專利名稱：：以少量精細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行有性別選擇的授精的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物后代的性別選擇。特別涉及低劑量人工授精和為繁殖所需性別的動(dòng)物后代而增加產(chǎn)卵的方面。特別是本發(fā)明涉及無(wú)論使用何種分類技術(shù)，用低劑量實(shí)現(xiàn)性別選擇的人工授精、涉及為性別選擇經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)分類精子和低劑量人工授精系統(tǒng)，以及增加排卵結(jié)果的技術(shù)等。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直希望能夠選擇動(dòng)物后代的性別。除了明顯的心理因素，當(dāng)考慮到諸如牛的食用動(dòng)物以及戰(zhàn)利品動(dòng)物，如馬等類似動(dòng)物時(shí)，實(shí)際的哺乳動(dòng)物后代性別選擇具有明顯的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。由于存在這種巨大的需求，為獲得性別選定的后代人們進(jìn)行了各種大量的努力。似乎最可能實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的工作集中在授精前分類和選擇X和Y精子。嘗試分類X和Y精子所面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)是精子的數(shù)量很大。在自然授精中，有些動(dòng)物種類產(chǎn)生數(shù)十億的精子；在人工授精中雖然使用精子較少些，但仍然需很大數(shù)目。例如，人工授精技術(shù)通常使用1千萬(wàn)至5億個(gè)精子(取決于物種)。因此即使在人工授精環(huán)境中也需要極大數(shù)目的精子。已嘗試了許多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)分離攜帶X-和Y-染色體的精子。這些方法包括諸如在美國(guó)專利號(hào)4276139中公開(kāi)的磁性分離技術(shù)，在美國(guó)專利號(hào)5514537中公開(kāi)的柱式(columnar)分離技術(shù)，在美國(guó)專利號(hào)3894529，再審專利號(hào)32350，美國(guó)專利號(hào)4092229，4067965和4155831中討論的重7量分析技術(shù)。在US4083957中公開(kāi)了對(duì)電學(xué)特性進(jìn)行分析的嘗試，在美國(guó)專利號(hào)4225405，4698142和4749458中討論了結(jié)合電學(xué)和重力特性的分析。在美國(guó)專利號(hào)4009260和4339434中顯示了嘗試分析精子活力。諸如在美國(guó)專利號(hào)4511661和4999283(涉及單克隆抗體)和美國(guó)專利號(hào)5021244，53469卯，5439362和5660997(涉及膜蛋白)，和美國(guó)專利號(hào)3687803，4191749，4448767，和4680258(涉及抗體)中顯示的化學(xué)技術(shù)，以及在美國(guó)專利號(hào)4085205中顯示的添加血清成分。盡管似乎提供了具有較高效力的各種技術(shù)，但事實(shí)上目前沒(méi)有一種技術(shù)達(dá)到性別預(yù)選所需的水平。然而，不論最終使用何種分離技術(shù)，自然存在的大量精子的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和分離攜帶X—和Y—染色體的精子的研究使開(kāi)發(fā)以少量精子實(shí)現(xiàn)授精成為可能。目前，用于實(shí)現(xiàn)分離攜帶X—和Y—染色體的精子的定量技術(shù)包括通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)逐個(gè)辨別和分離精子。該技術(shù)隨著技術(shù)進(jìn)步和發(fā)現(xiàn)攜帶X—和Y—染色體的精子對(duì)不同的染色劑吸收顯示出其可能性。這一點(diǎn)以前在美國(guó)專利號(hào)4362246中進(jìn)行了討論且通過(guò)LawrenceJohnson在美國(guó)專利號(hào)4135759中公開(kāi)的技術(shù)進(jìn)行了重要的闡述。Johnson的這種利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)分離攜帶X—和Y—染色體的精子的技術(shù)非常重要和先進(jìn)，因?yàn)樗状问狗蛛x該精細(xì)胞在商業(yè)上成為可能。盡管仍然是實(shí)驗(yàn)性的，但通過(guò)高速流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器，如Cytomation公司生產(chǎn)的MoFk^流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器已顯著增強(qiáng)了這種分離的效果且已在包括美國(guó)專利號(hào)5150313，5602039，5602349和5643796以及國(guó)際PCT專利申請(qǐng)W096/12171的各種其它專利中進(jìn)行了討論。盡管利用Cytomation公司生產(chǎn)的MoFlc^細(xì)胞計(jì)數(shù)器極大地增加了速率，且盡管這種速率增加與常用的高數(shù)量的精細(xì)胞特別相關(guān)，但仍然存在一些問(wèn)題。用MoFl^流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器盡管幾乎可使速率增加10倍，但許多情況下需要越來(lái)越短的分類時(shí)間。首先，已發(fā)現(xiàn)作為實(shí)際問(wèn)題，精子是時(shí)間關(guān)鍵性細(xì)胞。如果它們較長(zhǎng)時(shí)間未用將失去效力。其次，收集、分類和授精的計(jì)時(shí)使速度在商業(yè)上有高度的重要性。因此，精細(xì)胞和該方法對(duì)時(shí)間要求的特性使速度成為實(shí)現(xiàn)高效率和成功率的至關(guān)重要因素。從實(shí)踐上到理論上還存在其它的問(wèn)題。在實(shí)踐方面，需要使用廉價(jià)的可大量使用的物質(zhì)獲得性別分類的精子樣品。在費(fèi)用方面，還需要能以盡可能有效的勞動(dòng)實(shí)現(xiàn)分類(以及收集和授精)。因此，為了該領(lǐng)域成功商業(yè)生產(chǎn)，可能僅提高效率的改迸仍然是有意義的。關(guān)于實(shí)際費(fèi)用，是整個(gè)方法實(shí)踐中最為棘手和敏感的方面。為此，需要簡(jiǎn)化過(guò)程使其程序盡可能粗略，以便操作錯(cuò)誤或技巧的影響不大。結(jié)合這些情況更加需要用較小量的精子進(jìn)行授精。除了該方法的精密性外，已知精子本身是極其脆弱的細(xì)胞。盡管初看起來(lái)認(rèn)為容易理解，但事實(shí)上該細(xì)胞的敏感性還沒(méi)有被充分認(rèn)識(shí)。