專利名稱：：短串聯(lián)重復(fù)基因座的多重?cái)U(kuò)增的制作方法短串聯(lián)重復(fù)基因座的多重?cái)U(kuò)增本申請是申請日為1997年4月15日、申請?zhí)枮?7194967.0、發(fā)明名稱為"短串聯(lián)重復(fù)基因座的多重?cái)U(kuò)增"的發(fā)明專利申請的分案申請。相關(guān)申請的交叉參考本申請是1994年9月30日申請的美國專利申請08/316，544的部分繼續(xù)申請。該母申請的全文引入本文作參考。關(guān)于聯(lián)邦政府贊助的開發(fā)研究的聲明無。發(fā)明背景本發(fā)明一般地涉及對基因組系統(tǒng)中的遺傳標(biāo)記的檢測，更具體地，本發(fā)明涉及用聚合酶鏈反應(yīng)或其它擴(kuò)增系統(tǒng)對多個(gè)獨(dú)立的多態(tài)遺傳基因座的同時(shí)擴(kuò)增以在一個(gè)反應(yīng)中確定在多重系統(tǒng)中所含的每個(gè)基因座的等位基因。近年來，作為遺傳標(biāo)記的多態(tài)短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)刺激了下列方面的進(jìn)展，即連鎖圖譜的開發(fā)、疾病基因的鑒別和鑒定以及DNA分型的簡化和精確。至少在人類基因組中的許多基因座含有多態(tài)STR區(qū)(Adamson，D.等，(1995)"從人類基因組中收集的有序四核苷酸重復(fù)標(biāo)記"，美國人類遺傳學(xué)雜志57:619-628;Murray,J.C.等，(1994)"具有分摩密度的復(fù)雜人類連鎖圖譜"，科學(xué)285:2049-2054;Hudson,T丄，Engelstein，M.,Lee，M.K.，Ho，E.C.，Rubenfield，M丄，Adams,C.P.，Housman,D.E.，Dracopoli,N.C.(1992),"100個(gè)高信息含量的人類簡單序列重復(fù)多態(tài)性的分離和染色體定位"，(Genomics13:62^629)。STR基因座由長度為3-7個(gè)堿基對的短的重復(fù)序列元件組成。預(yù)計(jì)在人類基因組中有2000000個(gè)三聚和四聚的STR存在，每15kb就會(huì)出現(xiàn)1個(gè)(Edwards等(1991)，"用三聚和四聚的串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行DNA分型和遺傳作圖"，美國人類遺傳學(xué)49:746-756;Beckman,J.S.,Weber，J丄.(1992)，"人和大鼠微衛(wèi)星的調(diào)查"，基因組12:627-631)。由Edwards等(1991)研究的STR基因座有近一半是多態(tài)的，它們提供了遺傳標(biāo)記的豐富來源。在一特定基因座的短串聯(lián)重復(fù)單元的數(shù)目變化導(dǎo)致在該基因座的DNA的長度在各等位基因之間及在個(gè)體之間有變化，這種長度多態(tài)性與可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR)基因座(Nakamura,Y.等(1987)，"用于人類基因作圖的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR)標(biāo)記"，科學(xué)235:1616-1622)和小衛(wèi)星基因座(Jeffreys,A丄等，(1985)"人DNA中的高度可變"小衛(wèi)星區(qū)"區(qū)"，自然314:67-73)有關(guān)，這兩種基因座均含有比STR基因座長得多的重復(fù)單元。這種長度多態(tài)性也與微衛(wèi)星基因座的二核苷酸重復(fù)形式類似(Litt，M.,Luty,J.A.(1989),"通過體外擴(kuò)增心肌激動(dòng)素基因內(nèi)的二核苷酸重復(fù)揭示的高度可變的微衛(wèi)星體"，美國人類遺傳學(xué)44:397-401，Tautz,D.等(1986)，"DNA的密碼簡易性是遺傳變異的主要來源"，自然322:652-656，Weber,J丄.,May，RE.(1989)，"可用聚合酶鏈反應(yīng)分型的一大類人DNA多態(tài)性"，美國人類遺傳學(xué)44:388-396;BeckmanandWeber(1992))，該形式的微衛(wèi)星基因應(yīng)具有比STR基因座短的重復(fù)單元。多態(tài)STR基因座是用于人類鑒別，父系測試和遺傳作圖特別有用的標(biāo)記。通過采用在串聯(lián)重復(fù)序列側(cè)翼區(qū)鑒別的特異引物序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以擴(kuò)增STR基因座。這些基因座的等位基因是由在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)所含的重復(fù)序列的拷貝數(shù)而區(qū)分，并在電泳分離后由任何合適的檢測方法如放射性、熒光、銀染或顏色而彼此區(qū)分。為使勞動(dòng)力、材料和分析時(shí)間最小化，希望的是同時(shí)分析多個(gè)基因座和/或較多的樣品，達(dá)到這一目的的一個(gè)途徑是在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因座。文獻(xiàn)中已廣泛描述了這種"多重"擴(kuò)增。多重?cái)U(kuò)增系列已被廣泛開發(fā)用于分析與人類遺傳疾病有關(guān)的基因，所述疾病如Duchenne肌營養(yǎng)不良癥(Chamberlain，J.S.等(1989)，"通過多重DNA擴(kuò)增對Diichenne肌營養(yǎng)不良癥基因座進(jìn)行缺失掃描"，核酸研究16:11141-11156;Chamberlain,J.S.等(1989)，"用于診斷Duchenne肌營養(yǎng)不良癥的多重PCR"，PCR方案，方法和應(yīng)用指南(編輯Gelfand，D.H.等)第272-281頁，學(xué)術(shù)出版社，SanDiego,CA;Beggs，A,H,等(1990)"由PCR檢測98%DMD/BMD基因缺失"，人類遺傳學(xué)86:45-48;Clemens,P.R.等(1991)，"用二核苷酸重復(fù)多態(tài)性對Duchenne和Becker肌營養(yǎng)不良癥家族進(jìn)行攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷"，美國人類遺傳學(xué)雜志49:951-960;Schwartz，J.S.等(1992)，"Duche皿e/Becker's肌營養(yǎng)不良癥的熒光多重連鎖分析和攜帶者檢測"，美國人類遺傳學(xué)雜志51:721-729;Covone，A.E.等(1992)，"通過三重PCR篩選Duche皿e和Becker肌營養(yǎng)不良癥患者以檢測營養(yǎng)不良蛋白基因的30個(gè)外顯子中的缺失"，美國人類遺傳學(xué)雜志51:675-677)，Lesch-Nyhan綜合征(Gibbs，R.A.等(1990)，"Lesch-Nyhan家族的次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的多重DNA缺失檢測和外顯子測序"，基因組7:235-244)，囊性纖維化(Estivill，X.等(1991)，"由突變和微衛(wèi)星體等位基因的多重PCR產(chǎn)前診斷囊性纖維化"，柳葉刀338:458;Fortina，P.等(1992)"由多重聚合酶鏈反應(yīng)對囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物基因中的最常見突變進(jìn)行非放射性檢測"，人類遺傳學(xué)90:375-378;Ferrie,R.M.等(1992)，"用于檢測CFTR基因中的常見突變的ARMS試驗(yàn)的開發(fā)、多重化及應(yīng)用"，美國人類遺傳學(xué)雜志51:251-262;Morral,N.和Estivill，X.(1992)，"CFTR基因內(nèi)的三個(gè)微衛(wèi)星體的多重PCR擴(kuò)增"，基因組51:1362—1364)，以及成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Lohmann，D等(1992)，"由多重PCR和高分辨凝膠電泳檢測成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤中的小RB1基因缺失"，人類遺傳學(xué)89:49-53)。多態(tài)微衛(wèi)星體標(biāo)記的多重?cái)U(kuò)增(Clemens等(1991);Schwartz等(1992);Huang,T.H,M.等(1992)，"用多重聚合酶鏈反應(yīng)對X染色體上的4個(gè)二核苷酸重復(fù)基因座DXS435，DXS45，DXS454，DXS424進(jìn)行遺傳作圖"，基因組13:375-385)，甚至是ST12標(biāo)記的多重?cái)U(kuò)增(Edwards,A等(1992)，"4個(gè)人群組中的5個(gè)三聚和四聚串聯(lián)重復(fù)基因座的遺傳變異"，基因組12:241-253;Kimpton,C.R等(1993)，"采用短串聯(lián)重復(fù)基因座的多重?cái)U(kuò)增的自動(dòng)DNA歸類"，PCR方法和應(yīng)用3:13-22;1^111111011(1，辻八.等(1994)，"13個(gè)STR基因應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別應(yīng)用的評價(jià)"，美國人類遺傳學(xué)雜志55:175-189;Schumm，J.W.等(1994)，"用于分析多態(tài)STR基因座的非同位素多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的開發(fā)"，第四屆人類鑒定國際研討會(huì)1993，第177-187頁；Oldroyd，N丄等(1995)，"適用于人類個(gè)體鑒定的高分辨性十重短串聯(lián)重復(fù)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)"，電泳16:334-337)已有描述。這些擴(kuò)增產(chǎn)物通常由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的幾種電泳方法中的一種而分離，幾種熟知的檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的方法也已有描述。盡管在某些情況下采用擴(kuò)增片段的溴乙錠染色或銀染，但在其它情況下優(yōu)選使用僅標(biāo)記擴(kuò)增材料的兩條鏈中的一條鏈的方法，后者的例子包括在擴(kuò)增基因座之前放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記兩個(gè)引物中的一個(gè)。一種更復(fù)雜的檢測方法是利用不同的熒光標(biāo)記以檢測代表不同基因座但在電泳后位于同一空間的擴(kuò)增材料。使用濾膜或其它區(qū)分性檢測劑區(qū)分不同基因座的產(chǎn)物，使得在一個(gè)時(shí)間顯示一種熒光標(biāo)記。請參照國際公開W093/18177禾BW093/18178(Fortina等)，其涉及使用等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)分別診斷如囊性纖維化和P—地中海貧血等疾病的方法和試劑盒，根據(jù)Fortina等，多重PCR也已被用于同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列，用瓊脂糖凝膠的兩條泳道進(jìn)行突變等位基因掃描。Ballabio,A,等(1991)，"囊性纖維化缺失的PCR測試"，自然343:220，公開了使用兩個(gè)不同染料標(biāo)記的熒光引物檢測F508囊性纖維化突變的單管多重等位基因特異性PCR測試。盡管對于特異的基因座有多重?cái)U(kuò)增程序，但是仍需要用于檢測其它類型的基因座如特異STR基因座的等位基因的多重?cái)U(kuò)增程序。還需要鑒別能多重?cái)U(kuò)增這種基因座的引物。發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供使用PCR或其它擴(kuò)增系統(tǒng)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)獨(dú)立的多態(tài)短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座的方法和材料，以在一個(gè)反應(yīng)中確定在多重系統(tǒng)中所含的每個(gè)基因座的等位基因。本文所公開的特異STR基因座的多重分析在現(xiàn)有技術(shù)中未見描述。本文下述公開的許多引物的序列也未見描述，所有這些引物對于這種STR基因座的多重?cái)U(kuò)增均是有用的。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供特異于包含特異基因座的多重?cái)U(kuò)增的方法、試劑盒和引物。這些和其它目的通過本發(fā)明而實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明涉及用于同時(shí)分析或確定存在于每個(gè)多重系統(tǒng)中的每個(gè)基因座的等位基因的方法和材料。一般來說，本發(fā)明的方法包括下述步驟(a)獲得至少一個(gè)待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有至少兩個(gè)可一起擴(kuò)增的基因座；(b)擴(kuò)增DNA樣品中的STR序列；和(c)以揭示所采用的系統(tǒng)的多態(tài)性的方式檢測擴(kuò)增出的材料。更具體地，本發(fā)明的方法是一種用于同時(shí)確定存在于來自或多個(gè)DNA樣品的至少3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因座中的等位基因的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得至少一個(gè)待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有可一起擴(kuò)增的一套至少3個(gè)基因座，其中該套基因座選自特異一組或本文公開的基因座套；(b)在一多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中共擴(kuò)增該套基因座，其中反應(yīng)產(chǎn)物是來自該套共擴(kuò)增的基因座中的每一個(gè)基因座的擴(kuò)增的等位基因的混合8物；以及(cA平價(jià)混合物中的擴(kuò)增的等位基因以確定在DNA樣品內(nèi)該套被分析的每一個(gè)基因座上存在的等位基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，3個(gè)STR基因座被一起擴(kuò)增，并且該套3個(gè)共擴(kuò)增的基因座選自如下一組D3S1539,D19S253,D13S317:D10S1239,D9S930,D20S481;D10S1239,D4S2368,D20S481;D10S1239,D9S930,D4S2368;D16S539,D7S820,D13S317:禾flD10S1239,D9S930,D13S317.在本發(fā)明方法的一個(gè)更優(yōu)選的方案中，DNA樣品具有至少4個(gè)可一起擴(kuò)增的STR基因座，并且該套共擴(kuò)增的基因座選自如下一組基因座D3S1539,D4S2368,D5S818,D7S820,D9S930,D10S1239,D13S317,D14S118,D14S548,D14S562,D16S490,D16S539,D16S753,D17S1298,D17S1299,D19S253,D20S481,D22S683,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMFESFPS,HUMF13ACH,HUMBFXIII,HUMLIPOL,HUMvWFA31.可一起擴(kuò)增的該套至少4個(gè)STR基因座更優(yōu)選地是選自如下一組4個(gè)基因座套的一套基因座D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818:D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818;D20S481,D7S820,D13S317,D5S818;D9S930,D7S820,D13S317,D5S818;D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818;D14S118,D7S820,D13S317,D5S818;D14S562,D7S820,D13S317,D5S818;D14S548,D7S820,D13S317,D5S818;D16S490,D7S820,D13S317,D5S818;D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818;D16S539,D7S820,D13S317,D5S818;D22S683,D7S820,D13S317,D5S818;D16S753,D7S820,D13S317,D5S818;D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481;禾口D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31.更優(yōu)選地，一起擴(kuò)增的該套STR基因座是一套6個(gè)基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX;'和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS.還更優(yōu)選地，一起擴(kuò)增的該套STR基因座是一套7個(gè)基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01;和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFX川.還更優(yōu)選地，一起擴(kuò)增的該套STR基因座是一套8個(gè)基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31;禾口D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL本發(fā)明方法的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)步驟優(yōu)選地用位于在反應(yīng)中共擴(kuò)增座兩側(cè)的引物對進(jìn)行。