mL，懸浮菌體沉淀，置冰浴放置30min ；4°C下llOOr/min離心IOmin,棄上清，用2mL 0. lmol/L預(yù)冷的CaCl2 (含150mL/L甘油)重懸菌體，然后分裝于預(yù)冷的滅菌Eppendorf管中，每管100 μ L，置_70°C冰箱保存?zhèn)溆?；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取一管感受態(tài)細(xì)胞置于冰水混合物上，待完全融化后，將10 μ L的連接產(chǎn)物加入管中，輕輕混勻；冰浴30min ；42°C水浴中熱激90s ；冰浴^iin ；加入800 μ L LB培養(yǎng)基，37°C 下200 250r/min振蕩培養(yǎng)Ih ；8000r/min離心lmin，棄部分上清，存留100 μ L左右的上清重懸沉淀；取100 μ L混合物均勻涂布于含卡那霉素(50 μ g/mL)的LB瓊脂平板上，待完全吹干后，37°C培養(yǎng)過(guò)夜(12 16h)；挑取單菌落于3mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；堿裂解法提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定；將豬瘟病毒EO基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為腺病毒穿梭載體PAdTrack-EO ；C.腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2的構(gòu)建及CMV-E2片段的獲得(1)豬瘟病毒E2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Kpn I和Not I雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入E2 基因 PCR 產(chǎn)物 15 μ LIOXBuffer5μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2024 μ L總體積為50 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(2)穿梭載體 pAcTTrack-CMV 的 Kpn I 和 Not I 雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-CMV 質(zhì)粒 IOyLIOXBuffer6μ LKpn I3 μ LNot I3μ LH2O38 μ L總體積為60 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；0104](3)豬瘟病毒E2基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack-CMV的連接
0105]連接反應(yīng)體系
0106]E2基因片段 4μ L
0107]pAdTrack-CMV 2μ L
0108]IOXBuffer1 μ L
0109]T4DNA 連接酶1 μ L
0110]H2O3μ L總體積為10 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心16 °C水浴連接過(guò)夜；(4)豬瘟病毒E2基因和pAdTrack-CMV載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備同步驟B的(4)①；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將豬瘟病毒E2基因插入至穿梭載體pAdTrack-CMV中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為為 腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；OCMV-E2基因的獲得根據(jù)pAdTrack-E2載體中CMV啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增CMV-E2基因的引物上游引物P1 5，-AAACTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAAT-3，下游引物P2 5，-CACTCTAGAACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3，在CMV-E2基因的上、下游引物中分別加入)(ho I,XbaI和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)， 并在下游引物中引入終止密碼子；D.重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV_E2的構(gòu)建(1) CMV-E2基因PCR產(chǎn)物的Xho I和Xba I雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入CMV-E2 片段 PCR 產(chǎn)物 15 μ LIOXBuffer5μ LXho I3μ LXba I3 μ LΗ2024 μ L總體積為50 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(2)穿梭載體 pAdTrack-EO 的 Xho I 和 Xba I 雙酶切向1. 5mL Eppendorf管中依次加入pAdTrack-EO 質(zhì)粒 10 μ LIOXBuffer6μ LXho I3 μ LXba I3μ LH2O38 μ L