一般在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)迸行中，大多數(shù)分類的細(xì)胞或顆粒通常呈球形而且能經(jīng)受各種物理方法處理。但精細(xì)胞卻不是這樣。事實(shí)上，正如本發(fā)明所公開(kāi)的，采用通常的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)的方法對(duì)于在某些應(yīng)用中進(jìn)行精細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)分類是不可行的。細(xì)胞的稀釋、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀需要逐個(gè)分離和鑒別細(xì)胞以及典型的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)在本身施加于被分類的細(xì)胞或其它物質(zhì)的壓力均可改變其敏感性。這也說(shuō)明精細(xì)胞的特性，因?yàn)榭雌饋?lái)即使精細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器并被分類時(shí)沒(méi)有肉眼可辨別的副作用，但事實(shí)上這些細(xì)胞本身已經(jīng)接受了壓力，使它們?cè)谑诰^(guò)程中沒(méi)有達(dá)到最佳狀況。因此，這些因素的相互作用對(duì)于精細(xì)胞分類并最終用于人工授精產(chǎn)生了一些特有的問(wèn)題。盡管Johnson的專利和有關(guān)技術(shù)取得了巨大的進(jìn)展，但仍然存在另一問(wèn)題，即用性別選擇的精子實(shí)現(xiàn)低劑量授精非常困難，無(wú)論使用何種分離技術(shù)。盡管有人曾經(jīng)進(jìn)行過(guò)低劑量授精，但似乎更多的是在理論上或?qū)嶒?yàn)室中而不是用于實(shí)踐中或商業(yè)應(yīng)用中。據(jù)此，不僅需要實(shí)現(xiàn)低劑量授精，同時(shí)要達(dá)到與目前不選擇性別的，高劑量人工授精同樣的受孕成功率。因此，本發(fā)明人在性別選擇和低劑量人工授精兩方面所取得的進(jìn)展首次使商業(yè)應(yīng)用成為可能。同樣，盡管Johnson的專利和有關(guān)技術(shù)取得了巨大的進(jìn)展，但仍然面臨另一問(wèn)題，即高成功率的人工授精受眾多因素相互影響，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)特性。因此，建議的解決辦法在某種程度上可能涉及結(jié)合一些因素，9在非常精確的統(tǒng)計(jì)學(xué)研究中顯示出某因素單獨(dú)存在或者與其它因素結(jié)合是必須的。這一決定進(jìn)一步結(jié)合如下事實(shí)，即，該結(jié)果本身可隨物種而改變且由于在起初不可能有足夠多的數(shù)據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)取樣的事實(shí)而難以確定。由于這些原因，本發(fā)明還涉及結(jié)合多種因素，這些單獨(dú)或結(jié)合的因素對(duì)特定的應(yīng)用提供了合適的解決方法。因此認(rèn)為本說(shuō)明書(shū)是非常廣義的，可實(shí)現(xiàn)所公開(kāi)的技術(shù)的各種組合和滲透。可能存在與其它因素的未知協(xié)同效應(yīng)。這些因素可包括在分類中，或者存在于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)，或在收集步驟及授精步驟中所涉及。目前，研究主要在牛類中進(jìn)行，然而，并不認(rèn)為這些技術(shù)將局限于這類物種，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)只與精細(xì)胞相關(guān)。除了精細(xì)胞外，該技術(shù)可應(yīng)用于其它敏感細(xì)胞的分類或在細(xì)胞進(jìn)行分類時(shí)使流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)造成的壓力的影響減到最小。令人感興趣的是，當(dāng)本發(fā)明采用的方法使分類的影響或?qū)?xì)胞的壓力最小化時(shí)，其他人實(shí)際上通過(guò)增加壓力和對(duì)速度的需要及其它這種操作似乎采用的步驟偏離了這一方向。實(shí)質(zhì)上，低劑量授精和高速處理的方式可能以單獨(dú)或者互相聯(lián)系的方式造成互相限制的問(wèn)題。因此，盡管對(duì)高速度、低劑量選擇性別的授精早有需要，而且認(rèn)為技術(shù)不令人滿意，且盡管實(shí)現(xiàn)的技術(shù)和環(huán)境早己可獲得，但在本發(fā)明前這些技術(shù)的一些進(jìn)展或者其組合被本領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的忽略了。也許在某種程度上他們沒(méi)有意識(shí)到這個(gè)問(wèn)題涉及到多因素相互作用以及本領(lǐng)域涉及的細(xì)胞類型(精細(xì)胞或者也許是物種特異性精細(xì)胞)特有的必要性。有趣的是，正如本文中列舉以前的工作所顯示的，盡管進(jìn)行了大量嘗試，但顯然其它人不理解這個(gè)領(lǐng)域固有的問(wèn)題，如低劑量、選擇性別的授精等。也許他們假定，由于自然交配也許涉及幾十億精子，因此用少4個(gè)數(shù)量級(jí)的數(shù)目可能對(duì)于實(shí)現(xiàn)人工授精產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的限制。因此，在某種程度上偏離本發(fā)明技術(shù)方向的實(shí)際做法可能并不奇怪。由于本發(fā)明的結(jié)果表明選擇性別、低劑量的人工授精的成功率與不選擇性別的，高劑量的人工授精相當(dāng)，因此，也許該結(jié)果在一定程度上會(huì)被認(rèn)為是意想不到的。更令人驚奇的是，本發(fā)明的技術(shù)和進(jìn)展事實(shí)上均達(dá)到了所示的重大結(jié)果。盡管每個(gè)技術(shù)單獨(dú)看來(lái)不值得注意，但事實(shí)上，這些細(xì)微的改進(jìn)導(dǎo)致在最終結(jié)果中產(chǎn)生了有意義的進(jìn)展，無(wú)論是單獨(dú)的改進(jìn)還是與其它微小的改進(jìn)相結(jié)合。因此，本發(fā)明前的技術(shù)，對(duì)實(shí)現(xiàn)低劑量、選擇性別的人工授精的成功率不可能達(dá)到在商業(yè)應(yīng)用時(shí)所必需的操作或簡(jiǎn)化程序的水平。然而，除了實(shí)現(xiàn)在商業(yè)水平上的低劑量、選擇性別的人工授精外，本發(fā)明還公開(kāi)了這樣的技術(shù)，該技術(shù)允許實(shí)現(xiàn)改進(jìn)效果且因此有利于所需最終結(jié)果，即，在商業(yè)基礎(chǔ)上的低劑量、選擇性別的人工授精。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明要求在商業(yè)水平上實(shí)現(xiàn)低劑量授精和預(yù)定哺乳動(dòng)物性別的結(jié)果。