專利名稱：預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種重型肝炎相關(guān)基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3啟動子甲 基化狀態(tài)信息及其應(yīng)用。具體涉及檢測與重型肝炎相關(guān)的基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3啟動 子甲基化狀態(tài)的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
慢加急性重型肝炎(ACLF)指已確診或未經(jīng)診斷的慢性肝炎患者病情急性發(fā)作， 表現(xiàn)為以黃疸和凝血障礙為主的肝損傷，4周內(nèi)并發(fā)腹水和(或)肝性腦病。西方國家重 癥肝炎以藥物、乙醇等中毒所致的急性肝衰竭為主，而我國的重癥肝炎則多由肝炎病毒，尤 其是乙型肝炎病毒(HBV)所致(約占70%)。我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)攜帶者約有9300萬例，其中約2000萬例為慢性乙型肝炎患者?；瘜W(xué)和生物毒物、 乙醇、藥物、HBV耐藥變異、免疫抑制劑、合并感染、Wilson病、自身免疫性肝病和妊娠等因 素可導(dǎo)致慢性HBV感染者急性發(fā)病，表現(xiàn)為慢加急性肝功能衰竭，稱為慢加急性重型乙型 病毒性肝炎(ACHBLF)。當(dāng)前，乙型肝炎的抗病毒治療已取得長足的進(jìn)展，但重型乙型肝炎的 發(fā)病率及病死率仍居高不下。該疾病病情兇險，發(fā)展迅猛，臨床上缺乏確定病情、判斷療效 和預(yù)后的評估體系，至今沒有有效的治療方法和干預(yù)手段，絕大部分患者預(yù)后不佳，嚴(yán)重威 脅患者的生命。因此，揭示乙型肝炎重癥化的機(jī)制，建立有效的針對性綜合評估體系和防治 手段尤為重要。乙型肝炎重癥化是多基因、多因素所致，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為，重癥乙 型肝炎發(fā)生和發(fā)展由宿主(如生物遺傳特征、細(xì)胞凋亡和壞死、免疫損傷機(jī)制等)和病毒 (如病毒復(fù)制、病毒變異、病毒基因型等)兩方面相互作用所影響。有研究表明，慢性HBV感 染的重癥化過程中表觀遺傳易感性發(fā)揮作用，表觀遺傳學(xué)漂移可以導(dǎo)致患者對疾病的易感 和轉(zhuǎn)歸不同，個體特征差異明顯。脫氧核糖核酸(DNA)甲基化是表觀遺傳的重要機(jī)制之一， 它指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，將一個甲基添加在DNA分子中的堿基胞嘧啶上， 形成5甲基胞嘧啶。甲基化主要發(fā)生在CpG序列上，其中，C代表胞嘧啶，P代表磷酸酯鍵， G代表鳥嘌呤。CpG島大小約500-1000bp，GC含量超過55 %，56%的編碼基因位于轉(zhuǎn)錄起 始區(qū)的重復(fù)序列含有CpG島。CpG島的甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)，DNA甲基化導(dǎo)致 基因沉默，相反，非甲基化一般與基因活化相關(guān)聯(lián)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，HBV進(jìn)入機(jī)體后可以 誘導(dǎo)宿主DNMT活性增加，DNMT催化病毒DNA啟動子甲基化，發(fā)揮抑制病毒的作用。另一方 面，病毒基因被甲基化的同時，活性增加的DNMT同時對宿主的某些基因進(jìn)行選擇性甲基化 修飾，導(dǎo)致人體某些基因啟動子CpG島被甲基化修飾，基因表達(dá)水平降低。重型肝炎患者氧化應(yīng)激可以加重肝臟損傷。另有研究表明慢性乙型病毒性肝炎、 慢性丙型病毒性肝炎、肝硬化、酒精性肝病患者生物抗氧化能力減弱，氧化損傷加重，與患 者肝損傷程度相關(guān)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是重要的II相代謝酶，主要催化谷胱甘肽和 親電性物質(zhì)之間的反應(yīng)，即促進(jìn)谷胱甘肽與毒性代謝產(chǎn)物結(jié)合，消除細(xì)胞內(nèi)自由基，減輕氧 化損傷。GST超家族主要分為α、μ、Ji、θ共4個亞家族，分別為GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。亞家族各成員參與不同化學(xué)物質(zhì)的代謝，但彼此間底物有部分重疊，其中GSTM的作用尤為 突出。研究表明，GSTM表達(dá)缺失是原發(fā)性肝癌、藥物誘導(dǎo)的肝損傷、酒精性肝硬化、非酒精 性脂肪肝、丙型肝炎慢性化的危險因素。GSTM3是GSTM亞家族的重要成員之一，其表達(dá)水平 與基因啟動子甲基化水平負(fù)相關(guān)。