專利名稱：Muc1串聯(lián)重復(fù)序列多肽及其制備工藝以及作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)一種MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽及其制備工藝，本發(fā)明還提供了該多 肽作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
MUC1是mucin黏蛋白家族成員之一，由多肽骨架(核芯肽)和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。 MUC1的多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段三部分組成。胞外段含有數(shù)目不等的串 聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats, VNTRs)，每個(gè)重復(fù)序列含有20個(gè)氨 基酸，艮卩SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT。不同個(gè)體的VNTRs數(shù)量從20-125不等。
MUC1主要分布在上皮細(xì)胞及其來(lái)源的腫瘤細(xì)胞(乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺 癌等)以及多種血液腫瘤細(xì)胞表面。正常組織MUC1與腫瘤組織不同，前者糖基化豐 富，與免疫細(xì)胞相對(duì)隔離；而后者異常豐富地表達(dá)于癌細(xì)胞表面，糖基化不完全，因 此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)1 。
MUC1生物學(xué)功能除潤(rùn)滑、保護(hù)及調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附等機(jī)械作用外，MUC1作為 一個(gè)癌基因可導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。對(duì)可溶性MUC1的研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制的作用。 在高表達(dá)MUC1腺癌患者體液中可發(fā)現(xiàn)較高含量的可溶性MUC1，可溶性MUC1 —部 分可能來(lái)源于腫瘤細(xì)胞表面MUC1脫落，另一部分可能來(lái)源于選擇性地RNA剪切。 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來(lái)源的可溶性MUC1不能被DC細(xì)胞提呈，限制了Thl的活化，從而使 腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。經(jīng)檢索相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)，MUC1多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞直接作 用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)一種MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽，
本發(fā)明還提供了上述MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的制備工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了該多肽作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí) MUC1串聯(lián)重復(fù)序列的多肽能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤作用。本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽，為MUC1多肽骨架的串聯(lián)重復(fù)序列20個(gè)氮基 酸組成的1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)，分子量大約1.87KD 18.7 KD。 串聯(lián)重復(fù)的20個(gè)氨基酸序列SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT
串聯(lián)重復(fù)可從上述排列中任何一個(gè)氨基酸起始合成。
本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的制備工藝，包括以下步驟
采用MUC1多肽骨架中20個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)序列，選擇1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列 的cDNA片段連入pGEX-4T-l載體，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a;經(jīng)氨節(jié)青 霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過(guò)酶切及基因測(cè)序分析插入片段；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，通過(guò)0.3 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)篩選獲得穩(wěn)定的表達(dá)菌株 pGEX-MUCl/DH5a;煮沸裂解少量細(xì)菌,經(jīng)10% SDS-PAGE分析MUC1-GST融合蛋 白的表達(dá)，通過(guò)Western blotting鑒定特異的表達(dá)條帶；大量培養(yǎng)的工程菌，超聲破碎 后留取上清通過(guò)Glutathione—Sepharose 4B親和層純化人MUCl-GST融合蛋白；再通 過(guò)凝血酶裂解獲得純的MUC1多肽.將MUC1多肽做成藥物制劑。
本發(fā)明MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用MUC1核芯肽的20 個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)序列多肽不僅在體外能抑制許多腫瘤細(xì)胞增殖，而且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也可 抑制腫瘤生長(zhǎng)。