總體積為60 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心以37°C水浴他后，用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下含目的條帶的凝膠回收；(3) CMV-E2基因與穿梭質(zhì)粒載體pAdTrack_E0的連接連接反應(yīng)體系CMV-E2 基因片段 4 μ LpAdTrack-EO2μ LIOXBuffer1 μ LT4DNA 連接酶1 μ LH2O3μ L總體積為10 μ L，充分混勻后瞬時(shí)離心16 °C水浴連接過(guò)夜；(4) CMV-E2片段和pAdTrack_EO載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和鑒定①DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備同步驟B的(4)①；②重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將CMV-E2片段插入至穿梭載體pAdTrack-EO中構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為重組腺病毒穿梭載體 pAtTTrack-E0-CMV-E2 ；E.重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV_E2的構(gòu)建(1)重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2的線性化用RiieI對(duì)穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2酶切線性化，按如下所示分別加入各組分pAdTrack-E0-CMV-E2 25 μ LPmeI4μ L0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O51 μ L總體積為100 μ L置37°C水浴中Mi后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收；(2)線性化的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞同步驟B的(4)②；將重組后的腺病毒骨架載體命名為重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV-E2 ；F.重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的獲得(1)重組腺病毒骨架載體pAdEaSy-E0-CMV-E2的線性化、回收和純化用I^cI酶切使重組腺病毒骨架載體pAdEaSy-E0-CMV-E2線性化，酶切反應(yīng)體系為pAdeasy-E0-CMV-E2 25 μ LPac I5μ L
0. lg/L BSA10 μ LIOXBuffer 410 μ LH2O50 μ L總體積為100 μ L，置37°C水浴中他。在酶切后的產(chǎn)物中，加入2. 5體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/L NaAc,-20°C 沉淀lh，在4°C以12000r/min離心15min，棄去上清，加入70%乙醇洗一次，自然干燥后，加入 20 μ L H2O 溶解 DNA ；(2)重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的獲得將線性化的重組腺病毒骨架載體pAdEasy-E0-CMV-E2轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細(xì)胞HEK 293細(xì)胞中，具體操作按LipOfectamineTM2000產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；收獲的病毒液命名為重組腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 ；(3)重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2的擴(kuò)增及滴度測(cè)定按照噬斑法測(cè)定rAd-E0-CMV_E2在293細(xì)胞中傳至15代時(shí)的病毒滴度。本發(fā)明獲得的重組腺病毒rAd-E0-CMV_E2經(jīng)過(guò)下列試驗(yàn)1. rAd-E0-CMV-E2免疫保護(hù)性試驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將25頭豬隨機(jī)分為5組，第一組為rAd-E0-CMV_E2免疫組，5頭。第二組為豬瘟脾淋苗免疫組，5頭。第三組為融合表達(dá)E0-E2基因的重組腺病毒rAd-E0-E2免疫組，5頭。 第四組為非重組腺病毒免疫組，5頭。第五組為空白對(duì)照組，5頭。(2)免疫和攻毒重組腺病毒組和非重組腺病毒組的免疫劑量均為2. 4 X 109pfu (定量至2mL)，于頸部肌肉和腹部皮下多點(diǎn)注射；豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫方法和劑量按照疫苗實(shí)際使用劑量進(jìn)行免疫；空白對(duì)照用培養(yǎng)重組腺病毒的DMEM培養(yǎng)液免疫，2mL/頭。所有試驗(yàn)豬在免疫后的20d時(shí)用100倍TCID5tl豬瘟強(qiáng)毒肌肉注射、點(diǎn)眼、滴鼻和口服攻擊。(3)體溫檢測(cè)和臨床觀察所有試驗(yàn)豬從攻毒的第1天開(kāi)始測(cè)量體溫，以后每天測(cè)量體溫，觀察臨床癥狀。(4)血清抗體的檢測(cè)從免疫開(kāi)始和免疫后的每個(gè)星期采集血液，收集血清，用于豬瘟抗體的檢測(cè)，另一份加入抗凝劑，用于血液中豬瘟病毒的檢測(cè)。(5)攻毒后血液中病毒存在的檢測(cè)攻毒后隔天采集抗凝全血，用RT-PCR方法檢測(cè)血液中的豬瘟病毒。(6)病理觀察在攻毒后的14天，當(dāng)所有存活豬的臨床癥狀基本消失后，全部處死并進(jìn)行剖檢， 觀察下頌淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、膀胱以及心臟是否有病理變化。2.結(jié)果(1)體溫和臨床癥狀第一組(rAd-E0-CMV-E2免疫組)在免疫后沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀，在攻毒后第4 天，5頭免疫豬中1頭豬體溫達(dá)40°C以上，持續(xù)4 左右，第7天時(shí)左右體溫恢復(fù)正常。致死保護(hù)率為100%。第二組(豬瘟脾淋苗免疫組)在攻毒后的第4天，5頭免疫豬中1頭豬體溫達(dá)40°C 以上，持續(xù)7 左右，食欲稍微下降，在第8天體溫和食欲恢復(fù)正常。致死保護(hù)率為100%。第三組(融合表達(dá)E0-E2基因的重組腺病毒rAd-E0_E2免疫組)在免疫后沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀，在攻毒后第4天，5頭免疫豬中2頭豬體溫達(dá)40°C以上，持續(xù)7 左右，第 8天時(shí)左右體溫恢復(fù)正常。致死保護(hù)率為100%。