GSTM3啟動子高甲基化可以使GSTM3表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo) 致機(jī)體抗氧化能力降低，氧化損傷加重，肝功能受損?；谝陨涎芯浚景l(fā)明人首次提出了 GSTM3啟動子的甲基化與重型肝炎有關(guān)。對GSTM3啟動子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測可以應(yīng)用 于重癥肝炎患者提示預(yù)后及指導(dǎo)治療。 本發(fā)明采用的甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP-PCR)法是目前使用最廣泛的DNA 甲基化檢測方法，與其它甲基化檢測方法相比，其優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)本需要量；靈敏度高；實驗時間 較短，操作相對簡便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測重型肝炎相關(guān)基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 M3(GSTM3)啟動子甲基化狀態(tài)的試劑盒，以及簡便可行的檢測方法，其檢測結(jié)果為重型肝炎 的臨床診治提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，本試劑盒內(nèi)設(shè)有對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試 劑，針對人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3 (GSTiO)基因的啟動子甲基化特異性和非甲基化特異性的 引物對，以及 2XTaq PCR MasterMix 酶。為了方便應(yīng)用，本試劑盒內(nèi)還可以設(shè)有提取外周血單個核細(xì)胞DNA的試劑，這樣， 用一個試劑盒就可以做到由采血到重型肝炎相關(guān)基因GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)檢測的全 過程。為了便于質(zhì)控，本試劑盒內(nèi)還可以設(shè)有陽性對照和/或陰性對照。本試劑盒中所述的GSTM3啟動子的甲基化(M)特異性和非甲基化(U)特異性引物 對選自下組為
名稱序列編號
GSTM3 M-上游引物CGTACG GTT TTG TGG AGT C1 M-下游引物TCCGAA CCT TCG AAA ACT AA2
U-上游引物TTGTGT ATG GTT TTG TGG AGT T3
U-下游引物CTTCCA AAC CTT CAA AAA CTA AA4本試劑盒中，所設(shè)有的啟動子特異性引物對長度為15_40bp。本試劑盒中設(shè)有的對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑為亞硫酸氫鹽，聯(lián)苯 二酚和氫氧化鈉。本發(fā)明所述的外周血單個核DNA提取試劑為磷酸鹽緩沖液(PBS)，三羥甲基氨基 甲烷鹽酸(Tris -Cl)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸鈉(SDS)， 蛋白酶K，三羥甲基氨基甲烷-飽和酚，乙酸銨，乙醇。
2XTaq PCR MasterMix酶中含有耐熱聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷、氯化鎂、反應(yīng) 緩沖液、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)的增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑酶。本發(fā)明所述的檢測重型肝炎相關(guān)基因GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)的方法為提取外 周血單個核細(xì)胞DNA，對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾；將修飾后的DNA與甲基化(M)特 異性和非甲基化(U)特異性引物、2XTaq PCR MasterMix酶、雙蒸餾水進(jìn)行混合，使其進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，PCR后所擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為130-150bp，最后判斷GSTM3啟動 子甲基化狀態(tài)，得出檢測結(jié)果。綜合患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶 原活動度(PTA)、丙二醛(MDA)水平、終末期肝臟病模型(MELD)評分，提示存在GSTM3基因 啟動子甲基化的重癥肝炎患者，氧化損傷加重，肝功能受損嚴(yán)重，患者病情嚴(yán)重，預(yù)后不佳。