一種利用Ppd-B1基因甲基化選育小麥的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種利用Ppd-B1基因甲基化選育小麥的方法，本發(fā)明從DNA甲基化方面對小麥Ppd-B1基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)小麥Ppd-B1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平在多樣性小麥品種中存在多態(tài)性，甲基化程度較高的類型抽穗較早，甲基化程度較低的類型抽穗較晚，并且小麥Ppd-B1基因甲基化水平與表達(dá)量呈正相關(guān)。本發(fā)明公開了擴(kuò)增SEQ?ID?No.10所示的DNA分子的引物。小麥Ppd-B1基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化檢測可以應(yīng)用于小麥育種中。
【專利說明】-種利用Ppd-B1基因甲基化選育小麥的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種選育小麥的方法；特別涉及一種利用Ppd-Bl基因甲基化選育小 麥的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變過程。植物的開花時(shí)間受外在因素和內(nèi) 在因素的共同調(diào)控（雍偉東等，2000 ;Bernier et al.，1981 ;Lang et al.，1965 ;Thomas et al.，1997)。光周期（日照長度）是影響植物開花時(shí)間的環(huán)境因素之一。植物對晝夜相對 長度作出反應(yīng)的現(xiàn)象稱為光周期現(xiàn)象（photoperiodism)。植物對光周期的敏感程度決定其 開花時(shí)間及對外界環(huán)境的適應(yīng)能力。小麥（Triticum aestivum L.)是重要的糧食作物，培 育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種對解決全球糧食問題具有重要意義。在小麥"綠色革命"中，矮桿、抗銹 病和由對光周期不敏感特性而決定的大面積適應(yīng)能力是高產(chǎn)小麥的重要特征（Borlaug et al.，1983)。深入研究控制小麥光周期不敏感位點(diǎn)形成的機(jī)理并將其作用于實(shí)踐，對于提高 小麥對環(huán)境的適應(yīng)性，擴(kuò)大引種范圍都具有重要意義。
[0003] 表觀遺傳學(xué)（epigenetics)主要研究在DNA序列沒有發(fā)生變異的情況下，基因功 能發(fā)生改變，并且這種改變又可隨細(xì)胞的有絲分裂和/或減數(shù)分裂遺傳下去的現(xiàn)象（Wu et al.，2001)。表觀遺傳變異主要通過對DNA和組蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等共價(jià)修飾 以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化來實(shí)現(xiàn)。DNA甲基化（DNA methylation)是真核生物基因組中最常見 的一種DNA共價(jià)修飾形式，是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。DNA甲基化作為一種保守的 表觀遺傳修飾現(xiàn)象，參與了許多重要的生物學(xué)進(jìn)程，包括異染色質(zhì)形成、阻止轉(zhuǎn)座子增殖、 基因組印記、調(diào)控內(nèi)源性基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因沉默等。它通常發(fā)生在CG二核苷酸序列上， 盡管在植物中的CHG和CHH位點(diǎn)上也發(fā)生了相當(dāng)程度的甲基化。DNA甲基化參與了植物體 的許多生物學(xué)過程，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
[0004] 甲基轉(zhuǎn)移酶I (MET I，methyltransferase I)家族在甲基化酶中占主導(dǎo)地位。METI 家族的主要功能是維持重復(fù)和單拷貝DNA序列的甲基化，將親代胞嘧啶甲基化模式傳遞到 新復(fù)制的子鏈中，但也可能在重新甲基化中起一定的作用。該酶大多數(shù)在CG序列進(jìn)行甲 基化，在CHG(H為除G之外的任何堿基）序列也可以甲基化DNA(Finnegan et al.，2000)。 第二種甲基轉(zhuǎn)移酶是染色質(zhì)甲基化酶（chromomethylase，CMT)，廣泛分布于植物中，為植 物所特有的甲基化轉(zhuǎn)移酶。該酶在異染色質(zhì)區(qū)催化DNA序列發(fā)生甲基化。CMT甲基化酶甲 基化的序列為CHG，所以人們認(rèn)為異染色質(zhì)甲基化酶是CHG三核苷酸甲基化酶（Genger et al.，1999)。重新甲基化酶（de novo methyltransferases)主要催化胞啼陡的重新甲基 化，結(jié)構(gòu)上類似于哺乳動(dòng)物的Dnmt3(DNA methyltransferase3)甲基化酶。其特異性在植 物DNA序列中的CHG和CHH處發(fā)生甲基化。
[0005] Ppd-Bl基因是小麥重要光周期基因。前人研究表明，拷貝數(shù)變異是造成Ppd-Bl不 敏感位點(diǎn)形成的原因。但是對于該基因，表觀遺傳修飾方面還未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用Ppd-Bl基因甲基化選育小麥的方法，本發(fā)明從DNA 甲基化方面對小麥Ppd-Bl基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)小麥Ppd-Bl基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水 平在小麥品種中存在多態(tài)性，甲基化程度較高的小麥抽穗較早，甲基化程度較低的小麥抽 穗較晚，并且小麥Ppd-Bl基因甲基化水平與該基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。
[0007] 本發(fā)明提供擴(kuò)增SEQ ID No. 10所示的DNA分子的引物。
[0008] 上述引物中，所述引物為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子。