更優(yōu)選地，多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)所用的引物對的選擇是能從每個(gè)基因座產(chǎn)生當(dāng)用凝膠電泳分離時(shí)不與共擴(kuò)增的其它基因座的等位基因重疊的等位基因。更優(yōu)選地，多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中所用的每個(gè)引物對中的一個(gè)引物的序列選自如下引物序列SEQIDNO:l和SEQIDNO:2，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D7S820時(shí)；SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D13S317時(shí)；SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D5S818時(shí)；SEQIDNO:7，SEQIDNO:8和SEQIDNO:49，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D3S1539時(shí)；SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D17S1298時(shí)；SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:52，SEQIDNO:53，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D20S481時(shí)；SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:55，SEQIDNO:61，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D9S930時(shí)；SEQIDNO:15，SEQIDNO:16，SEQIDNO:54，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D10S1239時(shí)；SEQIDNO:17，SEQIDNO:18，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D14S118時(shí)；SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D14S562時(shí)；SEQIDNO:21,SEQIDNO:22，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D14S548時(shí)；iiSEQIDNO:23，SEQIDNO:24，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D16S490時(shí)；SEQIDNO:25，SEQIDNO:26，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D16S753時(shí)；SEQIDNO:27，SEQIDNO:28，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D17S1299時(shí)；SEQIDNO:29，SEQIDNO:30，SEQIDNO:58，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D16S539時(shí)；SEQIDNO:31，SEQIDNO:32，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D22S683時(shí)；SEQIDNO:33，SEQIDNO:34，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMCSFIPO時(shí)；SEQIDNO:35，SEQIDNO:36，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMTPOX時(shí)；SEQIDNO:37，SEQIDNO:38，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMTHOl時(shí)；SEQIDNO:39，SEQIDNO:40，SEQIDNO:59，SEQIDNO:60，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMvWFA31時(shí)；SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMF13A01時(shí)；SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMFESFPS時(shí)；SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMBFXIII時(shí)；SEQIDNO:47，SEQIDNO:48，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是HUMLIPOL時(shí)；SEQIDNO:50，SEQIDNO:51，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D19S253時(shí)；和SEQIDNO:56，SEQIDNO:57，當(dāng)該套基因座中的一個(gè)基因座是D4S2368時(shí)。在本發(fā)明方法中，擴(kuò)增的等位基因優(yōu)選地通過將其與分子量大小標(biāo)準(zhǔn)相比較而評價(jià)，其中分子量大小標(biāo)準(zhǔn)選自DNA標(biāo)記物和基因座特異性等位基因梯。等位基因的評價(jià)優(yōu)選地用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等位基因，由此形成分離的等位基因的聚丙烯酰胺凝膠而進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠中的分離的等位基因優(yōu)選地通過用合適的技術(shù)如銀染，更優(yōu)選地用熒光分析而顯色等位基因來確定。熒光分析優(yōu)選地通過在用于反應(yīng)中之前用熒光標(biāo)記物標(biāo)記多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中所用的每個(gè)引物對中的一個(gè)引物來進(jìn)行。用于標(biāo)記每個(gè)這種引物的熒光標(biāo)記物優(yōu)選地是熒光素標(biāo)記物或四甲基羅丹明標(biāo)記物。最優(yōu)選地，使用至少兩種不同的標(biāo)記物標(biāo)記用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中的不同的引物。使用本發(fā)明方法的待分析的至少一個(gè)DNA樣品優(yōu)選地從人組織中分離，優(yōu)選下述組織血液、精液、陰道細(xì)胞、頭發(fā)、唾液、尿液、骨骼、口腔樣品、含有胎盤細(xì)胞或胚胎細(xì)胞的羊膜液，以及上述組織的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于同時(shí)分析至少3個(gè)基因座中的STR序列的試劑盒，該試劑盒包括一個(gè)容器，容器中具有用于擴(kuò)增一套至少3個(gè)短串聯(lián)重復(fù)基因座的寡核苷酸引物對，其中該套基因座選自如下—D3S1539,D19S253,D13S317;D10S1239,D9S930,D20S481;D10S1239,D4S2368,D20S481:D10S1239,D9S930,D4S2368;D16S539,D7S820,D13S317;D10S1239,D9S930,D13S317;D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818;D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818;D20S481,D7S820,D13S317,D5S818;D9S930,D7S820,D13S317,D5S818;D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818;D14S118,D7S820,D13S317,D5S818;D14S562,D7S820,D13S317,D5S818;D14S548,D7S820,D13S317,D5S818;D16S490,D7S820,D13S317,D5S818;D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818;D16S539,D7S820,D13S317,D5S818;D22S683,D7S820,D13S317,D5S818;D16S753,D7S820,D13S317,D5S818;D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481;D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481;D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481;D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31;D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSFIPO,HUMTPOX;D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS;D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01;D16S539,D7S820,D13S317,D5S8;3,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFX川；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31;禾卩D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIU,HUMLIPOL.試劑盒中包括的每個(gè)引物對中的至少一個(gè)引物優(yōu)選地具有選自上述描述本發(fā)明方法時(shí)所列的一組序列中的一個(gè)序列。在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是用于擴(kuò)增人類DNA的特異STR基因座的引物序列和引物對。本文以下描述了使用本發(fā)明的引物和引物對對人類DNA進(jìn)行多重分析。本發(fā)明的引物適合用于本發(fā)明的方法中，其中根據(jù)在方法的評價(jià)步驟中確定擴(kuò)增的等位基因的方式，它們可以以標(biāo)記的或未標(biāo)記的形式使用。在上述簡要描述的各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用特定組合的基因座和特定條件檢測和分析多態(tài)性遺傳標(biāo)記的高效方法和材料。通過選擇用于評價(jià)步驟的合適的檢測技術(shù)，本發(fā)明的材料和方法可以在僅具有電力供應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)裝置的實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，也可在具有最新的用于熒光凝膠掃描設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，這些最新設(shè)備例如Fluorlmager575(MolecularDynamics，Suraiyvale,CA)或日立FMBIO(SanBruno，CA)熒光掃描儀或ABI373和ABIPrism377DNA測序儀(AppliedBiosystemsDivision，PerkinElmer,FosterCity，CA)。因此，本發(fā)明的方法適應(yīng)于各種用途和實(shí)驗(yàn)室。本發(fā)明描述的途徑在分析多重體系中所含的基因座時(shí)節(jié)省時(shí)間、勞力和材料。本發(fā)明的方法使得能用一個(gè)單一擴(kuò)增反應(yīng)在一個(gè)試管中一起擴(kuò)增3個(gè)或更多，甚至8個(gè)或更多個(gè)基因座，而不必在不同的試管中單獨(dú)擴(kuò)增每個(gè)基因座。本發(fā)明在法醫(yī)學(xué)分析、親子鑒定、骨髓移植監(jiān)視、連鎖作圖及檢測遺傳疾病和癌癥等領(lǐng)域有特殊用途。通過能同時(shí)擴(kuò)增和分析3個(gè)或更多個(gè)基因座，本發(fā)明的材料和方法明顯提高了將從兩個(gè)不同個(gè)體的血液或其它組織分離的DNA進(jìn)行匹配的肯定性。在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中急需精確區(qū)分不同個(gè)體的少量組織，在該應(yīng)用中許科學(xué)家，特別是法醫(yī)學(xué)科學(xué)家很久以來就意識(shí)到需要分析DNA的多個(gè)多態(tài)性基因座以保證兩個(gè)組織樣品之間的匹配是統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯的(Presley,L.A.等(1993)，"由FBI實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，HLADQa分型"，第三屆人類鑒定國際研討會(huì)1992，第245-269頁；86"61"凡八.等(1992)，"由HaeIIIRFLP分析鑒定5個(gè)VNTR基因座，用于親子鑒定測試"，第二屆人類鑒定國際研討會(huì)1991，第103-128頁)。然而，直至本發(fā)明完成之前，僅有少數(shù)方法能用于在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)分析3個(gè)或更多個(gè)STR基因座。為理解這種多重能力的重要性，有必要了解一些DNA分型分析的數(shù)學(xué)。舉例來說，假定每個(gè)STR的基因型(即兩個(gè)等位基因模式)幾率為十分之一，也就是說，假定兩個(gè)隨機(jī)選擇的個(gè)體具有單一STR的匹配類型的幾率是1/10。然而如果分析兩個(gè)不同STR基因座，則兩個(gè)系統(tǒng)隨機(jī)匹配的幾率為1/100。如果分析3個(gè)STR基因座，則3個(gè)系統(tǒng)中每一個(gè)的隨機(jī)匹配的幾率變?yōu)?/1000，以此類推。結(jié)果是，很容易看到增加所分析的STR基因座數(shù)目至超過三個(gè)基因座以上能明顯降低一般人群中隨機(jī)匹配的可能性，從而通過將犯罪嫌疑人的類型與犯罪現(xiàn)場證據(jù)相比較就可增加精確鑒別(或排除)該人的幾率。使用類似的推導(dǎo)可以得出如下結(jié)論，本發(fā)明的方法也可增加精確鑒定親子案件中受懷疑的父親，骨髓組織的正確匹配，來自連鎖作圖研究的顯著結(jié)果，以及檢測遺傳疾病和癌癥的可能性。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖而變得清楚。附圖簡述圖1是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例1中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D3S1539，D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖2是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例2中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1298,D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖3是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例3中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1298，D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖4是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例4中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D20S481，D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖5是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例5中用FhioImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D20S481，D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖6是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例6中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖7是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例7中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖8是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例8中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢圖9是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例9中用FluoImagerTM熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S118，D7S820，D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖10是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例10中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖11是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