本發(fā)明的積極效果在于首次發(fā)現(xiàn)MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽不僅能抑制血液腫瘤的 增殖，而且還能抑制實(shí)體瘤細(xì)胞的增殖，并且能抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。為腫瘤治療提 供新的藥物。
本發(fā)明適用于下述醫(yī)療用途
1、 治療淋巴細(xì)胞白血病
2、 治療粒細(xì)胞白血病
3、 治療肝癌
4、 治療表達(dá)MUC1蛋白的各種惡性腫瘤 下述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 MUC1具有抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)例l
1.主要試劑與材料
新生牛血清(NCS)購(gòu)自杭州四季青公司，IMDM購(gòu)于Gibico公司。MUC1多肽 (BO氨基酸)為本室制備。錐蟲(chóng)藍(lán)(Trypan Blue)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
人T淋巴瘤細(xì)胞株Jurkat、人B淋巴瘤細(xì)胞Raji,人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株U937、 人肝癌細(xì)胞株SMMC7721均購(gòu)于ATCC (Rockville， MD)。細(xì)胞在含10%新生牛血清， 100U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素的IMDM (Iscove，s Modified Dulbecco，s Medium) 培養(yǎng)液，5%C02孵箱37。C培養(yǎng)。
2.2錐蟲(chóng)藍(lán)染色法檢測(cè)MUCl多肽對(duì)Jurkat 、 Raji、 U937、 SMCC7721細(xì)胞增殖的影 響
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞濃度為1x106/ml, 100pl/孔加入96孔板，并加入MUCl多 肽，終濃度為IO、 20、 40pg/ml， 5。/。C02孵箱中37'C培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)48h后用錐 蟲(chóng)藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞。生長(zhǎng)抑制率(％)= (l-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù))x100。/。。 3.結(jié)果
結(jié)果如表1所示，MUCl多肽以劑量依賴關(guān)系抑制Jurkat、Raji、U937、SMCC7721 細(xì)胞增殖。Jurkat細(xì)胞在給予40 pg/ml MUCl多肽刺激時(shí)抑制最強(qiáng)，抑制率為46.2 ± 6.2% (P<0.01)。 Raji細(xì)胞在給予60 ^ig/ml MUCl多肽剌激時(shí)抑制作用最強(qiáng)，抑制率 為48.8±8.4% (P<0.01)(表2)。 MUCl多肽對(duì)U937細(xì)胞增殖抑制較弱，在給予40 (ig/ml MUCl多肽刺激時(shí)抑制率可達(dá)到15.1 ± 1.5 % (表3)。。 SMCC7721在給予60 |ig/mlMUCl多肽刺激時(shí)抑制率可達(dá)到50.0 ±6.9% (P<0.01) 表1. MUCl多肽對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的抑制作用
劑量(昭/ml)_細(xì)胞增殖抑制率(％)
0 0
10 31.9±4.9
20 37.0 ±1.7
_^2_46.2 土 6.5_
表2. MUCl多肽對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制作用
劑量(pg/ml)_細(xì)胞增殖抑制率(％)0 0
10 0
20 12.0 ±4.7
40 20.7 ±1.9
60 48.8 ± 8.4
表3. MUC1多肽對(duì)U937細(xì)胞增殖的抑制作用
劑量(嗎/ml)_細(xì)胞增殖抑制率(％)
0 0 10 0 20 1.4 ±5.6
40 15.1 ±1.5
表4. MUC1多肽對(duì)SMCC7721細(xì)胞增殖的抑制作用
劑量(嗎/ml)_細(xì)胞增殖抑制率(％)
5 5
2.5 0
5 0
10 36.3 ±4.2
20 21.0 ±3.9
40 50.0 ±6.9
4.結(jié)論MUC1多肽可明顯抑制人類T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞、B淋巴 細(xì)胞白血病細(xì)胞株Raji細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株SMCC7721細(xì)胞增殖，輕度抑制單核細(xì)胞白 血病細(xì)胞株U937細(xì)胞增殖。
實(shí)驗(yàn)例2
1. 材料和設(shè)備Jurkat細(xì)胞，PI染色液，MUC1多肽，流式細(xì)胞儀。
2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MUC1對(duì)Jurkat細(xì)胞周期的影響
首先采用MUC1多肽40 pg/ml剌激Jurkat細(xì)胞48 h，收集口106個(gè)細(xì)胞，PBS洗 滌2次后，加入600^1PBS重懸細(xì)胞，75%乙醇固定-20過(guò)夜，加PI染色液0.5 ml (50jag/mlPI， 10嗎/mlRNaseA， 0.03% TritonX-lOO)避光染色30min，用流式細(xì)胞儀 進(jìn)行檢測(cè)。3. 結(jié)果
采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)40 pg/ml MUC1多肽剌激48 h后Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)周期，結(jié)果 顯示Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)周期中S期細(xì)胞數(shù)由76.47%降至72.41%， G2/M期細(xì)胞數(shù)由9.05% 降至7.36%。 G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯增加由14.03%增加到20.24%，但未見(jiàn)凋亡峰，提示 MUC1多肽誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
4. 結(jié)論MUC1多肽誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期 實(shí)驗(yàn)例3
1. BALB/C小鼠24只購(gòu)自吉林大學(xué)動(dòng)物中心，Jurkat細(xì)胞,MUC1多肽。
