專利名稱：一種提高植物產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高植物產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
隨著人口的不斷增加，耕地的逐漸減少，如何提高作物產(chǎn)量已經(jīng)成為一個世界性的、汲待解決的重大問題。植物器官大小直接關(guān)系到植物的產(chǎn)量。器官大小不僅受環(huán)境因素影響，而且受內(nèi)源基因的調(diào)控。所以，研究植物體如何實(shí)現(xiàn)自身對器官大小的控制已經(jīng)成為提高作物產(chǎn)量的重要策略之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種提高植物產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所提供的提高植物產(chǎn)量的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ IDNO 1所示蛋白質(zhì)的編碼基因，得到與所述出發(fā)植物相比產(chǎn)量提高的目的轉(zhuǎn)基因植物。上述提高植物產(chǎn)量的方法中，所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體是向出發(fā)載體PMDC32中(具體可以是載體上的重組位點(diǎn)間)插入所述編碼基因得到的。上述提高植物產(chǎn)量的方法中，所述SEQ ID NO :1所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ IDNO 2 所示。上述提高植物產(chǎn)量的方法中，所述出發(fā)植物為雙子葉植物。上述提高植物產(chǎn)量的方法中，所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)0上述提高植物產(chǎn)量的方法中，所述產(chǎn)量為植物的單株種子重量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法。本發(fā)明所提供的改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ ID NO :1所示蛋白質(zhì)的編碼基因，得到與所述出發(fā)植物相比與產(chǎn)量相關(guān)表型得到改善的目的轉(zhuǎn)基因植物。上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體是向出發(fā)載體PMDC32中(具體可以是載體上的重組位點(diǎn)間)插入所述編碼基因得到的。上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述與產(chǎn)量相關(guān)表型得到改善為如下 1)-6)中至少一種1)與出發(fā)植物相比，葉片數(shù)目增加；2)與出發(fā)植物相比，葉片的面積增加；3)與出發(fā)植物相比，花瓣的大小變大；4)與出發(fā)植物相比，角果長度增加；5)與出發(fā)植物相比，每個角果里的種子數(shù)目增加；
6)與出發(fā)植物相比，種子重量增加；7)與出發(fā)植物相比，種子長度增加。上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述SEQ ID NO 1所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ ID NO :2所示；上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述葉片數(shù)目為基生葉的數(shù)目和/或莖生葉的數(shù)目；上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述花瓣的大小變大為如下中的至少一種花瓣的長度變長、花瓣的寬度變寬和花瓣的面積變大；上述改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法中，所述出發(fā)植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。SEQ ID NO 2所示基因在提高植物產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQ ID NO 1所示蛋白質(zhì)在提高植物產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗證明，本發(fā)明方法通過過表達(dá)STONl能夠促進(jìn)植物生長，形成較多的葉片、較大的花瓣和較長的角果，并且能夠增加種子重量和單株產(chǎn)量。本發(fā)明在農(nóng)作物高產(chǎn)育種中具有極大的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。