例11中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S548，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖12是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例12中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D16S490,D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖13是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例13中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D16S753，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖14是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例14中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1299，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖15是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例15中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座18D16S539，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖16是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例16中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D22S683，D7S820,D13S317和D5S818的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖17是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例17中用FMBK)tm突光掃描儀7"(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMCSFIPO("CSF1P0")和HUMTPOX("TPOX")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖18是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例18中用FMBIOTM熒光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSFIPO("CSFIPO")，HUMTPOX("TPOX")和HUMTHOl("TH01")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖19是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例19中用FMBIOtm突光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno，CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSFIPO("CSFIPO")，HUMTPOX("TPOX")，HUMTHOl("TH01")和HUMvWFA31("vWA")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖20是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例20中用FMBIOtm突光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01("F13A01")和HUMFESFPS("FESFPS")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖21是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例21中用FMBIOTM熒光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01("F13A01")，HUMFESFPS("FESFPS")和HUMBFXIII("F13B")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖22是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例22中用FMBIOtm突光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539，D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01("F13A01")，HUMFESFPS("FESFPS"),HUMBFXIII("F13B")和HUMLIPOL("LPL")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖23是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例23中用FMBIOTM熒光掃描儀tm(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測的基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818，HUMCSFIPO("CSFIPO")，HUMTPOX("TPOX"),HUMTH01("TH01")禾口HUMvWFA31("vWA")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖24是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例24中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖25是一激光打印的圖象，顯示了實(shí)施例25中用Fluolmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光檢測圖。圖26是一幅顯示了實(shí)施例26中3個(gè)基因座D16S539，D7S820和D13S317的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖27是一幅顯示了實(shí)施例27中4個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317和HUMvWFA31("vWA")的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖28是一幅顯示了實(shí)施例28中3個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D13S317的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖29是一幅顯示了實(shí)施例29中3個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D4S2368的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖30是一幅顯示了實(shí)施例30中4個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D4S2368和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖31是一幅顯示了實(shí)施例31中3個(gè)基因座D3S1539,D19S253和D13S317的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖32是一幅顯示了實(shí)施例32中4個(gè)基因座D3S1539,D19S253，D4S2368和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖33是一幅顯示了實(shí)施例33中4個(gè)基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖34是一幅顯示了實(shí)施例34中3個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。圖35是一幅顯示了實(shí)施例35中3個(gè)基因座D10S1239，D4S2368和D20S481的同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的銀染檢測照片。發(fā)明的詳細(xì)描述A.定義以下定義有助于清楚地理解下述術(shù)語的范圍和細(xì)節(jié)等位基因梯由從基因座擴(kuò)增的等位基因組成的標(biāo)準(zhǔn)分子量大小標(biāo)記o等位基因與DNA區(qū)段相關(guān)的基因變異，即占據(jù)同一基因座的兩或多種不同形式的DNA序列中的一種。生物化學(xué)命名本文使用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)命名，其中核苷酸堿基記作腺嘌呤(A);胸腺嘧啶(T);鳥嘌呤(G);和胞嘧啶(C)。相應(yīng)的核苷酸例如是脫氧鳥苷-5'-三磷酸(dGTP)。DNA多態(tài)性在一種DNA序列中有兩或多種不同核苷酸序列共存在同一種間雜交群體中的狀態(tài)?；蜃旧w上的特定位置，基因座的等位基因位于同源染21色體的相同位點(diǎn)上?；蜃禺愋砸镌跀U(kuò)增方法所用的條件下，至少對于所述基因座的一個(gè)等位基因而言，與該基因座的一部分或其互補(bǔ)鏈特異雜交但不與其它DNA序列有效雜交的一種引物。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):用變性、與引物退火及DNA聚合酶延伸的多個(gè)循環(huán)將靶DNA序列的拷貝數(shù)擴(kuò)增約IOM咅或更多倍的技術(shù)。用于擴(kuò)增核酸的聚合酶鏈反應(yīng)方法由美國專利4，683，195和4，683,202覆蓋，兩篇專利引入本文用于描述該方法。多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)基因座是這樣一種STR基因座，其中在基因組DNA的一特定區(qū)域中重復(fù)序列單元數(shù)(及序列凈長度)由等位基因的不同而不同，由個(gè)體的不同而不同。多態(tài)性信息含量(PIC):在一個(gè)基因座存在的多態(tài)性的量的量度(Bostein等，1980)。PIC值從0至1.0，值越高表示多態(tài)性程度越高。這一量度通常比其它常用的量度即雜合度顯示出較小的值。對于高信息含量的標(biāo)記(雜合度超過約70°/。)，雜合度和PIC之間的差異很小。一級(jí)反應(yīng)用純化的人基因組DNA作為PCR模板的初始反應(yīng)。引物，兩個(gè)單鏈寡核苷酸或DNA片段，其與基因座的對應(yīng)鏈雜交從而引物的3'末端位于最近端。引物對兩個(gè)引物，包括引物1，其與待擴(kuò)增的DNA序列的一端的單鏈雜交，以及引物2，其與待擴(kuò)增的DNA序列的互補(bǔ)鏈的另一端雜交。引物位點(diǎn)，引物與之雜交的靶DNA的區(qū)域。二級(jí)反應(yīng)使用初級(jí)反應(yīng)物的稀釋液作為PCR模板利用相同或不同引物對進(jìn)行的再擴(kuò)增。短串聯(lián)重復(fù)基因座(STR基因座)含有長度為3-7bp的短的重復(fù)序列單元的人基因組區(qū)域。B.多重反應(yīng)成分的選擇本發(fā)明方法涉及選擇一套合適的基因座、引物及擴(kuò)增方案以從多個(gè)共擴(kuò)增的基因座產(chǎn)生擴(kuò)增的等位基因，這些擴(kuò)增的等位基因或者大小互不重疊，或者大小重疊但以某種方式被標(biāo)記而使它們相互能區(qū)分開。另外，本發(fā)明方法還涉及選擇能使用一單擴(kuò)增方案的短串聯(lián)重復(fù)基因座。本文描述的基因座的特異組合是本申請?zhí)赜械摹；蜃慕M合可由上述兩種原因的任一種而否決，或者由于結(jié)合考慮一或多個(gè)基同座不能產(chǎn)生合適的產(chǎn)物產(chǎn)率或在這一反應(yīng)中產(chǎn)生不能代表真正的等位基因的片段而加以否決。除了本文公開的那些組合外，可以通過反復(fù)試驗(yàn)基因座組合、通過選擇引物對序列及通過調(diào)整引物濃度以達(dá)到所有包括的基因座均可被擴(kuò)增的平衡而產(chǎn)生成功的組合。一旦公開了本發(fā)明的方法和材料，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易想到各種選擇本發(fā)明方法和試劑盒中所用的基因座、引物對及擴(kuò)增技術(shù)的方法，所有這些方法均屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在本發(fā)明方法實(shí)施中特別重要的是從在多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)步驟中一起擴(kuò)增的各個(gè)基因座產(chǎn)生的擴(kuò)增的等位基因的大小范圍。為了便于用目前的技術(shù)分析，最優(yōu)選的是能通過擴(kuò)增小于500個(gè)堿基的片段檢測的系統(tǒng)。在上述發(fā)明簡述部分描述了基因座、引物和擴(kuò)增技術(shù)的最優(yōu)選組合。引物選擇不合適會(huì)產(chǎn)生若干不希望的結(jié)果如缺少擴(kuò)增、在多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增、形成引物二聚體、來自不同基因座的引物序列的不希望的相互作用、從一個(gè)基因座產(chǎn)生與另一個(gè)基因座的等位基因重疊的等位基因、或者對于在多重體系中不相容的不同基因座需要不同的擴(kuò)增條件或方案。本方法所用的引物的合成可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何寡核苷酸合成標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行。C.使用3個(gè)基因座的多重體系開發(fā)利用多于3個(gè)基因座的多重體系可用許多不同技術(shù)中的任一種選擇待分析的一套STR基因座。以下描述了一種優(yōu)選的用于開發(fā)用于這種分析方法中的有用的基因座套的技術(shù)。一旦開發(fā)了含有3個(gè)基因座的多重體系，可以其為核心創(chuàng)建含有多于3個(gè)基因座的多重體系。創(chuàng)建了新的組合，包括開始的3個(gè)基因座。使用含有基因座D7S820，D13S317和D5S818的核心多重體系產(chǎn)生下述衍生的多重體系D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;HUMCSF1P0，HUMTPOX，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;HUMCSF1P0，HUMTPOX，HUMTH01，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818;以及HUMCSF1P0，HUMTPOX，HUMTHOl，HUMvWFA31，D16S539,D7S820，D13S317和D5S818。應(yīng)理解的是基因座核心套可用于產(chǎn)生其它合適的STR基因座衍生套，以用于用本發(fā)明方法進(jìn)行多重分析。無論用何種方法選擇用本發(fā)明方法分析的基因座，選擇用于多重分析的所有基因座均應(yīng)具有下述特征(l)它們應(yīng)產(chǎn)生最小的損耗(例如在擴(kuò)增步驟中由錯(cuò)誤重復(fù)序列而導(dǎo)致的損耗)，(2)在多重?cái)U(kuò)增步驟中由使擴(kuò)增的等位基因添加或缺失一個(gè)堿基所致的假象很少或沒有，(3)由聚合酶進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)的未成熟終止所致的假象很少或沒有，以及(4)沒有低于給定的真擴(kuò)增的等位基因的較小分子量的"拖后"帶，所述的"拖后"帶來自連續(xù)的單堿基缺失。見例如Schumm等，"用于多態(tài)性STR基因座的分析的非同位素多重?cái)U(kuò)增套的開發(fā)"，第四屆人類鑒定國際研討會(huì)1993,第177-187頁(Promega公司出版，1993)。D.DNA樣品的制備可使用與擴(kuò)增單個(gè)基因座相容的任何DNA制備方法制備用于本發(fā)明方法中的人基因組DNA樣品，有許多這類方法適用于制備用于本發(fā)明方法中的基因組DNA樣品，包括但不限于Patel,P.I.等(1984)，"人基因組中的HPRT基因和相關(guān)序列的組織"，體細(xì)胞分子遺傳學(xué)10:483-493，和Gill,R等(1985)，"DNA"指紋"的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用"，自然318:577-579描述的DNA樣品制備方法。在用于本發(fā)明方法之前，可用任何DNA檢測標(biāo)準(zhǔn)方法測定DNA濃度。然而，優(yōu)選使用如BnmkC.F.等，4(1979)，"分析細(xì)胞勻漿物中的納克量的DNA"，分析生物化學(xué)92:497-500所述的測量技術(shù)經(jīng)熒光測定DNA濃度。DNA濃度更優(yōu)選通過比較DNA標(biāo)準(zhǔn)與人特異性探針的雜交量而測定，如Waye等(1979)，Waye,J.S.等(1991)，"法醫(yī)學(xué)樣本中的人基因組脫氧核糖核酸(DNA)的靈敏特異性定量案例"，J.ForensicSci.，36:1198-1203所述。在擴(kuò)增反應(yīng)中使用太多的模板DNA會(huì)產(chǎn)生假象，它們以另外的條帶顯示，但不代表真正的等位基因。E.DNA的擴(kuò)增分離出人基因組DNA樣品并如上述測定其濃度后，可在本方法的多重?cái)U(kuò)增步驟中共擴(kuò)增靶基因座?？墒褂酶鞣N不同擴(kuò)增方法擴(kuò)增基因座，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki)P.K.