2. 人T淋巴細(xì)胞白血病小鼠皮膚移植瘤模型的建立
24只小鼠經(jīng)5 Gry X射線照射后4小時(shí)，給與背部皮下注射Jurkat細(xì)胞4 x 106/ 只后，MUC1 120pg/只尾靜脈注射，隔日一次共三次。次日開(kāi)始每天給與免疫抑制劑 FTY-720 3mg/kg灌胃連續(xù)6天。腫瘤接種第八天處死小鼠，用卡尺測(cè)量皮下腫瘤大小， 分離腫瘤，福爾馬林固定，病理檢測(cè)。
3. 結(jié)果
如表5所示MUC1多肽明顯抑制了人類T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)。 表5. MUC1多肽對(duì)小鼠異種移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用(n = 6)
鼠號(hào) 腫瘤體積(mm3)
PBS對(duì)照組MUC1多肽組
1835390
2734263
3929803
4368983
51287656
62508612
4.結(jié)論MUC1多肽可抑制小鼠皮膚移植瘤人類T淋巴細(xì)胞白血病的生長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)例4
1. 材料淋巴細(xì)胞分離液、植物血凝素(PHA)、 IL-2購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。
2. 錐蟲(chóng)藍(lán)染色法檢測(cè)可溶性MUC1多肽對(duì)活化的人淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)影響采用淋巴細(xì)胞分離液分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2x106/ml, 100 pl/孔加入96孔板，5 pg/ml PHA刺激72 h， PBS洗滌2次后，再用100 U/ml IL-2刺 激72 h。然后IMDM調(diào)淋巴細(xì)胞濃度為1.5x106 /ml， 100 pl/孔加入96孔板，并加入 MUC1多肽至終濃度為10、 20、 40嗎/ml， 5 % C02孵箱37。C培養(yǎng)48 h，錐蟲(chóng)藍(lán)染 色計(jì)數(shù)活細(xì)胞.
3. 結(jié)果將人外周血淋巴細(xì)胞通過(guò)PHA活化及IL-2擴(kuò)增后加入MUC1多肽培養(yǎng)48h， 計(jì)數(shù)活細(xì)胞結(jié)果顯示，MUC1多肽對(duì)活化的人淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎無(wú)影響
4. 結(jié)論MUC1多肽對(duì)活化的人淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響
具體實(shí)施例方式
通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離 本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任 何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。 實(shí)施例l
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸APDTRPAPGSTAPPAHGVTS組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，連入pGEX-4T-l載體，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌DH5oc。經(jīng)氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過(guò)酶切及基因測(cè)序分析插入片段。將 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,通過(guò)0.3 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)篩選獲得穩(wěn)定的表 達(dá)菌株pGEX-MUCl/DH5a。煮沸裂解少量細(xì)菌，經(jīng)10。/。SDS-PAGE分析MUC1-GST 融合蛋白的表達(dá)，通過(guò)Western blotting鑒定特異的表達(dá)條帶。大量培養(yǎng)的工程菌，超 聲破碎后留取上清通過(guò)Glutathione-Sepharose 4B親和層純化人MUC1-GST融合蛋白。 再通過(guò)凝血酶裂解獲得純的MUC1多肽.將MUC1多肽，做成藥物制劑。 實(shí)施例2
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸PPAHGVTSAPDTRPAPGSTA組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做藥 物制劑。 實(shí)施例3
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸DTRPAPGSTAPPAHGVTSAP組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例4
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸APGSTAPPAHGVTSAPDTRP組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例5
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸TRPAPGSTAPPAHGVTSAPD組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例6
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸RPAPGSTAPPAHGVTSAPDT組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例7
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例8
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸STAPPAHGVTSAPDTRPAPG組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例9MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸PGSTAPPAHGVTSAPDTRPA組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例10