本發(fā)明還提供了改進(jìn)的外鞘液和收集系統(tǒng)，用于通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分離技術(shù)分類精細(xì)胞以確定其性別。在這種分離技術(shù)中，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的典型外鞘溶液被分類時(shí)對(duì)精細(xì)胞的壓力最小化的液體取代。而且，改進(jìn)了收集系統(tǒng)使精細(xì)胞受到的物理和化學(xué)壓力最小。本發(fā)明提供了多種技術(shù)和物質(zhì)，但正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解的，可根據(jù)物種，分離技術(shù)，目的和在具體處理應(yīng)用中涉及的其它參數(shù)可使用各種組合和變換方式，使技術(shù)達(dá)到最優(yōu)化。本發(fā)明的目的僅僅是實(shí)現(xiàn)用低劑量進(jìn)行選擇性別的授精，并在現(xiàn)實(shí)的商業(yè)環(huán)境下進(jìn)行。還有一個(gè)目的是實(shí)現(xiàn)更好地分類諸如精細(xì)胞等物質(zhì)。一個(gè)相關(guān)的目的是使分類功能本身對(duì)細(xì)胞或其它可能被分類的敏感性物質(zhì)的影響減到最小。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分類技術(shù)，一個(gè)特別的目的是減小外鞘液對(duì)細(xì)胞的影響并有效提供使細(xì)胞耐受各種壓力的外鞘液。一個(gè)類似的目的是提供特別適用于一般精細(xì)胞的物質(zhì)和技術(shù)，并適用于牛精細(xì)胞及馬精細(xì)胞，還適用于將精細(xì)胞分離成攜帶X—或Y—染色體的成分。相似的一個(gè)目的是將收集期(分類后)對(duì)細(xì)胞的影響，特別是對(duì)已進(jìn)行性別分類的精細(xì)胞受到的理化影響減至最小。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是獲得盡可能未受影響的分類結(jié)果。本發(fā)明的另一目的是實(shí)現(xiàn)低劑量的，分類的授精，其水平和成功率與典型的不選擇性別的高劑量的人工授精相當(dāng)。圍繞這一目的，一個(gè)目ii標(biāo)是提供一個(gè)用于人工授精的總體系統(tǒng)，它能以商業(yè)上實(shí)際的方式達(dá)到該目的。因此，最小化對(duì)精細(xì)胞的壓力或潛在損傷的前期目標(biāo)是重要的。以既提供高速度，又具有低分類壓力的方式進(jìn)行分類也是一個(gè)重要的目標(biāo)，特別適用于以低劑量的精細(xì)胞分類。提供對(duì)精子繁殖力無(wú)負(fù)面影響且適用于人工授精的外鞘液和其它液體，也是一個(gè)重要的目標(biāo)。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)的其它部分和權(quán)利要求書(shū)公開(kāi)了本發(fā)明進(jìn)一步的目的。圖1是用于本發(fā)明的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分離技術(shù)的分類器系統(tǒng)。圖2是典型的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器自由降落區(qū)的液流細(xì)胞圖。圖3是粗略顯示本發(fā)明結(jié)果差別的示意圖。圖4是在收集區(qū)域收集的已被分類的細(xì)胞流。具體實(shí)施例方式可見(jiàn)，本發(fā)明的基本概念可以結(jié)合并以各種方式體現(xiàn)。本發(fā)明僅僅涉及商業(yè)上實(shí)用的低劑量、選擇性別的授精及其結(jié)果。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分離技術(shù)，本發(fā)明還涉及改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器系統(tǒng)以及用于產(chǎn)生性別特異性精子樣品的系統(tǒng)，該樣品可用于人工授精并以這種技術(shù)繁殖動(dòng)物。本發(fā)明包括在商業(yè)條件下也可獲得高成功率的總方法。而且，該技術(shù)是以通用的方式公開(kāi)的，只要理解了其基本原則，可將其用于特定系統(tǒng)。盡管公開(kāi)了裝置的改進(jìn)，但應(yīng)理解這些改進(jìn)不僅完成某些工作，而且裝置可進(jìn)行改變并以多種方式組合。重要的是，本說(shuō)明書(shū)包括上述全部?jī)?nèi)容的各個(gè)方面。如上所述，基本目的是分離攜帶X—染色體的精子與攜帶Y-染色體的精子。這通過(guò)分離兩類精子以便分別進(jìn)行包裝和處理來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前，這種分離優(yōu)選通過(guò)使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)進(jìn)行。一般來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)是一種人們熟知的技術(shù)，其基本概念在Cytomation公司的許多專利，如美國(guó)專利和以前列出的其它文獻(xiàn)中均有公開(kāi)。這里引用各專利和參考12文獻(xiàn)以供參考；因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解其所涉及的基本原理?；旧?，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)包括分類物質(zhì)，例如細(xì)胞，通過(guò)某種細(xì)胞源提供給流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器。圖1是該儀器示意圖。該流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器包括細(xì)胞源(1)，用于產(chǎn)生或提供細(xì)胞或其它類型的物質(zhì)供流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析。細(xì)胞儲(chǔ)存在噴嘴(2)內(nèi)，以便細(xì)胞可被外鞘液(3)包圍。外鞘液(3)通常由某種外鞘液源(4)供應(yīng)，以便細(xì)胞源(1)供應(yīng)細(xì)胞時(shí)，噴嘴(2)同時(shí)供應(yīng)外鞘液(3)。以這種方式很容易理解外鞘液(3)如何形成圍繞細(xì)胞的外鞘液體。由于以一定的壓力給流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器供應(yīng)各種液體，因此它們流出噴嘴(2)并在噴嘴口(5)噴出。經(jīng)過(guò)提供某種類型的振蕩器(6)可在噴嘴(2)內(nèi)形成壓力波且在噴嘴口(5)處將液體傳遞出噴嘴(2)，其中該振蕩器可通過(guò)振動(dòng)控制器(19)極精確地控制。由于振蕩器(6)作用于外鞘液(3)，最終流出噴嘴口(5)的液流(7)均勻地形成液滴(8)。由于細(xì)胞被外鞘液環(huán)繞，液滴(8)可含有分離的單獨(dú)的細(xì)胞或其它物質(zhì)。