等(1985)，"P一珠蛋白基因組序列的酶促擴(kuò)增及限制位點(diǎn)分析以用于診斷鐮刀細(xì)胞貧血癥"，科學(xué)230:1350-1354)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(Kwoh，D.Y,Kwoh，T丄(1990)，"在基于核酸的診斷途徑中的靶擴(kuò)增系統(tǒng)"，美國生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，1990年10月)以及鏈置換擴(kuò)增(SDA)(Walker,G.T.等(1992)，"由限制酶一DNA聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行的等溫體外擴(kuò)增"，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.89:392-396)。優(yōu)選地，使用特異于該套基因座中每個(gè)基因座的引物對和熱循環(huán)條件經(jīng)PCR擴(kuò)增DNA樣品。下述實(shí)施例中使用的引物序列的詳情請見本說明書最后的序列表，這些序列中的一些是本發(fā)明的另外的實(shí)施方案。下述實(shí)施例中給出了用于本發(fā)明方法中的針對每個(gè)最優(yōu)選基因座組合的最優(yōu)選擴(kuò)增方案的詳情。關(guān)于每個(gè)多重體系的特殊程序的附加細(xì)節(jié)也請見實(shí)施例。在實(shí)施例中使用的基因座特異性引物的序列包括的核苷酸數(shù)目在雜交所用條件下足以使之與待擴(kuò)增的基因座的一個(gè)等位基因雜交并基本上不擴(kuò)增其它基因座的等位基因，請參見Simons的美國專利5，192，659，該專利引入本文作參考，其更詳細(xì)地描述了基因座特異性引物。F.DNA片段的分離和檢測從本發(fā)明的多重?cái)U(kuò)增步驟產(chǎn)生一套擴(kuò)增的等位基因后，評價(jià)擴(kuò)增的等位基因。本方法的評價(jià)步驟可用各種不同方式完成，以下描述最優(yōu)選的方式。優(yōu)選使用電泳分離多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，更優(yōu)選變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(例見Sambrook，J.等(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第13.45-13.57頁)。實(shí)施例1中描述了本發(fā)明方法的評價(jià)步驟中使用的最優(yōu)選的凝膠制備和電泳程序及條件。在變性聚丙烯酰胺凝膠中的DNA片段的分離是基于片段的大小。擴(kuò)增的等位基因在聚丙烯酰胺凝膠中分離后，可顯色凝膠中的等位基因和任何其它DNA(例如，DNA標(biāo)記或等位基因梯)并進(jìn)行分析。凝膠中的DNA的顯色可用任一種現(xiàn)有技術(shù)完成，包括銀染或報(bào)道者如放射性同位素、熒光物、化學(xué)發(fā)光物及與可檢測底物組合的酶。銀染是優(yōu)選的顯色凝膠中的等位基因的方法(例見，Bassam，B丄等(1991)，"聚丙烯酰胺凝膠中的DNA的快速而靈敏的銀染"，分析生物化學(xué)196:80-83)。更優(yōu)選的方法是在多重反應(yīng)中使用針對每個(gè)基因座的放射性標(biāo)記的引物(例見，Hammond等(1994))或熒光標(biāo)記的引物(例見，Schumm等(1994))，之后分別用放射自顯影或熒光檢測劑檢測標(biāo)記的產(chǎn)物。上述三篇描述顯色等位基因的現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻(xiàn)均引入本文。DNA樣品中存在的等位基因優(yōu)選通過與分子量標(biāo)準(zhǔn)如DNA標(biāo)記或基因座特異性等位基因梯比較而確定，從而確定樣品內(nèi)每個(gè)基因座上存在的等位基因。用于評價(jià)含有2個(gè)或多個(gè)多態(tài)性STR基因座的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的最優(yōu)選的分子量標(biāo)記由針對被評價(jià)的每個(gè)基因座的等位基因梯的組合而構(gòu)成。例見，Schumm等，文獻(xiàn)同上，第17826頁的關(guān)于等位基因梯及其構(gòu)建方法的描述。用于評價(jià)含有由使用針對每個(gè)基因座的熒光標(biāo)記引物而產(chǎn)生的2個(gè)或多個(gè)多態(tài)性STR基因座的多重反應(yīng)的優(yōu)選的分子量標(biāo)記由針對被評價(jià)的每個(gè)基因座的熒光標(biāo)記的等位基因梯的組合而構(gòu)成，見上述。構(gòu)建了針對各個(gè)基因座的等位基因梯后，可將它們混合并在上樣擴(kuò)增的樣品的同時(shí)將它們上樣進(jìn)行凝膠電泳。每個(gè)等位基因梯與樣品中的來自相應(yīng)基因座的等位基因共遷移。使用AutomaticProcessorCompatible(APC)膜(STP系統(tǒng)手冊弁TMD004,得自Promega公司，Madison,WI)或使用熒光檢測儀器(STP系統(tǒng)手冊弁TMD006,得自Promega公司，Madison,WI)可以產(chǎn)生數(shù)據(jù)的永久記錄。G.優(yōu)選的檢測技術(shù)熒光檢測在本發(fā)明方法的一個(gè)最優(yōu)選實(shí)施方案中，使用熒光檢測法評價(jià)由多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的混合物中的擴(kuò)增的等位基因。以下簡述了如何優(yōu)選地實(shí)施該檢測方法。由于自動(dòng)熒光成像的出現(xiàn)，可以實(shí)現(xiàn)更快的多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析。對于熒光分析，可以將一個(gè)熒光素化的引物包括在每個(gè)基因座的擴(kuò)增反應(yīng)中。下述實(shí)施例中描述了兩種優(yōu)選的熒光標(biāo)記引物的應(yīng)用，即熒光素標(biāo)記的(FL-)和四甲基羅丹明標(biāo)記的(TMR-)引物。用這種標(biāo)記的引物產(chǎn)生的擴(kuò)增片段的分離與用銀染檢測法相同的方式進(jìn)行。得到的凝膠可用FluorImagerm分析儀(商購自MolecularDynamics,Suraiyvale，CA)或FMBIO頂(商購自HitachiCorporation,SanBruno，CA)分析，兩種儀器可在非常短的時(shí)間內(nèi)例如3-20分鐘掃描凝膠并記錄數(shù)據(jù)?？傊?，本發(fā)明方法最優(yōu)選在評價(jià)步驟使用熒光檢測來進(jìn)行，在這一優(yōu)選的檢測方法中，多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中所用的每對引物對中的一個(gè)引物附著有一個(gè)熒光標(biāo)記，因此由擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增的等位基因是熒光標(biāo)記的。在本發(fā)明的這一最優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增的等位基因隨后在聚丙烯酰胺凝膠上分離并用熒光成像分析儀顯色分析分離的等位基因。熒光檢測要優(yōu)于放射性標(biāo)記的檢測方法是因?yàn)樗恍枋褂梅派湫晕镔|(zhì)，所有與使用這種物質(zhì)相關(guān)的規(guī)章和安全問題也不存在。熒光檢測還優(yōu)于其它非放射性檢測方法如銀染，是因?yàn)闊晒鈾z測方法通常比染色法產(chǎn)生較少的假象，較少的凝膠假象可能很大程度上歸因于在熒光檢測中僅有附著標(biāo)記的DNA擴(kuò)增片段被檢測，而使用銀染檢測方法時(shí)，從多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生的每個(gè)DNA擴(kuò)增片段均被染色和檢測。用銀染染色的聚丙烯酰胺凝膠還有明顯較高的背景，這是由于銀染染料與凝膠本身的非特異性結(jié)合所致，從而降低了檢測凝膠內(nèi)的DNA條帶的靈敏性。下述兩套實(shí)施例中比較了銀染和熒光檢測方法。H.試劑盒本發(fā)明還涉及使用上述方法的試劑盒，基本的試劑盒包括一個(gè)具有一或多個(gè)針對每個(gè)基因座的基因座特異性引物的容器。也可任選地包括使用說明。其它任選的試劑盒成分可包括針對每個(gè)特殊基因座的等位基因梯，足夠量的用于擴(kuò)增的酶，促進(jìn)擴(kuò)增的擴(kuò)增緩沖液，用于制備凝膠電泳所用擴(kuò)增材料的上樣溶液，作為模板對照的人基因組DNA，用于保證材料如預(yù)期那樣在凝膠中遷移的分子量標(biāo)記，以及指導(dǎo)用戶和限制使用錯(cuò)誤的方案和手冊。試劑盒中各種試劑的量也可根據(jù)各種因素如方法的最優(yōu)靈敏度而變化。用于手工應(yīng)用的測試試劑盒或用于自動(dòng)檢測儀或分析儀的測試試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例下述實(shí)施例意在舉例說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)并幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成和使用本發(fā)明。實(shí)施例無意限制本發(fā)明的范圍?；蚪MDNA分離和定量基本上按Puers,C.等(1993)所述進(jìn)行，"使用基因座特異性等位基因梯進(jìn)行的人群分析中多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)基因座HUMTH01[AATG]n上的重復(fù)序列異源性的鑒定以及等位基因的重排"，AnU.Hum.Genet.53:953-958。這些方法通常是本領(lǐng)域人員公知的并且是本發(fā)明的應(yīng)用所優(yōu)選的但不是必須的。通過0.4mm厚含7M尿素4%變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺與雙丙烯酰胺之比為19:l)電泳分離擴(kuò)增的產(chǎn)物(Sambrook等，(1989))，當(dāng)涉及銀染分析時(shí)凝膠與玻璃板化學(xué)交聯(lián)(Kobayashi,Y.(1988),"澆鑄薄測序凝膠的方法"，BRLFocus10:73-74)。在涉及熒光分析時(shí)不采用這種交聯(lián)。DNA樣品與2.5Ul上樣溶液(10mMNaOH，95%甲酰胺，0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯青)混合，在95X:變性2分鐘，并在上樣前冰上冷凍。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用銀染、熒光檢測、放射性檢測或上述檢測方法組合檢測擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物和DNA分子量標(biāo)記對照。在某些實(shí)施例中，使用現(xiàn)有技術(shù)中描述的染色和檢測標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)銀染檢測凝膠中的反應(yīng)產(chǎn)物和分子量標(biāo)記。(例見Bassam等，(1991))。通過AutomaticProcessorCompatible膜(APC膜，Promega公司，貨號(hào)DQ4411)曝光而得到染色凝膠的永久圖像。在其它實(shí)施例中，使用現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法(Schumm等，(1994))經(jīng)熒光掃描進(jìn)行檢測。下述每個(gè)實(shí)施例是本發(fā)明方法的使用例子，在某些情況下，是使用本發(fā)明一或多個(gè)引物的例子以同時(shí)確定在來自一或多個(gè)DNA樣品的至少3個(gè)短串聯(lián)重復(fù)基因座中存在的等位基因。表1和2總結(jié)了在下述每個(gè)實(shí)施例中描述的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中共擴(kuò)增的基因座套，這兩個(gè)表還指出了每個(gè)這種多重反應(yīng)中所使用的用于擴(kuò)增每個(gè)這種基因座的引物對。表1列出了用熒光掃描檢測來自所描述的多重反應(yīng)的擴(kuò)增的等位基因的所有實(shí)施例，而表2列出了用銀染檢測擴(kuò)增的等位基因的實(shí)施例。表1所列的每個(gè)引物對的一個(gè)引物在用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前用熒光標(biāo)記。在某些情況下，使用不同的標(biāo)記物標(biāo)記針對不同基因座的引物，從而使用不同引物產(chǎn)生的等位基因可以用下述實(shí)施例中所用的熒光掃描儀掃描區(qū)分開。在下述實(shí)施例中使用了兩種不同的熒光標(biāo)記物，下表1中"FL"是指熒光標(biāo)記的，"TMR"是指四甲基羅丹明標(biāo)記的。表1還指出在每個(gè)實(shí)施例中用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的每個(gè)引物對的哪個(gè)引物是如此標(biāo)記的(例如，"FL—2"是指SEQIDNO:2的引物在用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前用熒光素在其5，末端標(biāo)記)。下述實(shí)施例中也使用了相同的FL和TMR縮寫。然而其中標(biāo)記物的縮寫置于所述擴(kuò)增反應(yīng)使用的標(biāo)記引物的SEQIDNO之前(例如，"FL—SEQIDNO:2"而非"FL—2")。在下述四對實(shí)施例(實(shí)施例2和3，4和5，7和8，19和23)中，使用相同的引物套、與所分析的每個(gè)STR基因座的每個(gè)引物對中的一個(gè)引物共價(jià)附著的相同熒光標(biāo)記物分析同一套基因座。但是在每個(gè)實(shí)施例中標(biāo)記不同的引物套。本文包含這些實(shí)施例對是為了證明不管在用于本發(fā)明方法的多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前引物對的哪個(gè)引物被標(biāo)記，從同一套引物中均能得到相同的低背景及相同的等位基因鑒定結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>注意到在少數(shù)情況下，相同的基因座套和相同的引物對套出現(xiàn)于表1和表2中。在這種情況下，分別使用熒光檢測和銀染分析相同的等位基因套。本文實(shí)施例24和33，實(shí)施例25和30提供了兩個(gè)這種重復(fù)例子。這些實(shí)施例清楚表明用兩種方法均可獲得相同結(jié)果。表2i<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實(shí)施例1基因座D3S1539，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D3S1539，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/pl在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0，25°C),0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl^Q各200|iiMdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90"C1分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.25]LiMD3S1539引物1[SEQIDNO:7]和2[FL—SEQIDNO:8]，各0.325|uMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0,219nMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375^iMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖1，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例2基因座D17S1298，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D17S1298,D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/iul在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris誦HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200iiMdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.25pMD17S1298引物I[SEQIDNO:9〗和2[FL—SEQIDNO:10]，各0.325|iMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.219|iMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖2，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D17S1298，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例3基因座D17S1298，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測如實(shí)施例2所述擴(kuò)增基因座D17S1298,D7S820，D13S317和D5S818，只是用FL—SEQIDNO:9替換SEQIDNO:9，用SEQIDNO:10替換FL—SEQIDNO:10。