圖1為轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型植株表型分析。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。pCR8/Gff/T0P0 TA 克隆載體購自 invitrogen，產(chǎn)品目錄號為 K2500-20。一、STONl編碼基因的獲得1、提取總RNA及反轉(zhuǎn)錄在液氮中研碎新鮮的擬南芥(Arabidopsis thaliana)花序，以植物RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總RNA，用分光光度計(Eppendorf公司，德國)檢測樣品濃度。取5μ g總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到cDNA。2、STONl編碼序列的獲得以步驟1得到的cDNA為模板，用引物對STCMlCDS-F/STCMlCDS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ST0N1CDS-F :5，-ATGTCTGCTCCTTCTGGCGGT ；ST0N1CDS-R :5，-TTAGAAAGCTAAACAACAAGG。50 μ 1 PCR 反應(yīng)體系為5μ 1 KOD plus buffer,2 μ 1 MgS04、5y 1 dNTP 混合物、 0. 2μΜ 引物 STOmCDS-F 和 0. 2μΜ 引物 ST0mCDS-R、ly 1 的 KOD plus 聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)。PCR循環(huán)為94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C 15秒，55°C 30秒，68°C 1分鐘，共32個循環(huán)； 最后68°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后加入0. 2μ 1 rTaq(寶生物(大連)有限公司)，72°C反應(yīng) 30分鐘加A。在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)回收約750bp的片段，連接到pCR8/GW/T0P0 TA克隆載體，并測序驗證(北京諾賽基因組研究中心有限公司)。測序表明，亞克隆(命名為T0P0ST0N1)在載體pCR8/GW/T0P0 TA中插入了 SEQ ID NO :2所示基因。該基因為STONl基因，⑶S全長756bp (SEQ ID NO :2)，編碼一個251個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO :1)。二、重組植物表達(dá)載體35S: STONl的構(gòu)建pMDC32載體購自hvitrogen，這是一個GATEWAY系統(tǒng)的植物表達(dá)載體。PMDC有一系列載體，是hvitrogen公司利用重組技術(shù)開發(fā)的一套Gateway載體，優(yōu)點(diǎn)是不需要設(shè)計酶切接頭，不需要酶切連接。LR enzyme mix 購自 Invitrogen01)小量提取測序正確的亞克隆(命名為T0P0ST0N1)和pMDC32的質(zhì)粒DNA。2) LR 反應(yīng)。體系T0P0ST0N1 50ng, pMDC32 150ng, LR enzyme mix 1 μ 1, TEbuffer (PH8. 0)補(bǔ)足到10 μ 1。室溫反應(yīng)2小時，加入1 μ 1蛋白酶K，37°C反應(yīng)10分鐘。 冰浴2分鐘，熱擊轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行I^stl酶切，電泳，被消化成一條約 Ilkb條帶的為陽性克隆，被消化成兩條2. 4kb和91Λ條帶的為沒有重組的克隆。獲得正確的重組表達(dá)載體(命名為35S: :ST0N1)。將重組表達(dá)載體35S: STONl進(jìn)行測序驗證，結(jié)果在pMDC32的重組位點(diǎn)間插入的基因序列如SEQ ID NO 2所示。三、植物轉(zhuǎn)化Silwet L-77 購自 LEHLE SEEDS，貨號VIS_02。農(nóng)桿菌GV3101 在文獻(xiàn)“Li，Y.，Zheng, L.，Corke, F.，Smith, C.，and Bevan, Μ. W. (2008). Control of final seed and organ size by the DA lgene family in Arabidopsis thaiiana. Genes Dev22，1331-1336”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。1、重組農(nóng)桿菌構(gòu)建電擊轉(zhuǎn)化重組植物表達(dá)載體35S::ST0N1到農(nóng)桿菌GV3101中，電擊儀型號為 MicropuleHBio-RAD)，得到重組農(nóng)桿菌。將重組農(nóng)桿菌進(jìn)行抗生素(Kan，Gen，Rif)平板抗性篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆。侵染農(nóng)桿菌菌液制備將挑取的陽性克隆用5ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)過夜，再以1 100的體積比轉(zhuǎn)接到農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中大搖至0D600為1.2-1.4。然后，14°C， 4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，用轉(zhuǎn)化緩沖液重懸，得到侵染菌液。農(nóng)桿菌培養(yǎng)基組成向YEP培養(yǎng)基中添加抗生素Kan、抗生素Gen和抗生素 Rif,得到農(nóng)桿菌培養(yǎng)基?？股豄an、抗生素Gen、抗生素Rif和YEP培養(yǎng)基的比例為 50mg 40mg 12. 5mg 1ml。轉(zhuǎn)化緩沖液組成將1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖和silwet L-77混合，調(diào)PH至5. 