[0009] 一種鑒定或輔助鑒定小麥Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低的試劑盒也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒含有上述任一所述的引物；
[0010] 所述試劑盒還包含使用說明書，說明書中記載內(nèi)容如下：以經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 后的小麥基因組DNA為模板，以上述任一所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BsrBI酶切，若酶切產(chǎn)物為312bp的單一條帶，則待測小麥為甲基 化低類型，若酶切產(chǎn)物為150bp和162bp兩種帶型，則待測小麥為甲基化高類型，若酶切產(chǎn) 物為150bp、162bp和312bp三種帶型，則待測小麥為甲基化雜合類型；
[0011] 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平：
[0012] (1)區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的 甲基化水平；
[0013] (2)區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平；
[0014] (3)區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平；
[0015] 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位 點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
[0016] 一種鑒定或輔助鑒定待測小麥Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低的方法也屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍，是以經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的待測小麥基因組DNA為模板，以上述任 一所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BsrBI酶切，若 酶切產(chǎn)物為312bp的單一條帶，則待測小麥為甲基化低類型，若酶切產(chǎn)物為150bp和162bp 兩種帶型，則待測小麥為甲基化高類型，若酶切產(chǎn)物為150bp、162bp和312bp三種帶型，則 待測小麥為甲基化雜合類型；
[0017] 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平：
[0018] (1)區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的 甲基化水平；
[0019] (2)區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平；
[0020] (3)區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平；
[0021] 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位 點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向；
[0022] 所述BsrBI酶切識(shí)別序列包含Ppd-Bl基因的第-1100位和-1099位的CpG位點(diǎn)， 以Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
[0023] 所述酶切的條件具體為37°C，3h。
[0024] -種輔助比較小麥抽穗期早晚的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是根據(jù)小麥的 Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低進(jìn)行比較的，如果A種小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化 水平高于B種小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平，那么A種小麥候選為抽穗期早于B種 小麥的小麥；
[0025] 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平：
[0026] (1)區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的 甲基化水平；
[0027] (2)區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平；
[0028] (3)區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平；
[0029] 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位 點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
[0030] 上述方法中，所述小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低的判斷方法為上述 方法；
[0031] 所述甲基化水平高是指上述方法中所述的甲基化高類型；
[0032] 所述甲基化水平低是指上述方法中所述的甲基化低類型。
[0033] 上述任一所述的引物、上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定小麥Ppd-Bl基因區(qū)域II甲 基化水平高低中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0034] 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位 點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