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖3，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1—5含有針對基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例4基因座D20S481，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D20S481，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/i^l在25fjl1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl^tl各200pMdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.25D20S481引物1[SEQIDNO:ll]和2[FL—SEQIDNO:12]，各0.325|iMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.219|iiMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375(xMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖4，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D20S481，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例5基因座D20S481，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測如實(shí)施例4所述擴(kuò)增基因座D20S481，D7S820，D13S317和D5S818，只是用FL—SEQIDNO:ll替換SEQIDNO:ll，用SEQIDNO:12替換FL—SEQIDNO:12。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖5，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例6基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/iul在25pi1XSTR緩沖液(50mMKCl，10mMTris陽HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl^H各200|iMdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.70jLiMD9S930引物l[SEQIDNO:13]和2[FL—SEQIDNO:14]，各0.325nMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL-SEQIDNO:4]，各0.375pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖6，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1-5含有針對基因座D9S930，D7S820，D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例7基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239,D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/inl在25jul1XSTR緩沖液(50mMKC1,lOmMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200inMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75pMD10S1239引物l[SEQIDNO:15]和2[FL—SEQIDNO:16]，各0.325|iiMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL-SEQIDNO:2]，各0.22fxMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖7，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D10S1239，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例8基因座D10S1239，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測如實(shí)施例7所述擴(kuò)增基因座D10S1239，D7S820，D13S317和D5S818，只是用FL—SEQIDNO:15替換SEQIDNO:15，用SEQIDNO:16替換FL—SEQIDNO:16。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖8，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例9基因座D14S118，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D14S118，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/iul在25|ul1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0，25。C),0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl^H各200pMdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90"C1分鐘，6(TC1分鐘，70。C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50nMD14S118引物1[SEQIDNO:17]和2[FL—SEQIDNO:18]，各0.325|liMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375|iMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖9，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D14S118，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例10基因座D14S562，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D14S562，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/|11在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9,0，25°C)，0.1%TritonX國IOO,L5rnMMgCl^Q各200pMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90-Cl分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50pMD14S562引物l[FL一SEQIDNO:19]和2[SEQIDNO:20]，各0.325|nMD7S820引物1[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDN0:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQIDN0:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375nMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖10，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例11基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/|^1在25|illXSTR緩沖液(50mMKCl，lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C),0.1%TritonX國IOO，1.5mMMgCl^Q各200pMdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50|iMD14S548引物1[SEQIDNO:21]和2[FL—SEQIDNO:22]，各0.325|iMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375|aMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖11，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D14S548，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例12基因座D16S490，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S490,D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/nl在25pllXSTR緩沖液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200|iMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，6(TC1分鐘，70'C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50jiMD16S490引物l[FL—SEQIDNO:23]和2[SEQIDNO:24]，各0.325jiMD7S820引物1[SEQIDNO:l]和2[FL-SEQIDNO:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQID42N0:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖12，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道l一5含有針對基因座D16S490，D7S820，D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例13基因座D16S753，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S753，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/|11在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1,lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200pMdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50|iMD16S753引物1[SEQIDNO:25]和2[FL—SEQIDNO:26]，各0.325|^MD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22|iMD13S317引物l[SEQIDNO:3〗和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375nMD5S818引物l[SEQIDNO:5〗和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖13，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有43針對基因座D16S753，D7S820，D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例14基因座D17S1299，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D17S1299，D7S820，D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/fil在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0,l%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200iiMdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，7CTC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50nMD17S1299引物l[SEQIDNO:27〗和2[FL—SEQIDNO:28〗，各0.325^MD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22|aMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖14，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D17S1299，D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例15基因座D16S539，D7S820，D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/pl在25jal1XSTR緩沖液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX國IOO,1.5rnMMgCl2和各200pMdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，6(TC1分鐘，70°〇1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.60pMDl6S539引物1[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0.325pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2],各0.22nMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.50(xMD5S818引物l[SEQIDNO:5〗和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖15，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例16基因座D22S683，D7S820,D13S317和D5S818的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D22S683,D7S跳D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/jil在25)^11XSTR緩沖液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C),0.1%TritonX-100,1.5rnMMgC丄2和各200|aMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.50pMD22S683引物1[SEQIDNO:31]和2[FL—SEQIDNO:32]，各0.325pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.375nMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳45分鐘而分離并用Fluorlmager熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖16，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1—5含有針對基因座D22S683,D7S820,D13S317和D5S818同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例17基因座D16S539，D7S820,D13S317，D5S818，HUMCSF1PO和HUMTPOX的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818，HUMCSF1P0和HUMTPOX上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.06UTaqDNA聚合酶/|11在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200|iMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96卩2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的9^C1分鐘，60°C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。C1分鐘，60°C1分鐘，70。C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了12個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.65pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]禾卩2[FL—SEQIDNO:30]，各0.325|uMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.22jaMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.55pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]，各0.40pMHUMCSFIPO引物l[TMR-SEQIDNO:33]和2[SEQIDNO:34]，各0.40pMHUMTPOX引物l[SEQIDNO:35]和2[TMR-SEQIDNO:36]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(Hitachi^ftwareEngineering,SanBruno，CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖17，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一4含有針對基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMCSFIPO("CSF1P0")和HUMTPOX("TPOX")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例18基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818，HUMCSFIPO,HUMTPOX和HUMTHOl的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSFIPO,HUMTPOX和HUMTHOl上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.07UTaqDNA聚合酶/pl在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200nMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60'C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90'C1分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1,5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60'C30分鐘。