7，得到轉(zhuǎn)化緩沖液。蔗糖、silwet L-77和1/2MS培養(yǎng)基的配比為蔗糖=Silwet L-77 V2MS培養(yǎng)基=5mg 0. 04ml Iml0YEP培養(yǎng)基配制酵母提取物(0X0ID) 10g/L，大豆蛋白胨(北京雙旋微生物生物培養(yǎng)基制品廠)10g/L, NaCl 5g/L，其余為水；調(diào)PH值到7. 0。2、擬南芥轉(zhuǎn)化利用浸泡花序的方法轉(zhuǎn)化擬南芥Col-O野生型，以獲得35S: :ST0N1轉(zhuǎn)基因植株。具體操作如下1)、擬南芥生長條件擬南芥Col-O野生型種子以70%乙醇表面消毒1分鐘，5%次氯酸鈉溶液消毒10 分鐘，無菌水洗滌5遍。4°C冰箱春化3天后，播種于1/2MS固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)間， 22°C、16小時光照/8小時黑暗條件下培養(yǎng)，7天后將幼苗移至培養(yǎng)介質(zhì)(蛭石和草炭土的體積比為2 1混勻)中，培養(yǎng)至得到帶有花序的擬南芥植株。2)、轉(zhuǎn)基因植株的獲得當(dāng)擬南芥植株主枝長5-15cm時用步驟1中菌液進(jìn)行侵染。將待轉(zhuǎn)化的擬南芥花序浸泡在菌液中10秒鐘，避光保濕24h后，再培養(yǎng)一個月左右收種，即為Tl代種子。擬南芥培養(yǎng)條件為16小時光照/8小時黑暗，強(qiáng)度為4000LUX，溫度22°C，濕度60-80%。培養(yǎng)介質(zhì)為按21體積混勻的蛭石和營養(yǎng)土。所得Tl代種子春化后播種在潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植株，10天后移栽到培養(yǎng)介質(zhì)中。用這種方法共篩選到78個轉(zhuǎn)基因植株，多數(shù)具有較多的葉片、較大的花瓣、角果、種子等器官。整個過程中，擬南芥培養(yǎng)條件為16小時光照/8小時黑暗，強(qiáng)度為4000LUX，溫度22°C，濕度60-80%。培養(yǎng)介質(zhì)為按2 1體積混勻的蛭石和營養(yǎng)土。潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基組成由葡萄糖、潮霉素(Hyg)和1/2MS固體培養(yǎng)基組成， 葡萄糖、潮霉素和1/2MS固體培養(yǎng)基的配比為IOg葡萄糖30mg卡那霉素1L 1/2MS固體培養(yǎng)基。同時以轉(zhuǎn)入空載體pMDC32的擬南芥為空載體對照。3、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定(1)基因組DNA提取。剪取4-8cm2的轉(zhuǎn)基因植株葉片和野生型Col-O的葉片，加入100 μ 1 REB (50mMTris-HCl (PH = 8. 0), 25mM EDTA, 250mM NaCl,0. 5% SDS，其余為水)后玻璃棒研碎，加入等體積的苯酚/氯仿，離心10分鐘；取上清，加入2倍體積的無水乙醇；離心10分鐘，棄上清，以70%乙醇洗沉淀，涼干后加入80 μ 1無菌水。以STCMl⑶S-F和STCMl⑶S-R 為引物，分別以野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，35S: :ST0m轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有750bp的清晰條帶，而野生型擬南芥無此條帶，說明78棵轉(zhuǎn)基因植株全部為陽性。空載體對照與野生型一致。選取表型顯著的10株收種，為T2代種子。在T3代通過潮霉素抗性分離出純合的轉(zhuǎn)基因系，進(jìn)行下一步的表型統(tǒng)計分析。4、表型統(tǒng)計分析相同條件下種植野生型、轉(zhuǎn)空載體植株和轉(zhuǎn)基因純合系，統(tǒng)計花瓣、角果、種子、單株產(chǎn)量等指標(biāo)，方法如下下述各圖中，I為野生型，II為轉(zhuǎn)基因株系。下述實(shí)驗均設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。(1)統(tǒng)計基生葉和莖生葉的葉片數(shù)目。結(jié)果轉(zhuǎn)基因株系的基生葉數(shù)目平均為13/ 株；野生型的基生葉數(shù)目平均為11. 4/株。轉(zhuǎn)基因株系的莖生葉數(shù)目平均為3. 9/株；野生型的莖生葉數(shù)目平均為2. 8/株。如圖IE所示，表明過表達(dá)植株具有較多的基生葉和莖生葉。
與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因株系的葉片面積增加(圖1B)。(2)取下主莖上第3-第7朵正在開放的小花，用鑷子小心將花瓣剖下，展平，放在體式鏡(LEICA S8AP0，德國)下觀察并拍照(LEICA DFC420，德國)。用Image Jl. 41軟件測量花瓣的長、寬、面積，利用EXCEL進(jìn)行統(tǒng)計分析(圖1D)。結(jié)果花瓣長度轉(zhuǎn)基因株系平均為3. 7mm ；野生型平均為3. 3mm?；ò陮挾绒D(zhuǎn)基因株系平均為1. 2mm ；野生型平均為1. 1mm?；ò昝娣e轉(zhuǎn)基因株系平均為2. 5mm2 ；野生型平均為2. 2mm2。表明過表達(dá)植株的花瓣長度增加12%，寬度增加8%，面積增加20%。說明擬南芥 STONl基因能夠顯著增加花瓣的大小(圖1A)。(3)取主莖上第3-第7個即將成熟的角果，在體式鏡下拍照，Image J軟件測量大小，EXCEL統(tǒng)計分析(如圖1C，IF和1G)。角果長度轉(zhuǎn)基因株系平均長度為15. 