[0035] 上述任一所述的引物、上述試劑盒在輔助比較小麥抽穗期早晚或小麥選育中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036] 上述方法在輔助比較小麥抽穗期早晚和/或小麥選育中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0037] 上述任一所述的方法在小麥選育中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038] 小麥Ppd-Bl基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化檢測可以應(yīng)用于小麥育種中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為甲基化單倍型a和b總體甲基化水平和單個(gè)位點(diǎn)甲基化水平比較。
[0040] 圖2為Ppd-Bl基因在31份不同甲基化單倍型的春性小麥材料中的相對表達(dá)量。
[0041] 圖3為31份春性小麥品種CG甲基化水平與Ppd-Bl表達(dá)量的相關(guān)性分析。
[0042] 圖4為"復(fù)壯30 X偃展1號"重組自交系F7代Ppd-Bl表達(dá)高峰點(diǎn)的相對表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 光周期不敏感材料中國春（Chinese Spring) (Triticum aestivum L.)在文獻(xiàn) "Guo Z, Song Y, Zhou R, Ren Z, Jia J. 2010. Discovery, evaluation and distribution of haplotypes of the wheat Ppd-Dl gene.New Phytologist，85(3):841_851"中公開過，公 眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0046] 光周期敏感材料 Renan (Triticum aestivum L.)在文獻(xiàn) "Dedryver F, Paillard S, Mallard S, Robert 0, Trottet M, Negre S,Verplancke G, Jahier J. 2009. Characterization of genetic components involved in durable resistance to stripe rust in the bread wheat'Renan'.Phytopathology，99(8) :968-973.，'中公開過，公眾可從 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。
[0047] EZ DNA Methylation-Gold? Kit 試劑盒購自美國 ZYMO RESEARCH 公司，產(chǎn)品目錄 號為D5005。
[0048] pEASY-TICloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為 CT101-2。
[0049] 實(shí)施例中表4、表5和表8所示的燕大1817 Yadal817、新克旱9號Xinkehan9、 火球Huoqiu、小白麥Xiaobaimai等所有品種的小麥在文獻(xiàn)"Guo Z，Song Y，Zhou R，Ren Z,Jia J.2010.Discovery, evaluation and distribution of haplotypes of the wheat Ppd-Dl gene.New Phytologist，85(3):841_851.""Sun QM，Zhou RH，Gao LF，Zhao GY, Jia JZ. 2009. The characterization and geographical distribution of the genes responsible for vernalization requirement in Chinese bread wheat. J Integr Plant Biol. 51 (4) :423-432.，'"Wenping Zhang, Lei Zhang, Linyi Qiao, Jing ffu, Guangyao Zhao, Ruilian Jing, ffenyan Lv, Jizeng Jia. 2013. Cloning and haplotype analysis of TaSTE, which is associated with plant height in bread wheat(Triticum aestivum L.). Molecular Breeding, 31 (1) : 47-56"中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研 究所獲得。
[0050] 下述實(shí)施例中的甲基化單倍型分類使用Cluster 3. 0 & Java TreeView軟件 (Stanford University, USA)。皮爾森相關(guān)性分析（Pearson correlations)和單因素方差 分析（One-way AN0VA)使用 SPSS15. 0 軟件（SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)。
[0051] 實(shí)施例l、Ppd-Bl基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平分析以及甲基化單倍型分類方法
[0052] -、根據(jù)普通六倍體小麥品種中國春Ppd-Bl基因序列（GenBank:DQ885757. 1)，對 其起始密碼子ATG上游?3kb及下游?2kb的區(qū)域進(jìn)行CG含量分析（Ppd-Bl基因 CG島信 息由"The Li Lab"在線預(yù)測獲得（ http://urogene.org/))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該?5kb范圍內(nèi)共 存在4個(gè)CG含量較高的區(qū)域（CpG島，CpG island)，依次定義為CpG島1-4。
[0053] CpG島1(-2900?-2721，以翻譯起始位點(diǎn)為"1"）位于Ppd-Bl啟動(dòng)子區(qū)域，長度約 180bp，CG含量為 52.22%。CpG島2(-1163?-369)同樣位于啟動(dòng)子區(qū)域，長度約 795bp， CG含量為63. 90%。CpG島3 (-361?507)橫跨啟動(dòng)子至第二內(nèi)含子區(qū)域，長度約868bp，CG 含量為57. 72%。CpG島4(518?651)橫跨第二內(nèi)含子至第三外顯子區(qū)域，長度約134bp， CG含量為51.49 %。其中CpG島2的CG含量最高，其次為CpG島3, CpG島1、4的CG含量 略低，Ppd-BICpG島1-4概況如表1所示。