組合使用了14個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75nMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0.40|iMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.30|iiMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.60(aMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]，各0.30pMHUMCSFIPO引物l[TMR畫SEQID47NO:33]和2[SEQIDNO:34]，各0.40jxMHUMTPOX引物l[SEQIDNO:35]和2[TMR-SEQIDNO:35]，各0,40nMHUMTHOl引物l[SEQIDNO:37]和2[TMR-SEQIDNO:38]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno，CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖18，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一5含有針對基因座D16S539，D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO("CSF1PO"),HUMTPOX("TPOX")和HUMTHOl("TH01")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例19基因座D16S539,D7S820,D13S317，D5S818,HUMCSFIPO，HUMTPOX,HUMTHOl和HUMvWFA31的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820,D13S317,D5S818，HUMCSF1P0，HUMTPOX，HUMTHOl和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.08UTaqDNA聚合酶4d在25fil1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris垂HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各20(HiMdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，60'C1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60'C30分鐘。組合使用了16個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0.40pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.30jxMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.60pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]48和2[FL—SEQIDNO:6]，各0.30nMHUMCSF1PO引物l[TMR-SEQIDNO:33〗和2[SEQIDNO:34]，各0.40|xMHUMTPOX引物l[SEQIDNO:35]和2[TMR-SEQIDNO:36]，各0.40jiMHUMTHOl引物l[SEQIDNO:37]和2[TMR-SEQIDNO:38]，各0.40|^MHUMvWFA31引物1[SEQIDNO:39]和2[TMR-SEQIDNO:40]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖19，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一5含有針對基因座D16S539，D7S820,D13S317，D5S818，HUMCSF1PO("CSFIPO，，)，HUMTPOX("TPOX")HUMTHOl("TH01")和HUMvWFA31("vWF")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例20基因座D16S539,D7S820，D13S317,D5S818，HUMF13A01和HUMFESFPS的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01禾QHUMFESFPS上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.06UTaqDNA聚合酶/inl在25^11XSTR緩沖液(50mMKCl，10mMTris誦HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200nMdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94。C1分鐘，60°C1分鐘和7(TC1,5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90'C1分鐘，60°C1分鐘，70""C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了12個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75iaMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0.40|^VID7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.30|iMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.60pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]，各0.10iiMHUMF13A01引物l[TMR畫SEQIDNO:41]和2[SEQIDNO:42]，各1.0|aMHUMFESFPS引物l[TMR-SEQIDNO:43]和2[SEQIDNO:44]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno，CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖20，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一5含有針對基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01("F13A01")禾口HUMFESFPS("FESFPS")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例21基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818，HUMF13A01，HUMFESFPS和HUMBFXIII的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818，HUMF13A01，HUMFESFPS和HUMBFXIII上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.07UTaqDNA聚合酶/fil在25pl1XSTR緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200fiMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70。C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的9(TC1分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60'C30分鐘。組合使用了14個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0.40iuMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.30pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDN0:4]，各0.60nMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL—SEQIDNO:6]，各0.10pMHUMF13A01引物l[TMR-SEQIDNO:41]和2[SEQIDNO:42]，各1.0|iMHUMFESFPS引物l[TMR國SEQIDNO:43]和2[SEQIDNO:44]，各0.50|iMHUMBFXIII引物l[TMR-SEQIDNO:45]和2[SEQIDNO:46]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖21，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一5含有針對基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01("F13A01")，HUMFESFPS("FESFPS")禾口HUMBFXIII("F13B")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例22基因座D16S539，D7S820，D13S317,D5S818,HUMF13A01，HUMFESFPS,HUMBFXIII和HUMLIPOL的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01，HUMFESFPS,HUMBFXIII和HUMLIPOL上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.08UTaqDNA聚合酶/nl在25|al1XSTR緩沖液(50rnMKC1，10mMTris隱HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200jnMdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90-Cl分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了16個(gè)擴(kuò)增引物，各0.75nMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[FL—SEQIDNO:30]，各0,40pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[FL—SEQIDNO:2]，各0.30pMD13S317引物l[SEQIDNO:3〗和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.60iliMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[FL-SEQIDNO:6]，各0.10iaMHUMF13A01引物l[TMR-SEQIDNO:41]和2[SEQIDNO:42]，各1.OpMHUMFESFPS引物l[TMR-SEQIDNO:43]和2[SEQIDNO:44〗，各0.50nMHUMBFXIII引物l[TMR-SEQIDNO:45]和2[SEQIDNO:46]，各0.20pMHUMLIPOL引物1[TMR-SEQIDNO:47〗和2[SEQIDNO:48〗擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorlmager(HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖22，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nni掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一5含有針對基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818,HUMF13A01("F13A01")，HUMFESFPS("FESFPS，，)禾口HUMBFXin("F13B")和HUMLIPOL("LPL")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例23基因座D16S539，D7S820，D13S317，D5S818，HUMCSF1PO,HUMTPOX，HUMTHOl和HUMvWFA31的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820,D13S317，D5S818，HUMCSFIPO，HUMTPOX，HUMTHOl和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.08UTaqDNA聚合酶/jxl在25|il1XSTR緩沖液(50rnMKC1，10mMTris國HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-IOO，L5mMMgCl2和各200jxlMdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94'C1分鐘，6(TC1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，6(TC1分鐘，70'C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了16個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[TMR—SEQIDNO:30]，各0.40pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[TMR—SEQIDN0:2]，各0,30pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[TMR—SEQIDNO:4]，各0.60pMD5S818引物l[SEQIDNO:5]和2[TMR—SEQIDNO:6]，各0.40|iMHUMCSF1PO引物l[FL-SEQIDNO:33]和2[SEQIDNO:34]，各0,50^MHUMTPOX引物l[SEQIDNO:35]和2[FL—SEQIDNO:36]，各0.20(iMHUMTHOl引物l[SEQIDNO:37]和2[FL—SEQIDNO:38]，各0.55pMHUMvWFA31引物l[SEQIDNO:39]和2[FL-SEQIDNO:40]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FMBIOFluorImager((HitachiSoftwareEngineering,SanBruno,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖23，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示熒光素標(biāo)記的和四甲基羅丹明標(biāo)記的材料。泳道1一3含有針對基因座D16S539，D7S820,D13S317,D5S818，HUMCSF1PO("CSFIPO")，HUMTPOX("TPOX")，HUMTHOl("TH01")和HUMvWFA31("vWA")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例24基因座D3S1539，D19S253,D13S317和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D3S1539，D19S253,D13S317和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/pl在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0,25。C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgC^和各200(MdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.75nMD3S1539引物l[SEQIDN0:7]和2[FL—SEQIDNO:49]，各0.75pMD19S253引物l[FL—SEQIDNO:50]和2[SEQIDNO:51]，各0.50(iMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[FL—SEQIDNO:4]，各0.50pM和D20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[FL—SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FluorlmagerTM(熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖24，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D3S1539,D19S253，D13S317和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例25基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的熒光檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/|11在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200(MdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.30pMD10S1239引物l[FL一SEQIDNO:15]和2[SEQIDNO:54]，各0.40pMD9S930引物l[SEQIDNO:55]和2[FL—SEQIDN0:14〗，各0.50|iMD4S2368引物l[SEQIDNO:56]和2[FL—SEQIDNO:57]，各0.50nMD20S48引物l[SEQIDNO:52]和2[FL—SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并用FluorImager(熒光掃描儀(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)檢測熒光信號(hào)而顯示產(chǎn)物。