5mm ；野生型平均長度為13. 9mm(圖1F)。每個角果里的種子數(shù)目轉(zhuǎn)基因株系為64粒；野生型平均為57粒(圖1G)。結(jié)果表明過表達(dá)植株的角果長度增加11%，每個角果里的種子數(shù)目增加12%。(4)收獲主莖上第3-第10個角果的種子，室溫放置1個月后在體式鏡下拍照， Image J軟件測量種子大小，EXCEL統(tǒng)計分析。精確數(shù)出500粒種子，在天平上測量種子重量(METTLER TOLEDO AL104，中國)，5次重復(fù)。結(jié)果表明野生型植株的種子長度主要集中在 0. 45-0. 5mm,而過表達(dá)植株主要集中在0. 5-0. 55mm。500粒種子重量轉(zhuǎn)基因株系平均為9. 74mg ；野生型平均為9. 36mg。500粒種子重量增加5% (圖1H)。圖II的縱坐標(biāo)是不同大小的種子所占的百分?jǐn)?shù)。1為0. 50-0. 55mm, 2 為 0. 45-0. 50mm, 3 為 0. 40-0. 45mm。(5)收集單株種子，分別稱量全株種子質(zhì)量(即為單株產(chǎn)量)。單株產(chǎn)量結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系野生型200.5mg。過表達(dá)植株的整株產(chǎn)量約增加21% (圖1J)。轉(zhuǎn)空載體擬南芥與野生型擬南芥結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種提高植物產(chǎn)量的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ ID N0:1所示蛋白質(zhì)的編碼基因，得到與所述出發(fā)植物相比產(chǎn)量提高的目的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體是向出發(fā)載體PMDC32中插入所述編碼基因得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述SEQID NO :1所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ ID NO 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述出發(fā)植物為雙子葉植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥 (Arabidopsis thaliana)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)量為植物的單株種子重量。
7.一種改善植物的與產(chǎn)量相關(guān)表型的方法，包括如下步驟向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ ID NO :1所示蛋白質(zhì)的編碼基因，得到與所述出發(fā)植物相比與產(chǎn)量相關(guān)表型得到改善的目的轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；所述重組表達(dá)載體是向出發(fā)載體PMDC32中插入所述編碼基因得到的；所述與產(chǎn)量相關(guān)表型得到改善為如下1)-6)中至少一種.1)與出發(fā)植物相比，葉片數(shù)目增加；.2)與出發(fā)植物相比，葉片的面積增加；.3)與出發(fā)植物相比，花瓣的大小變大；.4)與出發(fā)植物相比，角果長度增加；.5)與出發(fā)植物相比，每個角果里的種子數(shù)目增加；.6)與出發(fā)植物相比，種子重量增加；.7)與出發(fā)植物相比，種子長度增加。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述SEQID NO :1所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ ID NO :2所示；所述葉片數(shù)目為基生葉的數(shù)目和/或莖生葉的數(shù)目；所述花瓣的大小變大為如下中的至少一種花瓣的長度變長、花瓣的寬度變寬和花瓣的面積變大；所述出發(fā)植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
10.SEQ ID NO :2所示基因和/或SEQ ID NO :1所示蛋白質(zhì)在提高植物產(chǎn)量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物產(chǎn)量的方法。該提高植物產(chǎn)量的方法，是向出發(fā)植物中導(dǎo)入SEQ ID NO1所示蛋白質(zhì)的編碼基因，得到與所述出發(fā)植物相比產(chǎn)量提高的目的轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)驗證明，本發(fā)明方法通過過表達(dá)STON1能夠促進(jìn)植物生長，形成較多的葉片、較大的花瓣和較長的角果，并且能夠增加種子重量和單株產(chǎn)量。本發(fā)明在農(nóng)作物高產(chǎn)育種中具有極大的生產(chǎn)應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N15/63GK102586264SQ20111000145
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者劉亞菊, 李云海, 李勝軍 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所