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過對多例慢加急性肝衰竭(ACLF)、慢性乙型 病毒性肝炎(CHB)患者及正常人的外周血單個核細(xì)胞DNA多種基因啟動子的甲基化狀態(tài) 進(jìn)行分析，并與患者的肝功能指標(biāo)(ALT、TBIL、PTA)、氧化損傷指標(biāo)(MDA)、疾病預(yù)后指標(biāo) (MELD評分)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3基因的啟動子甲基化狀態(tài)與重癥 肝炎的發(fā)展存在密切關(guān)系，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明，以輔助診斷、提示預(yù)后及指導(dǎo)治療。本發(fā)明人已證明，重型肝炎患者GSTM3啟動子甲基化組終末期肝臟病模型評分高 于GSTM3啟動子非甲基化組及慢性乙型肝炎患者組。這一結(jié)果提示GSTM3啟動子區(qū)甲基化 可能通過加劇氧化應(yīng)激加重肝臟的損傷。對于慢加急性重型肝炎(ACLF)及慢性乙型病毒 性肝炎(CHB)患者的外周血單個核細(xì)胞DNA的GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)的分析有助于臨床 醫(yī)生鑒定慢乙肝患者中可能進(jìn)展為慢加急性肝衰竭的患者，提示預(yù)后和指導(dǎo)治療。


附圖顯示了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3(GSTM3)啟動子甲基化特異性PCR反應(yīng)擴(kuò)增的結(jié)果。
具體實施例方式本試劑盒內(nèi)設(shè)有對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑，針對人谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶M3 (GSTiO)基因啟動子甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對，以及2XTaq PCR MasterMix 酶。為了方便使用和進(jìn)行對比，本試劑盒內(nèi)還可以設(shè)有外周血單個核細(xì)胞DNA提取試 劑、陽性對照和/或陰性對照。這樣，不但可以只用一個試劑盒就完成做由采血到GSTM3基 因啟動子甲基化狀態(tài)檢測的全過程，而且，還可以準(zhǔn)確地進(jìn)行質(zhì)量控制，方便快捷的得出測 試結(jié)論。本發(fā)明所述的啟動子的甲基化(M)特異性和非甲基化(U)特異性引物對選自下組 為
名稱序列編號GSTM3M-上游引物CGTACGGTTTTGTGGAGTC 1M-下游引物TCCGAACCTTCGAAAACTAA 2U-上游引物TTGTGTATGGTTTTGTGGAGT T 3U-下游引物CTTCCAAACCTTCAAAAACTA AA 4本試劑盒中，所設(shè)有的啟動子特異性引物對長度為15_40bp。本發(fā)明所述的對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑為亞硫酸氫鹽，聯(lián)苯二 酚和氫氧化鈉。本發(fā)明所述的外周血單個核DNA提取試劑為磷酸鹽緩沖液(PBS)，三羥甲基氨基 甲烷鹽酸(Tris -Cl)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸鈉(SDS)， 蛋白酶K，三羥甲基氨基甲烷-飽和酚，乙酸銨，乙醇。2XTaq PCR MasterMix酶中含有耐熱聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷、氯化鎂、 反應(yīng)緩沖液、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)的增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑酶，2XTaq PCR MasterMix酶為市場出售產(chǎn)品。本發(fā)明所述的檢測GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)的具體方法如下(其中，未注明具體 條件的實驗方法按照常規(guī)的實驗條件和方法，或按照制造廠商所建議的條件)DNA 的提取抽取慢加急性重型肝炎(ACLF)患者外周靜脈血后，可以使用試劑盒中的提取DNA 的試劑按照下列步驟提取患者的DNA，也可以用其他方法提取DNA。(1)準(zhǔn)備試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris · Cl)，乙二胺 四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸鈉(SDS)，蛋白酶K，三羥甲基氨基甲 烷-飽和酚，乙酸銨，乙醇。(2) DNA 提取緩沖液的配制10mmol/L Tris 'C1,0. lmol/L EDTA, 20 μ g/ml 胰 RNA 酶，0. 