第四組(非重組腺病毒免疫組)和第五組(空白對(duì)照組)的所有試驗(yàn)豬在攻毒后第1 2天體溫升至40°C以上，病豬便秘；第3天食欲減退，精神沉郁，有些病豬發(fā)生嘔吐， 很少采食，僅少量飲水，精神高度沉郁，四肢軟弱無(wú)力，行動(dòng)緩慢，搖擺不穩(wěn)，普遍拉稀，兩眼無(wú)神，有多量黏液膿性分泌物，腹下、耳和四肢內(nèi)側(cè)有出血點(diǎn)；第4天病豬伏臥不起，全身震顫，四肢呈游泳狀劃動(dòng)，體溫一直稽留在41°C左右。第5天開(kāi)始陸續(xù)死亡，至第7天全部死亡，死前體溫下降。死亡率為100%。體溫及死亡情況見(jiàn)表1。(2)抗豬瘟病毒和抗豬瘟病毒抗體的檢測(cè)用中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供的豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)所有試驗(yàn)豬的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。rAd-E0-CMV-E2免疫組的抗體呈上升趨勢(shì)，在攻毒前抗體OD63tl值分別達(dá)到 0. 696，攻毒后所有試驗(yàn)組的抗體水平都呈明顯的上升趨勢(shì)。rAd-E0-E2免疫組的抗體水平也呈上升趨勢(shì)，但在攻毒前抗體OD63tl值分別達(dá)到0. 595。豬瘟兔化弱毒苗免疫組的抗體水平在攻毒前的OD63tl最高值為0. 713。非重組腺病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組在攻毒前一直沒(méi)有檢測(cè)到抗體水平，但是在攻毒后臨死前能檢測(cè)到豬瘟抗體水平。圖1。表1不同疫苗免疫組CSFV強(qiáng)毒攻擊后體溫情況
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)的Bgl II和Kpn I酶切位點(diǎn)中插入豬瘟病毒EO基因，在Bio I和)(baI酶切位點(diǎn)中插入腺病毒CMV啟動(dòng)子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于所述豬瘟病毒為常規(guī)的市購(gòu)病毒，豬瘟病毒的EO基因在GenBank中的登錄號(hào)為AF058715. 1，豬瘟病毒的E2基因在GenBank中的登錄號(hào)為AY775178. 2
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于所述腺病毒為常規(guī)的市購(gòu)人-5型非復(fù)制型腺病毒。
4.一種如權(quán)利要求1所述的表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于包括下列構(gòu)建步驟A.從市購(gòu)的豬瘟病毒和豬瘟病毒中分別擴(kuò)增出EO和E2基因；B.將步驟A獲得的豬瘟病毒EO基因通過(guò)BglII和Kpn I酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO ；C.將步驟A獲得的豬瘟病毒E2基因通過(guò)KpnI和Not I酶切位點(diǎn)插入至腺病毒穿梭載體pAdTrack中，形成腺病毒穿梭載體pAdTrack-E2 ；D.將步驟C的腺病毒穿梭載體pAdTraCk-E2按常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出含有CMV 啟動(dòng)子的CMV-E2基因，通過(guò)Biol I和)(ba I酶切位點(diǎn)插入至步驟B的腺病毒穿梭載體pAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位點(diǎn)中，形成重組腺病毒穿梭載體 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.將步驟D的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-E0-CMV-E2經(jīng)RiieI酶切線性化后，轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架載體pAd-easy-Ι的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，形成重組腺病毒骨架載體 pAd-easy-E0-CMV-E2 ；F.將重組腺病毒骨架載體pAd-eaSy-E0-CMV-E2經(jīng)I^cI線性化后，轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞 HEK293中，包裝出重組腺病毒rAd-E0-CMV-E2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種表達(dá)豬瘟病毒E0、E2基因的重組腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)的Bgl II和Kpn I酶切位點(diǎn)中插入豬瘟病毒E0基因，在XhoI和Xba I酶切位點(diǎn)中插入腺病毒CMV啟動(dòng)子和豬瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。它解決了E0、E2基因融合串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)量低和保護(hù)效果弱的問(wèn)題，僅通過(guò)一次免疫接種就能夠使免疫后的豬獲得對(duì)豬瘟病毒的抗體，且生產(chǎn)成本是常規(guī)疫苗的一半，本重組腺病毒屬于非復(fù)制型病毒，在豬體內(nèi)不繁殖，解決了弱毒疫苗長(zhǎng)期接種導(dǎo)致的病毒返祖，毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象。本重組腺病毒僅含有豬瘟病毒的主要保護(hù)基因，不含病毒的其它基因，因此，與野毒株之間不會(huì)發(fā)生重組。用本重組腺病毒制成的疫苗，免疫豬后對(duì)致死量100倍TCID50的豬瘟病毒強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)效果為100％。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102181404SQ201110000978
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者孫永科, 楊玉艾 申請(qǐng)人:孫永科