由于液滴(8)—般含有分離的細(xì)胞，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器根據(jù)是否含有某種細(xì)胞對(duì)液滴進(jìn)行鑒定和分離。這通過(guò)細(xì)胞傳感系統(tǒng)(9)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞傳感系統(tǒng)至少包括某種類型的傳感器(10)，它對(duì)各液滴(8)內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，在LarryJohnson的初期工作，即美國(guó)專利5135759中己進(jìn)行了詳細(xì)的討論。正如Johnson的專利對(duì)精細(xì)胞的描述，細(xì)胞傳感系統(tǒng)(9)根據(jù)一種特定染色劑相對(duì)存在或不存在可產(chǎn)生反應(yīng)。這種染色劑可被某些刺激劑激活，如激光激發(fā)器(11)。盡管各類精細(xì)胞均被該染色劑染色，但X—染色體和Y—染色體的不同長(zhǎng)度使得染色的程度不同。因此，根據(jù)精細(xì)胞的染色程度，通過(guò)它們不同的發(fā)射水平可以區(qū)分?jǐn)y帶X—染色體的精子和攜帶Y—染色體的精子。為了實(shí)現(xiàn)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分離技術(shù)最終分離出合適的細(xì)胞，傳感器(10)接受的信號(hào)提供給某種類型的分類器區(qū)別系統(tǒng)(12)，該系統(tǒng)極迅速地作出判斷并根據(jù)液滴(8)內(nèi)是否存在所需細(xì)胞而對(duì)各液滴(8)有區(qū)別地充電。分類器區(qū)別系統(tǒng)(12)以這種方式作用于靜電偏轉(zhuǎn)板(B)，根據(jù)液滴中是否含有合適的細(xì)胞或其它物質(zhì)來(lái)偏轉(zhuǎn)液滴(8)。結(jié)果，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過(guò)使細(xì)胞落入一個(gè)或多個(gè)收集器(14)中來(lái)分類細(xì)胞。因此，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞或其它物質(zhì)的某種特性，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器可根據(jù)具體特征區(qū)分細(xì)胞且將它們放入合適的收集器(14)中。在目前用于分類精子的系統(tǒng)中，攜帶X—染色體的精子的液滴被充正電且因此偏向一方，攜帶Y—染色體的精子的液滴被充負(fù)電且因此偏向另一邊，廢液流(未分類的細(xì)胞)未充電且因此以不偏轉(zhuǎn)的液流收集進(jìn)吸管等裝置中。參照?qǐng)D2，可更進(jìn)一步了解該方法。如該圖所示，由于有振蕩器(6)(圖2中未顯示)，噴嘴(2)噴出液流(7)形成液滴(8)。由于細(xì)胞源(1)(圖2未顯示)可供應(yīng)根據(jù)Johnson技術(shù)染色的精細(xì)胞(15)，傳感器(10)測(cè)定到不同的經(jīng)激光激發(fā)器(11)產(chǎn)生的光刺激，這樣，當(dāng)液滴(8)從液流(7)中分離時(shí)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器就能控制每個(gè)液滴(8)存在或不存在電荷。根據(jù)其內(nèi)容物分出帶正電，帶負(fù)電和不帶電的液滴(8)。如圖2所示，某些液滴顯示為偏轉(zhuǎn)的液滴(16)。這些偏轉(zhuǎn)的液滴(16)含某種性別的精細(xì)胞(15)。然后將它們儲(chǔ)存在合適的收集器(14)中備用。對(duì)于精細(xì)胞分類應(yīng)用特別重要的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)的一個(gè)方面是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的高速運(yùn)轉(zhuǎn)。Cytomation公司商標(biāo)為MoFk^的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器取得了特別的進(jìn)展。這些流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器顯著增加了分類速度且因此使得流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)在精細(xì)胞分類的商業(yè)應(yīng)用中(以及其它商業(yè)應(yīng)用)成為可能。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器實(shí)現(xiàn)了高速分類，即速度比未用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器時(shí)顯著增高。尤其是，Cytomation公司的MoFl^流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器使用的振蕩器頻率約大于5千赫茲，更具體地說(shuō)可在10—30或甚至在50千赫茲的范圍內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)。因此以極高的頻率形成液滴且被外鞘液包圍的細(xì)胞可非常迅速地從噴嘴(2)噴出。選擇組成流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器系統(tǒng)的每一部件如噴嘴(2)，振蕩器(6)以產(chǎn)生高速細(xì)胞分類器。高速細(xì)胞分類器應(yīng)用于分類精細(xì)胞細(xì)胞時(shí)，可實(shí)現(xiàn)大約每秒500次分類以上的分類速率。事實(shí)上，通過(guò)高速細(xì)胞分類器已實(shí)現(xiàn)了1000至1200次的分類速率。重要的是，應(yīng)理解"高速"是一個(gè)相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，隨著流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用，"高"是可變的或保持不變的。每種定義的一般原則是，當(dāng)對(duì)特定的細(xì)胞，如精細(xì)胞進(jìn)行分類時(shí)，分類是以流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的參數(shù)和物理性質(zhì)對(duì)細(xì)胞本身有意義的速率進(jìn)行的。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分離技術(shù)分類精細(xì)胞時(shí)起作用的高速分類的一個(gè)方面是在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)精細(xì)胞所受到的壓力。例如，當(dāng)高速運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器可以每平方英寸50磅、60磅，甚至更高的壓力運(yùn)轉(zhuǎn)。