參見圖25，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例26基因座D16S539，D7S820和D13S317的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820和D13S317上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5—20ng模板和0.03UTaqDNA聚合酶/pl在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-100,L5mMMgCl2和各200(MdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96。C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90'C1分鐘，6CTC1分鐘，70'C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.5pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[SEQIDNO:58〗，各0.5pMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[SEQIDNO:2]，各0.5|_iMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[SEQIDNO:4]。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖26，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一4含有針對基因座D16S539，D7S820和D13S317同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品，55泳道5顯示了進(jìn)行相同程序但無DNA模板的樣品，即陰性對照。實(shí)施例27基因座D16S539,D7S820,D13S317和HUMv曹A31的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D16S539，D7S820，D13S317和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/|11在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1,lOmMTris-HCl(pH9.0，25°C),0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200(MdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer，F(xiàn)osterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.3pMD16S539引物l[SEQIDNO:29]和2[SEQIDNO:30]，各0.3(xMD7S820引物l[SEQIDNO:l]和2[SEQIDNO:2]，各0.5pMD13S317引物1[SEQIDNO:3]和2[SEQIDNO:4]，各0.5pMHUMvWFA31引物l[SEQIDNO:59]和2[SEQIDNO:60〗。擴(kuò)增產(chǎn)物在32cm凝膠上經(jīng)40W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳50分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖27，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一3含有針對基因座D16S539，D7S820,D13S317和HUMvWFA31("vWA")同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例28基因座D10S1239，D9S930和D13S317的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D13S317上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用未確定ng數(shù)模板和0.03UTaqDNA聚合酶爾l在25(_il1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0，25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200(MdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，6CTC1分鐘，70。C1.5分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各l.O^MD10S1239引物l[SEQIDNO:15]和2[SEQIDNO:54]，各0.3jiMD9S930引物l[SEQIDNO:55]和2[SEQIDNO:61]，各0.5pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[SEQIDNO:4]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳60分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖28，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一3含有針對基因座D10S1239，D9S930和D13S317同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣p實(shí)施例29基因座D10S1239，D9S930和D4S2368的多重?cái)U(kuò)增的銀在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239，D9S930和D4S2368上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用未確定ng數(shù)模板和0.03UTaqDNA聚合酶/^1在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0,25°C),0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl^Q各200(MdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，6(TC1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60'C30分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各1.OnMD1OS1239引物1[SEQIDNO:15]和2[SEQIDNO:54]，各0.3pMD9S930引物l[SEQIDNO:55]和2[SEQIDNO:61]，各0.15|iMD4S2368引物l[SEQIDNO:56]和2[SEQIDNO:57〗。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳60分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖29，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一6含有針對基因座D10S1239，D9S930和D4S2368同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣p實(shí)施例30基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239，D9S930，D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用未確定ng數(shù)模板和0.04UTaqDNA聚合酶/iul在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0，25°C),0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200(MdATP，dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity，CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后IO個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60'C30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各1.OpMD1OS1239引物1[SEQIDNO:15]和2[SEQIDNO:54〗，各4.0|aMD9S930引物l[SEQIDNO:55]和2[SEQIDNO:14〗，各0.2pMD4S2368引物l[SEQIDNO:56〗和2[SEQIDNO:57]，各0.2pMD20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[SEQIDNO:53〗。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳67分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖30，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一4含有針對基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品。實(shí)施例31基因座D3S1539，D19S253和D13S317的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D3S1539，D19S253和D13S317上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5.0ng模板和0.03UTaqDNA聚合酶/jil在25|il1XSTR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl2和各200(MdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94。C1分鐘，60°C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90t:i分鐘，6(TC1分鐘，70'C1.5分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各1.0pMD3S1539引物l[SEQIDNO:7]和2[SEQIDNO:49]，各1.0|iMD19S253引物l[SEQIDNO:50]和2[SEQIDNO:51]，各0.5pMD13S317引物l[SEQIDNO:3]和2[SEQIDNO:4]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳65分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖31，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一4含有針對基因座D3S1539，D19S253和D13S317同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品，泳道5顯示了進(jìn)行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對昭。y、"o實(shí)施例32基因座D3S1539，D19S253，D4S2368和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D3S1539,D19S253，D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用5.0ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/jil在25^11XSTR緩沖液(50mMKC1，lOmMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0,l0/oTritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200(MdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中迸行。用熱循環(huán)儀FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96""C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。C1分鐘，60。C1分鐘，70。C1.5分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各1.0pMD3S1539引物l[SEQIDNO:7]和2[SEQIDNO:49]，各0.5pMD19S253引物l[SEQIDNO:50]和2[SEQIDNO:51]，各O.lfiMD4S2368引物l[SEQIDNO:56]和2[SEQIDNO:57]，各O.ljaMD20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳65分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖32，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一4含有針對基因座D3S1539，D19S253，D4S2368和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增.的DNA樣品，泳道5顯示了進(jìn)行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實(shí)施例33基因座D3S1539，D19S253，D13S317和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D3S1539，D19S253，D13S317和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用0.5—250ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/inl在25pl1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl2和各200(MdATP，dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94'C1分鐘，60'C1分鐘和7(TC1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，7(TC1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的6(TC30分鐘。組合使用了8個(gè)擴(kuò)增引物，包括各0.5pMD3S1539引物1[SEQIDNO:7]和2[SEQIDNO:49],各0.5pMD19S253引物l[SEQIDNO:50]和2[SEQIDNO:51]，各0.5nMDl3S317引物1[SEQIDNO:3]和2[SEQIDNO:4]，各0.2nMD20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳68分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖33，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D3S1539，D19S253，D13S317和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品，泳道6顯示了進(jìn)行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實(shí)施例34基因座D10S1239，D9S930和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測.在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239,D9S930和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用0.5—250ng模板和0.03UTaqDNA聚合酶/nl在25|il1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-100,1.5mMMgCl^tl各200(MdATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90°C1分鐘，60°C1分鐘，70°C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60°C30分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各I.OjiMD10S1239引物l[SEQIDNO:15〗和2[SEQIDNO:54]，各4.0|nMD9S930引物l[SEQIDNO:55]和2[SEQIDNO:14],各0.2^MD20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳68分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖34，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D10S1239，D9S930和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣61品，泳道6顯示了進(jìn)行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對昭。"