[0054] 表 1 Ppd-BICpG 島 1-4 概況
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 擴(kuò)增SEQ ID No. 10所示的DNA分子的引物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示的DNA分子。
3. -種鑒定或輔助鑒定小麥Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低的試劑盒，該試劑盒 含有權(quán)利要求1或2所述的引物； 所述試劑盒還包含使用說明書，說明書中記載內(nèi)容如下：以經(jīng)過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的 小麥基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BsrB I酶切，若酶切產(chǎn)物為312bp的單一條帶，則待測小麥為甲 基化低類型，若酶切產(chǎn)物為150bp和162bp兩種帶型，則待測小麥為甲基化高類型，若酶切 產(chǎn)物為150bp、162bp和312bp三種帶型，則待測小麥為甲基化雜合類型； 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平： (1) 區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的甲基 化水平； (2) 區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平； (3) 區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平； 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為 第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
4. 一種鑒定或輔助鑒定待測小麥Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低的方法，是以經(jīng) 過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的待測小麥基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2所述的引物為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BsrB I酶切，若酶切產(chǎn)物為312bp 的單一條帶，則待測小麥為甲基化低類型，若酶切產(chǎn)物為150bp和162bp兩種帶型，則待測 小麥為甲基化高類型，若酶切產(chǎn)物為150bp、162bp和312bp三種帶型，則待測小麥為甲基化 雜合類型； 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平： (1) 區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的甲基 化水平； (2) 區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平； (3) 區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平； 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為 第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向； 所述BsrBI酶切識(shí)別序列包含Ppd-Bl基因的第-1100位和-1099位的CpG位點(diǎn)，以 Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。 所述酶切的條件具體為37°C，3h。
5. -種輔助比較小麥抽穗期早晚的方法，是根據(jù)小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水 平高低進(jìn)行比較的，如果A種小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高于B種小麥的Ppd-Bl 基因區(qū)域II甲基化水平，那么A種小麥候選為抽穗期早于B種小麥的小麥； 所述區(qū)域II甲基化水平是指如下（1)-(3)任一所示的甲基化水平： (1)區(qū)域II的總甲基化水平，即CpG二核苷酸序列、CpHpG和CpHpH核苷酸序列的甲基 化水平； (2) 區(qū)域II的CpG二核苷酸序列的甲基化水平； (3) 區(qū)域II的CpHpG核苷酸序列的甲基化水平； 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為 第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述小麥的Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水 平高低的判斷方法為權(quán)利要求4所述的方法； 所述甲基化水平高是指權(quán)利要求4中所述的甲基化高類型； 所述甲基化水平低是指權(quán)利要求4中所述的甲基化低類型。
7. 權(quán)利要求1或2所述的引物、權(quán)利要求3所述的試劑盒在鑒定或輔助鑒定小麥 Ppd-Bl基因區(qū)域II甲基化水平高低中的應(yīng)用； 所述區(qū)域II是Ppd-Bl基因的第-1250至第-939位，以Ppd-Bl基因的翻譯起始位點(diǎn)為 第1位，-代表翻譯起始位點(diǎn)上游方向。
8. 權(quán)利要求1或2所述的引物、權(quán)利要求3所述的試劑盒在輔助比較小麥抽穗期早晚 或小麥選育中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求4所述的方法在輔助比較小麥抽穗期早晚和/或小麥選育中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求5或6所述的方法在小麥選育中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087581SQ201410330636
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】賈繼增, 孫晗, 高麗鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所