這樣的壓力認(rèn)為是高的，因?yàn)閷?duì)被分類的細(xì)胞可產(chǎn)生影響。對(duì)于這一方面本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)在于特定細(xì)胞的壓力閾值是決定的因素。而且，隨著獲得進(jìn)一步的知識(shí)，將表明壓力閾值是綜合效應(yīng)的函數(shù)如特定物種或?qū)?xì)胞進(jìn)行的特定的預(yù)處理或后處理。關(guān)鍵是事實(shí)上細(xì)胞所受的壓力改變了其活力和達(dá)到所需結(jié)果的能力。對(duì)于壓力，當(dāng)對(duì)精細(xì)胞施加更高壓力時(shí)，可能導(dǎo)致流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器分類細(xì)胞的效果下降。本發(fā)明使這些壓力降到最小，從而得到了下文中提到的更高的效率和更低的劑量?？紤]到細(xì)胞的壓力方面，本發(fā)明以使壓力最小化的方式進(jìn)行?？稍谡麄€(gè)周期中或在收集、分類甚至給動(dòng)物授精的過(guò)程中的任意時(shí)間點(diǎn)這些壓力可被最小化。重要的是，在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)處理細(xì)胞而產(chǎn)生的壓力對(duì)于這種應(yīng)用似乎是明顯的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特別選擇了外鞘液使其與分類前后的兩種細(xì)胞液體環(huán)境(或之一)的壓力一致。盡管可自然調(diào)節(jié)分類前或者分類后的液體，但在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中調(diào)節(jié)外鞘液(3)，使對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的壓力比以前產(chǎn)生的明顯更小。在一個(gè)方面，本發(fā)明的意義在于它將全部注意力從對(duì)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器操作轉(zhuǎn)移到處理和轉(zhuǎn)移細(xì)胞本身的壓力上。例如，盡管已知使用具有合適pH值或滲透壓的液體，但本發(fā)明認(rèn)識(shí)到可能存在對(duì)細(xì)胞反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的化學(xué)成分。可根據(jù)細(xì)胞或甚至在細(xì)胞處理前自然改變這些反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的化學(xué)成分。重要的是，目前對(duì)于精細(xì)胞，似乎某些代謝的化學(xué)成分，如擰檬酸鹽可防止對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生異常高的壓力。因此，反應(yīng)過(guò)強(qiáng)的化學(xué)成分可定義為在其功能性環(huán)境中和隨后存在的處理技術(shù)中對(duì)細(xì)胞存在特定反應(yīng)的成分。對(duì)于精細(xì)胞，似乎代謝成分，特別是檸檬酸鹽對(duì)牛精細(xì)胞的穩(wěn)定性和HEPES緩沖液對(duì)馬精細(xì)胞的穩(wěn)定性非常重要。因此，本發(fā)明通過(guò)選擇操作類型或者選擇使細(xì)胞經(jīng)歷的變化最小的物質(zhì)，使細(xì)胞的改變最小。15根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案選擇一種物質(zhì)使外鞘液在化學(xué)上協(xié)調(diào)使引起的變化最小。因此，經(jīng)過(guò)選擇合適的外鞘液，不僅流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)的參數(shù)中，而且細(xì)胞參數(shù)的本身均改善了細(xì)胞的變化和分類的總體結(jié)果。圖3中概念性地顯示了這一點(diǎn)。圖3顯示了存在于該方法的各個(gè)時(shí)期的一些化學(xué)因素類型(例如檸檬酸鹽或其它因素)，例如，顯示的四個(gè)時(shí)期代表流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)分離技術(shù)所顯示的下列時(shí)期，但不受其限制I期代表細(xì)胞源(1)內(nèi)存在的細(xì)胞，II期表示在外鞘液環(huán)境中分類時(shí)存在的細(xì)胞，III期表示分類后收集的細(xì)胞，IV表示分類后在儲(chǔ)存培養(yǎng)基中重建的細(xì)胞。現(xiàn)有技術(shù)所表示的這四個(gè)時(shí)期可以經(jīng)歷區(qū)別極大的化學(xué)因素環(huán)境。然而，如圖所示，在本發(fā)明中細(xì)胞經(jīng)歷了極小的變化，最顯著的是沒(méi)有I和II期之間經(jīng)歷的溶液或液滴。這是選擇合適的外鞘液的結(jié)果。因此，由于使用了合適的外鞘液，本發(fā)明的細(xì)胞受到的壓力更低。對(duì)于該現(xiàn)象可能存在的一個(gè)潛在的普遍性是某些化學(xué)成分比其它成分具有更高的敏感性。盡管根據(jù)精子的種類、操作方式，甚至是細(xì)胞的類型這種敏感性可自然變化，但用于所需目的(本文是人工授精)時(shí)細(xì)胞的活力改變極大，這種改變可以是自然的或者由于分類引起或兩者都有，因此，細(xì)胞對(duì)該化學(xué)成分表現(xiàn)出敏感性。通過(guò)選擇某些代謝的化學(xué)成分，最顯著的是檸檬酸鹽或檸檬酸循環(huán)中的化學(xué)物質(zhì)，可出現(xiàn)極大的改進(jìn)。因此，在牛精子應(yīng)用中，選擇并調(diào)配外鞘液(3)使其含有大約2.9%的檸檬酸鈉成分。具體地說(shuō)，2.9%的檸檬酸鈉溶液制備方法如下1、將29.0克檸檬酸鈉二水合物(Na3C6H507'2H20)放入1000ml燒瓶中；a將檸檬酸鈉溶于3/4體積的水中，然后加水至總體積；2、加入去離子水或純凈水至1000ml終體積；3、轉(zhuǎn)移到瓶中并在151bs壓力下高壓滅菌(245°F)至少30分鐘；a在使溶液最少蒸發(fā)的條件下進(jìn)行高壓滅菌(未密閉時(shí))；b注意使水不沸騰掉；4、在室溫下慢慢冷卻；5、在5'C的冷環(huán)境中密封儲(chǔ)存；另外，對(duì)于外鞘溶液，可過(guò)濾檸檬酸鈉溶液。6、采用無(wú)菌技術(shù)用0.22微米濾器過(guò)濾。有趣的是，對(duì)于馬精細(xì)胞，上述溶液不合適。另外，己發(fā)現(xiàn)對(duì)于馬精細(xì)胞，HEPES緩沖培養(yǎng)基，如HEPES牛配子培養(yǎng)基，特別是以前由J丄Pairish為應(yīng)用于牛而制備的HBGM3較合適。該培養(yǎng)基在文章"用肝素保存牛精子"，生殖生物學(xué)38，1171(1988)中進(jìn)行了討論，本文作為參考文獻(xiàn)引用。這不僅是令人驚奇的，因?yàn)樗c用于牛精子的物質(zhì)不是相同的物質(zhì)類型，而且實(shí)際上該緩沖液最初是為應(yīng)用于牛而研制的。