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例11
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例12
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例13
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸APPAHGVTSAPDTRPAPGST組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成
藥物制劑。 實(shí)施例14
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。實(shí)施例15
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例16
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例17
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例18
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸GVTSAPDTRPAPGSTAPPAH組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例19
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸TSAPDTRPAPGSTAPPAHGV組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成 藥物制劑。 實(shí)施例20
MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的合成
采用MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽20個(gè)氨基酸TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS組成的 1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段，按照實(shí)施例1所述工藝合成MUC1多肽，做成藥物制劑。
實(shí)施例21
MUCl串聯(lián)重復(fù)序列多肽的應(yīng)用
將MUCl多肽做成靜脈注射制劑，治療T， B淋巴細(xì)胞白血病、肝癌及表達(dá)MUCl 蛋白的各種腺癌。 實(shí)施例22
MUCl串聯(lián)重復(fù)序列多肽的應(yīng)用
將MUCl多肽做成口服制劑，治療各種表達(dá)MUCl惡性腫瘤。
權(quán)利要求
1、MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽，為MUC1多肽骨架的20個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)序列，由1～10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列組成，分子量為1.87KD～18.7KD；串聯(lián)重復(fù)的20個(gè)氨基酸序列SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT串聯(lián)重復(fù)可從上述排列中任何一個(gè)氨基酸起始合成。
2、 權(quán)利要求1所述的MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽的制備工藝，包 括以下步驟-采用MUC1 20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列，選擇1 10個(gè)串聯(lián)重復(fù) 序列的cDNA片段連入pGEX-4T-1載體，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5oc;經(jīng)氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過(guò)酶切及基因測(cè)序分析插 入片段；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，通過(guò)0. 3 mM IPTG誘導(dǎo)表 達(dá)，通過(guò)篩選獲得穩(wěn)定的表達(dá)菌株pGEX-MUCl/DH5a ;煮沸裂解少量細(xì)菌，經(jīng)10。/。SDS-PAGE分析MUCl-GST融合蛋白的表達(dá)，通過(guò)Western blotting鑒定特異的表達(dá)條帶；大量培養(yǎng)的工程菌，超聲破碎后留 取上清通過(guò)Glutathione--S印harose 4B親和層純化人MUC1-GST融 合蛋白；再通過(guò)凝血酶裂解獲得純的MUC1多肽，將MUC1多肽做成藥 物制劑。
3、 MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了MUC1串聯(lián)重復(fù)序列多肽及其制備工藝以及作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，采用MUC1 20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列，選擇1～10個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的cDNA片段連入pGEX-4T-1載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過(guò)酶切及基因測(cè)序分析插入片段。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)0.3mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)篩選獲得穩(wěn)定的表達(dá)菌株pGEX-MUC1/DH5α。煮沸裂解細(xì)菌，分析MUC1-GST融合蛋白的表達(dá)，鑒定特異的表達(dá)條帶。培養(yǎng)工程菌，超聲破碎后留取上清通過(guò)Glutathione-Sepharose 4B親和層純化人MUC1-GST融合蛋白。再通過(guò)凝血酶裂解獲得純的MUC1多肽，將MUC1多肽做成藥物制劑。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101412749SQ20081005135
公開(kāi)日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月29日
發(fā)明者臺(tái)桂香, 柳忠輝 申請(qǐng)人:臺(tái)桂香