5% SDS ；(3)TE 緩沖液的配制:10mmol/L Tris · Cl, lmol/L EDTA ；(4)將20ml血液以1300Xg離心力離心15分鐘，棄上清，小心吸出淡黃色下層至 一新離心管中，1300Xg離心力離心15分鐘，棄去上層血漿，用10-15ml DNA提取緩沖液懸 浮下層白細(xì)胞，37°C放置1小時；(5)加入20mg/ml蛋白酶K，使終濃度為100 μ g/ml,同時用玻璃棒輕輕攪拌，使溶 液粘稠；(6) 50°C放置3小時，期間不時輕輕搖勻反應(yīng)液；(7)冷卻至室溫后，在反應(yīng)液中加入等容積的三羥甲基氨基甲烷-飽和酚，上下顛 倒混勻10分鐘；(8)室溫5000 X g離心力離心15分鐘，用吸管小心吸出上層水相，移至另一離心管中，重復(fù)步驟(7)、(8)；(9)沉淀DNA，上層水相中加入0. 2倍容積的lOmol/L乙酸銨和2倍容積的95%乙 醇，輕慢搖動混勻，即可見乳白色絲狀DNA沉淀，2-8°C條件下5000 X g離心5分鐘，棄上清 液；(10)室溫放置5-15分鐘晾干DNA，按每5 X 106個細(xì)胞DNA提取物加入ImlTE緩 沖液溶解DNA。獲得樣本外周血單個核細(xì)胞提取的DNA。重型肝炎相關(guān)基因GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)的檢測1、對DNA進(jìn)行甲基化修飾(1)取樣本外周血單個核細(xì)胞提取的DNA 2μ g，置于1. 5ml的EP管中，使用雙蒸 水稀釋至50 μ 1 ；(2)力卩5. 5 μ 1新鮮配制的3mol/L氫氧化鈉，42°C水浴30分鐘；(3)加30 μ 1濃度lOmmol/L的聯(lián)苯二酚至上述水浴后混合液中；(4)配制3. 6mol/L亞硫酸氫鈉，方法如下1. 88g亞硫酸氫鈉使用雙蒸水稀釋，并 以3mol/L氫氧化鈉滴定溶液至pH 5. 0，最終體積為5ml，加520 μ 1至上述水浴后溶液中；(5)EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液，加200 μ 1石蠟油，防止水分蒸 發(fā)，限制氧化，50°C避光水浴16小時；(6)分光光度計法測DNA濃度和純度，保存于_20°C。2、甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)檢測GSTM3啟動子甲基化狀態(tài)分別用甲基化特異性或非甲基化特異性引物對，對處理過的DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)，其中陰性對照是將體系中DNA底物替換為雙蒸水，陽性對照是將體系中DNA底 物替換為陽性對照DNA (商品化DNA陽性對照)，濃度為10-20ng/y 1。反應(yīng)體系如下表甲基化特異性PCR反應(yīng)體系
試劑加入量
2XTaq PCR MasterMix12. 5μ 1
上游引物(10ymol/L)0. 5μ 1
下游引物(ΙΟμπιοΙ/L)0. 5μ 1
DNA 底物(10-20ng)1. 5μ 1
雙蒸餾水10 μ 1
其中，上游引物和下游引物指的是啟動子的甲基化(M)特異性和非甲基化(U)特異性引物對，即前面所述的M-上游引物、M-下游引物；U-上游引物、U-下游引物。
反應(yīng)條件如下加熱至95°C，保溫5分鐘，共1個循環(huán)；加熱至95°C，保溫30秒，在
55-600C的溫度下，退火45秒，720C 30秒，40個循環(huán)；72°C 10分鐘1個循環(huán)；使甲基化特 異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)后所擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為130-150bp，1. 5% 瓊脂糖電 泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，獲取檢測結(jié)果。實際檢測舉例檢測樣本包括一名健康人外周血單個核細(xì)胞DNA樣本；一名慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者外周血單個核細(xì)胞DNA樣本；一名慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周血單個核 細(xì)胞DNA樣本；雙蒸水；陽性對照DNA樣本。MSP-PCR擴(kuò)增后，得到擴(kuò)增結(jié)果，圖中，1_健康人非甲基化引物擴(kuò)增條帶⑶；2_慢 性乙型病毒性肝炎(CHB)患者非甲基化引物擴(kuò)增條帶(U) ；3-慢加急性肝衰竭(ACLF)患者 甲基化引物擴(kuò)增條帶(M) ；4-陽性對照組甲基化引物擴(kuò)增條帶(M) ；5-陽性對照組非甲基 化引物擴(kuò)增條帶(U)。在甲基化與非甲基化特異性引物條件下健康人和慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患 者一般可見非甲基化引物擴(kuò)增條帶(U)，上述兩組未見甲基化引物擴(kuò)增條帶(M)。慢加急性 肝衰竭(ACLF)患者組可見明顯甲基化引物擴(kuò)增條帶(M)。試驗中陰性對照組應(yīng)無任何引物 擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，陽性對照組甲基化(M)與非甲基化⑶引物擴(kuò)增條帶均應(yīng)出現(xiàn)，陽性對照與 陰性對照作為本發(fā)明的質(zhì)量控制，若陽性對照與陰性對照未出現(xiàn)上述相應(yīng)結(jié)果，則表示實 驗過程或操作有誤。