因此，用在馬精子中，選擇的外鞘液含有HEPES緩沖液。該溶液在室溫下PH值約7.54(39'C時(shí)pH-7.4)，其成分如下化學(xué)物質(zhì)干重(e/500ml)CaCl20.145KC120.115MgCl26H200,004NaH2P04H20O扁NaCl2.525丙酮酸鈉0.011乳酸(60%)1.84mlHEPES4.765NaHC030.420BSA(V部分)3.0可對(duì)本發(fā)明造成影響的另一方面是所用的細(xì)胞可能具有異常敏感性。一種考慮是，這可能是由于精細(xì)胞是一類不能修復(fù)的細(xì)胞。即，它們沒(méi)有自我修復(fù)能力，因此，處理時(shí)它們可能需要比流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其它處理裝置處理一般細(xì)胞時(shí)更敏感。因此，當(dāng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其它分離裝置建立精細(xì)胞源時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改進(jìn)。精細(xì)胞這類細(xì)胞特有的另一潛在的相關(guān)方面是其DNA不能修復(fù)、不能復(fù)制且不能轉(zhuǎn)錄。上述每一種因素都可能起作用或單獨(dú)或同時(shí)造成影響。因此，本發(fā)明的技術(shù)可應(yīng)用于所有配子細(xì)胞或甚至是病毒及類似的不能修復(fù)、不能翻譯、不能轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器處理重要方面是分類后應(yīng)采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)和物理方法處理細(xì)胞。如圖4所示，液滴(8)內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)入收集器(14)時(shí)，重要的是收集器的容器大小要適當(dāng)，以避免細(xì)胞和容器本身之間的影響。盡管已知將起始收集器液體(17)放入容器的底部，收集細(xì)胞時(shí)就不會(huì)沖撞容器的底部，但也可使用簡(jiǎn)單地加寬容器的方法起到這種作用，因?yàn)檫@樣可以改變液流出現(xiàn)及細(xì)胞沖擊容器時(shí)不可避免出現(xiàn)的飛濺。這樣就起到了緩沖的作用，可以恰當(dāng)?shù)靥幚砑?xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞對(duì)機(jī)械沖擊十分脆弱，即它們受沖擊易破裂或損傷。因此，當(dāng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器細(xì)胞源分離出細(xì)胞時(shí)，若被分類的細(xì)胞物事性質(zhì)脆弱，重要的是提供某種緩沖因素，如加寬的收集管，其開(kāi)口(18)寬敞以避免容器壁與細(xì)胞接觸。這樣，收集管的管壁不會(huì)靠的太近，被分類的細(xì)胞與管壁之間就不會(huì)存在任何明顯接觸。所以，除了要有收集器液體(17)夕卜，還可以用粗的收集管。也許僅僅提供寬開(kāi)口的容器用作收集器的部件就已足夠。用于高速分類精細(xì)胞時(shí)，已發(fā)現(xiàn)開(kāi)口內(nèi)徑至少15毫米的容器是足夠的。特別是在該應(yīng)用中使用14mlFakon收集管時(shí)，發(fā)現(xiàn)該收集器(14)對(duì)細(xì)胞具有最小的物理?yè)p傷。應(yīng)注意即使是14mlFakon收集管可能也不是最佳的。具體地說(shuō)，據(jù)認(rèn)為設(shè)計(jì)適合液流幾何形狀的收集容器(即"液流適配容器")可能是最佳的。這種液流適配容器可具有任一或全部下列特征相對(duì)較寬的噴嘴口，橢圓性的噴嘴口，高與寬的比率比現(xiàn)有技術(shù)的更小，成一定角度或與液流方向協(xié)調(diào)，例如側(cè)壁與下落的液流平行等。還需要提供一種支架部件，如可動(dòng)部件或類似于滾珠軸承的工具等，可以使收集管變化方向適于收集所需的下落的液流。另外，這類容器，例如，其中的收集管(以"Falcon-型"收集管為例)不僅要求有一定寬度，而且對(duì)制成收集管的材料也有要求(如用不粘附細(xì)胞的聚苯乙烯)等。(已知14mlFalcon收集管用該材料)。因此，該容器和其收集液對(duì)減小細(xì)胞的物理?yè)p傷也起到了緩沖作用，其大小也有利于收集足夠的精子而無(wú)明顯的稀釋效應(yīng)。收集液(17)的另一作用是減小對(duì)細(xì)胞的化學(xué)壓力。由于分類前和18分類后給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)是重要的，因此可選擇同等營(yíng)養(yǎng)水平的收集液使分類前和分類后的營(yíng)養(yǎng)平衡。對(duì)于牛精子，使用含2%卵黃的卵黃檸檬酸鹽作為營(yíng)養(yǎng)成分，已發(fā)現(xiàn)使用6%的卵黃檸檬酸(即在檸檬酸鹽溶液中有6%的卵黃含量)效果很好。這是因?yàn)榧?xì)胞分類前后體積不同。收集器液體(17)開(kāi)始(分類前)體積約為2ml。細(xì)胞分類后可增加大約2倍的體積(最終是起始體積的3倍)，溶液中卵黃檸檬酸鹽極少(由于阻塞流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器的其它原因)。因此，卵黃檸檬酸鹽含量水平的最終結(jié)果相當(dāng)于起始結(jié)果，即按體積在檸檬酸鹽溶液中有2%的卵黃含量。因此選擇收集液(17)的最佳營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)與起始的營(yíng)養(yǎng)成分或其它液體環(huán)境平衡。這種方式使細(xì)胞分類的時(shí)間最短，液體成分改變最小。自然，這種液體環(huán)境可在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)提供或在分類前提供給細(xì)胞，重要的是使細(xì)胞在其生命周期中任意時(shí)間所受的壓力都最小。而且，由于可改變化學(xué)物質(zhì)的起始含量(例如，可增大或減小檸檬酸鹽中的卵黃含量百分?jǐn)?shù))，同樣也可改變起始收集液環(huán)境或體積使最終結(jié)果相同。因此，在開(kāi)始分類前，收集器液體為含6%的卵黃的檸檬酸鹽溶液，分類后，含有性別特異性精子的收集器液體是含2%卵黃的檸檬酸鹽溶液，與起始營(yíng)養(yǎng)成分含量相當(dāng)。應(yīng)注意由于其它原因后來(lái)的使用中可將這些精細(xì)胞在有20%卵黃含量的檸檬酸鹽溶液中處理，但這些改變并不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生壓力，因?yàn)樗鼈儍H僅是總體授精過(guò)程的一個(gè)已知部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解可自然改變?cè)摵浚?0%的卵黃檸檬酸鹽緩沖液的組成如下；I最終組成-80%檸檬酸鈉溶液(72mM)20%(體積/體積)卵黃II制備1升溶液-A檸檬酸鈉溶液1將29.0克檸檬酸鈉二水合物(Na3C6H507'2H20)放入1000ml燒瓶中。