、、o實(shí)施例35基因座D10S1239，D4S2368和D20S481的多重?cái)U(kuò)增的銀染檢測在本實(shí)施例中，在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增在各個(gè)基因座D10S1239，D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴(kuò)增用0.5—250ng模板和0.03UTaqDNA聚合酶/pl在25(il1XSTR緩沖液(50mMKC1，10mMTris-HCl(pH9.0,25°C)，0.1%TritonX-IOO，1.5mMMgCl^Q各200(MdATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進(jìn)行。用熱循環(huán)儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進(jìn)行下述擴(kuò)增方案96°C2分鐘，然后10個(gè)循環(huán)的94°C1分鐘，60°C1分鐘和70°C1.5分鐘，之后20個(gè)循環(huán)的90。Cl分鐘，60。Cl分鐘，70。C1.5分鐘，最后1個(gè)循環(huán)的60。C30分鐘。組合使用了6個(gè)擴(kuò)增引物，包括各I.OjiMD10S1239引物l[SEQIDNO:15]和2[SEQIDNO:54],各0,2pMD4S2368引物l[SEQIDNO:56]和2[SEQIDNO:57]，各0.2jiMD20S481引物l[SEQIDNO:52]和2[SEQIDNO:53]。擴(kuò)增產(chǎn)物在40cm凝膠上經(jīng)60W變性聚丙烯酰胺凝膠電泳68分鐘而分離并根據(jù)Bassam等(1991)的方案經(jīng)銀染分析顯示產(chǎn)物。參見圖35，該圖顯示了每個(gè)基因座的擴(kuò)增片段，泳道1一5含有針對基因座D10S1239，D4S2368和D20S481同時(shí)共擴(kuò)增的DNA樣品，泳道6顯示了進(jìn)行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對序列表<110>普羅梅加公司<120>短串聯(lián)重復(fù)基因座的多重?cái)U(kuò)增<130>HKSIT59654<160>Sl<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>1gaacacttgtcatagtttagaacg24<210>2<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>2ctgaggtatcaaaaactcagagg<210>3<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400:>3acagaagtctgggatgtgga20<210>4<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>4gcccaaaaagacagacagaa20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula><210>10<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>10tgtcagtaaacctgtgacctgagt24<210>11<211>26<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>p:rime:r<400>11aatggtgagaaatgggttatgagtgc<210>12<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>12tttccggctttgtgtcataaaacag<210>13<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence■<220><223>primer<400>13tggacaacagagtgagatgc<210>14<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>14gctatgggaattacaagcaggaa23<210>15<211>26<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>15ctttgaaatggacccctagctaatgt26<210>16<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>16caccctgtccccagctatctg21<210>17<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primeir<400>17cagcttgggcaacataggg19<210>18<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>18caaactcctgaggtcaaacaatcc24<210>19<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primei:66<400>19cttggagggtggggtggctaa21<210>20<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>20cgaaattttgttgccttgctctgg24<210>21<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primer<400>21cctgggcaacagagtgagact21<210>22<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primer<400>22acccagctttaacagtttgtgctt24<210>23<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primer<400>23gggcggacacagaatgtaaaatc23<210>24<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:aaacccaaatagatgacaggcaca24<210>25<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:<400>25gcactccaggctgaatgacaigaac24<210>26<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>26gcagtgccgcctatttttgtgaat24<210>27<211>24'<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>27accctgatgagatagcacttgagc24<210>28<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primer<400>28cactgtgtggaggtgtagcagaga24<210:>29<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220>68:223:primer<400>29gggggtctaagagcttgtaaaaag24<210>30<211>2S<212:>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:<400>30tgtgcatctgtaagcatgtatctatc26<210>31<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primsr<400>31cgaaggttgcattgagccaagat23<210>32<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primsr<400>32tggtggaaatgcctcatgtagaaa24<210>33<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primer<400>33aacctgagtctgccaaggactagc24<210>34<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>34ttccacacaccactggccatcttc24<210>3S<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primsr<400>35actggcacagaacaggcacttagg24<210>36<211>24<212>DUA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>36ggaggaactgggaaccacacaggt<210>37<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>37attcaaagggtatctgggctctgg<210>38<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:primsr<400>38gtgggctgaaaagctcccgattat24<210>39<211>29<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>39gaaagccctagtggaitgataagaataatc29<210>40<211>30<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>40ggacagatgataaatacataggatggatgg<210>41<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>41gaggttgcactccagcctttgcaa<210>42<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>42ttcctgaatcatcccagagccaca<210>43<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>43gctgttaattcatgtagggaagg<210>44<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>44gtagtcccagctacttggctactc24<210>45<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:pritnsr<400>45tgaggtggtgtactaccata20<210>46<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:<400>46gatcatgccattgcactcta20<210>47<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>47ctgaccaaggatagtgggatatag<210>48<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>48ggtaactgagcgagactgtgtct<210>49<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>49ccaccctttcagcaccag18<210>50<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>50atagacagacagacggactg<210>51<211>19<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>51gggagtggagattacccct<210>52<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>52aaagctctctgaagcaggtgt<210>53<211:24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>53cagattgcsictsgaaageigaigg貼<210>54<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220>■<223>primer<400>54caccctgtccccagctatctgga23<210>55<211=27<212:>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>55agttgaatcttgagtctctcagagtca<210>56<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>prime]:<400>56tgtactcattttcccgcaatgatg<210>57<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>primer<400>57tcagaaagtagggtctgggctctt<210>58<211>28<212>DNA<213>Artificial<220><223>primer<400>58tgtgcatctgtaagcatgtatctatcat28<210>59<211>32<212>DNA<213>Artificial<220><223>primer<400>59gaaagccctagtggatgataagaataatcagt32<210>60<211>33<212>DNA<213>ArtificialSequence<220:<223:<400>60ggacagatgataaatacataggatggatggata33<210>61<211>25<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>pirime:r<400>61gctatgggaattaicaagcaggaaac7權(quán)利要求1、一種同時(shí)確定來自一或多個(gè)DNA樣品的至少4個(gè)短串聯(lián)重復(fù)基因座中存在的等位基因的方法，包括a.選擇該DNA樣品的能一起擴(kuò)增的一套至少4個(gè)短串聯(lián)重復(fù)基因座，其中該套基因座中的3個(gè)基因座是D7S820、D13S317和D5S818；b.在一多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中共擴(kuò)增該套基因座，其中反應(yīng)產(chǎn)物是從該套共擴(kuò)增基因座的每個(gè)基因座擴(kuò)增的等位基因的混合物；以及c.評價(jià)混合物中的擴(kuò)增的等位基因以確定在該DNA樣品內(nèi)的該套基因座中所分析的每個(gè)基因座存在的等位基因。2、權(quán)利要求1的方法，其中多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)是使用位于所分析的至少4個(gè)基因座兩側(cè)的至少4對引物進(jìn)行的。3、權(quán)利要求2的方法，還包括篩選用于多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)的引物對的步驟，所述引物對能從每個(gè)基因座產(chǎn)生當(dāng)用凝膠電泳分離時(shí)與共擴(kuò)增的該套基因座中的其它基因座的等位基因不重疊的等位基因。4、權(quán)利要求1的方法，其中多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈反應(yīng)。5、權(quán)利要求1的方法，其中通過將擴(kuò)增的等位基因與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較而評價(jià)擴(kuò)增的等位基因，其中分子量標(biāo)準(zhǔn)選自DNA標(biāo)記物和基因座特異性等位基因梯。6、權(quán)利要求1的方法，其中用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等位基因并形成分離的等位基因的聚丙烯酰胺凝膠而評價(jià)擴(kuò)增的等位基因。7、權(quán)利要求6的方法，其中聚丙烯酰胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。8、權(quán)利要求6的方法，其中在共擴(kuò)增基因座時(shí)使用能與該套基因座中的每個(gè)基因座兩側(cè)的區(qū)域結(jié)合的引物，其中在共擴(kuò)增每個(gè)基因座中使用的至少一個(gè)引物具有與其共價(jià)附著的熒光標(biāo)記，從而由其產(chǎn)生的擴(kuò)增的等位基因是熒光標(biāo)記的，并且其中聚丙烯酰胺凝膠中的分離的等位基因通過用熒光分析顯色等位基因而確定。9、權(quán)利要求8的方法，其中熒光標(biāo)記選自熒光素標(biāo)記和四甲基羅丹明標(biāo)記。全文摘要本發(fā)明涉及用PCR或其它擴(kuò)增系統(tǒng)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)獨(dú)立的基因座，以在一個(gè)多重反應(yīng)中確定在該多重反應(yīng)中所含的每個(gè)基因座的等位基因。所分析的基因座包括下述基因座HUMvWFA31，HUMLIPOL，HUMBFXIII，HUMF13A01，HUMFESFPS，HUMTH01，HUMTPOX，HUMCSF1PO，D22S683，D20S481，D19S253，D17S1299，D17S1298，D16S753，D16S539，D16S490，D14S562，D14S548，D14S118，D13S317，D10S1299，D9S930，D7S820，D5S818，D4S2368，D3S1539。文檔編號(hào)C12P19/34GK101323880SQ20081012882公開日2008年12月17日申請日期1997年4月15日優(yōu)先權(quán)日1996年4月15日發(fā)明者凱瑟琳·A·米卡,唐·R·拉巴契,詹姆斯·W·舒姆申請人:普羅梅加公司