權(quán)利要求
1.預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在于盒內(nèi)設(shè)有對基因組 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑，針對人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3基因的啟動子甲基化特異性 和非甲基化特異性的引物對，以及2XTaq PCR MasterMix酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測的試劑盒，其特征在 于盒內(nèi)還設(shè)有外周血單個核細(xì)胞DNA提取試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在 于盒內(nèi)還設(shè)有陽性對照和/或陰性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在 于盒內(nèi)啟動子的甲基化(M)特異性和非甲基化(U)特異性引物對選自下組為
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在 于所述盒內(nèi)設(shè)有的啟動子特異性引物對的長度為15-40bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在 于盒內(nèi)設(shè)有的對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑為亞硫酸氫鹽，聯(lián)苯二酚和氫氧 化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測試劑盒，其特征在 于所述的盒內(nèi)的外周血單個核細(xì)胞DNA提取試劑為磷酸鹽緩沖液(PBS)，三羥甲基氨基甲 烷鹽酸(Tris <1)，乙二胺四乙酸(EDTA)，胰核糖核酸(RNA)酶，十二烷基硫酸鈉(SDS)，蛋 白酶K，三羥甲基氨基甲烷-飽和酚，乙酸銨，乙醇。
8.預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測方法，其特征在于亞硫酸氫鹽修飾提取得 病人外周血單個核細(xì)胞DNA后，分別用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Μ3甲基化(M)特異性和非甲基化 (U)特異性引物對進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后所 擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為130-150bp，最后檢測各基因啟動子甲基化狀態(tài)，得出檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)測重型肝炎病情基因甲基化狀態(tài)檢測方法及試劑盒，它設(shè)有對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾的試劑，針對人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3基因啟動子的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對，以及2×Taq PCRMasterMix，提取病人外周血單個核細(xì)胞DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后，分別用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M3甲基化(M)特異性和非甲基化(U)特異性引物對進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物判斷其甲基化狀態(tài)，有助于臨床醫(yī)生判定重型肝炎患者的病情和指導(dǎo)治療。
文檔編號C12Q1/68GK102140535SQ201110001339
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者張建軍, 戚麗, 王麗媛, 王凱, 范曉鵬, 范玉琛, 韓婕 申請人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院