2加入去離子水或純凈水至1000ml終體積。3轉(zhuǎn)移到瓶中并在151bs壓力下高壓滅菌(245°F)至少30分鐘19a在使溶液最小蒸發(fā)的條件下(覆蓋不嚴(yán)時(shí))進(jìn)行高壓滅菌；b注意使水不沸騰掉。4在室溫下慢慢冷卻。5在5'C的冷環(huán)境中密封儲(chǔ)存。B雞蛋的準(zhǔn)備1采購(gòu)新鮮雞蛋。2洗去雞蛋的臟物(不用過(guò)多去污劑)并漂洗。3將雞蛋浸入70%乙醇中2—5分鐘。4取出雞蛋晾干(或擦干)，置于干凈的毛巾上。C制備擴(kuò)充液l使用無(wú)菌，干凈的玻璃制品。2A—組分(無(wú)甘油組分)a將800ml2.9%檸檬酸鈉溶液放入1000ml量筒中。b擴(kuò)充液無(wú)甘油組分(A—組分)的抗生素含量為i泰樂(lè)菌素-100iig/mlii慶大霉素二500iag/mliii林可霉素一奇霉素-300/600ixg/mlc加入200mlD部分新制備的卵黃i徹底混合d這樣提供了以2.9%檸檬酸鈉，20%卵黃和抗生素為基礎(chǔ)的A一組分?jǐn)U充液，(已知抗生素濃度對(duì)牛精子無(wú)毒性)。e擴(kuò)充液可在5'C儲(chǔ)存過(guò)夜。f第二天傾析上清液(800ml以上)。g第二天用前加溫到37'C。D向緩沖溶液中加入卵黃，可使用下列程序。l洗滌雞蛋并使其干燥(見(jiàn)上面B)。2打開(kāi)雞蛋并用卵黃分離器分離卵黃和蛋清?；蛘?，可在兩個(gè)打開(kāi)的半殼中來(lái)回傾倒卵黃。不要使卵黃周圍的膜破裂。3將卵黃放在15cm的無(wú)菌濾紙上。4將濾紙片放到含有緩沖液的量筒上并擠壓卵黃(使膜破裂)使卵黃過(guò)濾進(jìn)量筒中。一般一個(gè)雞蛋可獲得大約12—15ml卵黃?？稍诒景l(fā)明的各種因素中互相影響的另一方面是使用低劑量的精子進(jìn)行人工授精等。在RupertP.Amman和GeorgeE.Seidel,Jr.,Colorado聯(lián)合大學(xué)出版社(1982)的"哺乳動(dòng)物精子分類的前景"中可發(fā)現(xiàn)關(guān)于選擇性別的人工授精的其它背景。正如所述，自然授精涉及的精子數(shù)為幾十億。目前典型的人工授精，牛用幾百萬(wàn)的精子進(jìn)行，馬用幾億精子進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"低劑量"指進(jìn)行授精比典型的人工授精所用的精子劑量不足其一半，甚至不足其10%的數(shù)目。因此，"低劑量"是根據(jù)典型的人工授精劑量對(duì)比，或者也可以看作是絕對(duì)數(shù)目小。目前牛的劑量是1百萬(wàn)到1千萬(wàn)精子，低劑量可認(rèn)為是絕對(duì)數(shù)目大約500,000精子或者低至300,000精子甚至更低。事實(shí)上，通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)，以IOO，OOO和250,000個(gè)精子進(jìn)行的人工授精己顯示出成功率較高(懷孕率分別為41%和50%)，正如48Theriogenology1255(1997)文章"用極低數(shù)目的非冷凍的及選擇性別的精子對(duì)小母牛進(jìn)行子宮角授精"所示。由于精細(xì)胞似乎顯示出對(duì)稀釋有敏感性，這些結(jié)果特別顯示了本發(fā)明的各種技術(shù)互相依賴于使用低劑量的精子樣品。絕對(duì)數(shù)目根據(jù)不同物種，對(duì)于馬，只需約不足二千五百萬(wàn)、或一千萬(wàn)、或五百萬(wàn)，甚至一百萬(wàn)個(gè)精子，這被認(rèn)為是低劑量方法。另外一個(gè)重要方面是用本發(fā)明的技術(shù)選擇性別的精子被用于人工授精系統(tǒng)。因此對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，當(dāng)收集器(14)用于提供人工授精的精子時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)特別適用。而且可將人工授精用途與在低劑量環(huán)境中的用途結(jié)合起來(lái)產(chǎn)生使本發(fā)明的各種技術(shù)非常協(xié)調(diào)的協(xié)同效應(yīng)。自然，選擇性別的精子不僅在人工授精方式中應(yīng)用而且在其它技術(shù)，例如體外授精等中應(yīng)用。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)或其它分離技術(shù)收集、分類和最終給動(dòng)物授精的方法包括各種步驟。給牛授精時(shí)，首先用人工陰道收集牛的精液，每毫升大約15億個(gè)精子。用分光光度計(jì)檢查干凈的精液以測(cè)定濃度并通過(guò)顯微鏡檢評(píng)估以保證滿足合適的游動(dòng)性和活力標(biāo)準(zhǔn)。然后加入抗生素。每次射精產(chǎn)生大約60-70%活躍精子,的起始樣品。用某種類型的TALP21(tyrode白蛋白乳酸丙酮酸)稀釋可得到約1億/ml操作濃度的精子數(shù)(用于流式分析)。TALP不僅給精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，而且可使它們?cè)谌旧襟E中高度活化。在某些物種，如馬精液中，染色前可進(jìn)行離心。根據(jù)復(fù)染或單染方法進(jìn)行染色，后者是Johnson的專利和有關(guān)技術(shù)的主題。也可調(diào)配擴(kuò)充液以形成合適的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境同時(shí)進(jìn)行染色。在牛應(yīng)用中，可在染色后立即在檸檬酸鹽溶液中加入大約20%的卵黃成分。而且，在精細(xì)胞染色中，已發(fā)現(xiàn)使用較高的染色量可達(dá)到比預(yù)期更好的結(jié)果。高濃度染色包括使用數(shù)十微摩爾濃度的染色劑，如在下面實(shí)施例中所討論的，使用了濃度為38微摩爾的Hoechst33342染色劑。加入染色劑后，培養(yǎng)一段時(shí)間，如在34"C下培養(yǎng)1小時(shí)以加速染色劑吸收，濃度為每毫升大約1億個(gè)精細(xì)胞。然后進(jìn)行過(guò)濾以去掉精細(xì)胞團(tuán)塊，隨后進(jìn)行稀釋或擴(kuò)充到每毫升大約1億個(gè)精細(xì)胞的所需分類濃度。然后用上述各種技術(shù)進(jìn)行分類，在收集期回收精細(xì)胞。如上所述，收集可產(chǎn)生大約含2%卵黃檸檬酸鹽的樣品(對(duì)于牛物種)。離心將樣品濃縮到每毫升大約3-5百萬(wàn)個(gè)精細(xì)胞，之后去掉外鞘液和保護(hù)液。然后用20%卵黃檸檬酸鹽或康奈爾通用擴(kuò)充液(CornellUniversalExtender，縮寫(xiě)為CUE)等進(jìn)行最終擴(kuò)充?？的螤柾ㄓ脭U(kuò)充液每1000ml具有如下組成14.5g二水檸檬酸鈉2.1gNaHC030.4gKCl3.0g葡萄糖9.37g甘氨酸0.87g檸檬酸對(duì)于20%的卵黃組合物，可使用800mlCUE和大約200ml卵黃。最后這次擴(kuò)充后，得到每毫升3—5百萬(wàn)個(gè)精子(牛)。然后冷卻該樣品以減緩精子的代謝，使其可較長(zhǎng)期限內(nèi)使用。在馬物種中，可在輸卵管中或按本領(lǐng)域的技術(shù)人員均理解的其它授精方法使用該樣品。在牛精子中，該樣品可被再稀釋一次至所需劑量濃度。已發(fā)現(xiàn)，稀釋可對(duì)精細(xì)胞活力造成影響，因此可用較少量樣品授精，以避免過(guò)分稀釋。目前22文章"前列腺素F2oc—一種奶牛的生殖藥物？"Theriogenology,18，245(1982)在此所為參考。盡管最近的研究結(jié)果未強(qiáng)調(diào)這一理論，但本發(fā)明證實(shí)在選擇性別的低劑量授精情況下特別有價(jià)值。對(duì)于牛，通過(guò)使用胚胎移植裝置將精細(xì)胞深深地植入子宮角內(nèi)可實(shí)現(xiàn)人工授精。授精時(shí)間可不在典型用于人工授精的峰值時(shí)間進(jìn)行，而晚一些進(jìn)行，如晚12小時(shí)后進(jìn)行，因?yàn)檫x擇性別的人工授精可能在稍晚發(fā)生。也可使用胚胎移植裝置，因?yàn)樽訉m壁對(duì)這種低劑量、選擇性別的授精具有較高的敏感性。還可以結(jié)合該技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效繁殖。特別是，現(xiàn)在發(fā)明的允許高速分類和選擇性別的胚胎低劑量授精的方法也可用于超排卵的動(dòng)物。使用超排卵藥物或任何其它技術(shù)可實(shí)現(xiàn)超排卵。超排卵藥物可直接或間接作用，例如，通過(guò)反應(yīng)鏈實(shí)現(xiàn)高于正常產(chǎn)卵。精子與超排卵結(jié)合是令人驚奇的，因?yàn)橐郧罢J(rèn)為超排卵阻礙了該結(jié)合。在超排卵牛中精子傳輸受到影響，因此，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行人工授精往往需要進(jìn)行多次和/或用成倍的劑量。另外，以前確定精子性別的過(guò)程相對(duì)較慢；因此，測(cè)定用超排卵藥物(如FSH即卵泡剌激素)處理的母牛一次人工受精后的受精率是有意義的，所用的精子是上述新技術(shù)的組合而得到的性別選擇的未冷凍的精子，總數(shù)僅600，000個(gè)。例如，用如下標(biāo)準(zhǔn)方法使12個(gè)Angus雜種小母牛超排卵:在發(fā)情期第9天和第12天之間以半天的間隔肌肉內(nèi)注射6，6，4，4，2，2，2和2mgFSH;第6和第7次FSH注射時(shí)同時(shí)肌肉內(nèi)注射25和12.5mg前列腺素F—2ct。繁殖力未知的公牛精子用Hoechst33342染色然后用MoFlo流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器/分類器分類每秒產(chǎn)生每種性別700—800活精子。平均分類純度為所需性別的89%。經(jīng)過(guò)650g離心10分鐘將分類的精子濃縮到233.36xl(^個(gè)精子/m1,冷卻到5°C，并儲(chǔ)存4小時(shí)。然后將184ul裝入0.25ml塑料細(xì)管中；使用自動(dòng)側(cè)向開(kāi)口的胚胎移植鞘在發(fā)情后20—24小時(shí)將一半的劑量注入各子宮角中。發(fā)情期后7或16天以標(biāo)準(zhǔn)的非外科手術(shù)方法收集胚胎。在第7天和第16天之間收集的結(jié)果相似，分類的X—及Y—精子數(shù)量也相似。從9只小母?；厥张咛ァＳ?2個(gè)正常發(fā)育的胚胎(平均，4.3±5.3個(gè)/供體)，13個(gè)發(fā)育延緩的胚胎和31個(gè)未受精的卵。使用Y一染色體特異性的DNA序列的引物經(jīng)PCR測(cè)定46個(gè)胚胎的性別；43個(gè)(93%)為所需性別。盡管該研究只用了少量動(dòng)物，令人驚奇的是，對(duì)排卵過(guò)多的小母牛僅用總數(shù)為600，000個(gè)(活的)選擇性別的未冷凍精子授精，得到與常規(guī)方法相似的結(jié)果。也可對(duì)上述方法進(jìn)行改變，包括通過(guò)非流式細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)方法分類精子，以其它方式實(shí)現(xiàn)超排卵，以其它方式增加受精等，但不限于這些方法。而且，根據(jù)DNA成分確定精子性別的準(zhǔn)確性，高速流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器/細(xì)胞分類器，以及以低于500,000個(gè)的總精子數(shù)授精母牛而不影響其繁殖力的方法使得幾年內(nèi)確定牲畜性別的活精液在產(chǎn)業(yè)上成為可能。以>85%的精確率選擇性別的精子將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。也許最明顯的是為得到雌性后代，給一種牛(既產(chǎn)奶又產(chǎn)肉型)授精，為得到肉用雄性牛，使另一種牛(既產(chǎn)奶又產(chǎn)肉型)繁殖出完全不同的公牛類型。上述的一種極重要的牛是用攜帶X—染色體的精子授精母牛產(chǎn)生雌性牛犢，其難產(chǎn)發(fā)生率比雄性牛犢低，主要因?yàn)槠潴w積較小。而且，母牛犢出生率的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)證明了雄性年輕種奶牛的效率更高。具有85%以上的母奶牛也使經(jīng)營(yíng)奶牛成為可能。因?yàn)槟膛Ｔ谄鋲勖衅骄敝巢怀^(guò)兩只存活牛犢，這是具有吸引力的，因?yàn)闇p少了與妊娠和分娩有關(guān)的問(wèn)題。經(jīng)營(yíng)單一性別的肉牛繁殖系統(tǒng)也將成為可能，每只雌性牛用于繁殖并在2至3歲間屠宰，因此，在該系統(tǒng)中大量的營(yíng)養(yǎng)用于肉牛生長(zhǎng)，較少量用于維持種群。性別選擇的精液可用于體外授精和對(duì)超排卵的奶牛用于胚胎移植。常常是某一種性別的牛犢比另一種性別的更有價(jià)值，盡管已有準(zhǔn)確定胚胎性別的方法，但既費(fèi)時(shí)，且產(chǎn)生了半數(shù)是性別價(jià)值不高的胚胎。據(jù)推測(cè)如果選擇性別附加的費(fèi)用較低且生育力受到的影響很小，精確選擇性別的精液將廣泛用于牛的人工授精。隨著性別選擇的精液的出現(xiàn)，人工授精的肉牛會(huì)大量增加。令人感興趣的是，不在通常植入子宮體內(nèi)進(jìn)行授精，而是在子宮角內(nèi)深處授精可獲得更好的結(jié)果。還有，由此進(jìn)一步研究的樣品顯示在子宮角內(nèi)深處同側(cè)和對(duì)側(cè)授精沒(méi)有區(qū)別。用胚胎移植設(shè)備可很好地放入子宮角。由于在同側(cè)和對(duì)側(cè)授精的結(jié)果沒(méi)有明顯差異，因此本發(fā)明人提出在雙側(cè)都可進(jìn)行人工授精，不必去鑒別合適的子宮角。進(jìn)行人工授精當(dāng)然希望繁殖出所需性別的動(dòng)物。根據(jù)上述方法通過(guò)使用選擇性別的精液就可以達(dá)到此目的。還應(yīng)理解本發(fā)明的技術(shù)還可應(yīng)用于其它技術(shù)，例如，腹腔鏡授精，輸卵管授精等。下面的實(shí)驗(yàn)作為實(shí)施例。盡管此處未全部描述本發(fā)明的每個(gè)方面，但通過(guò)介紹本發(fā)明不同方面的內(nèi)容，確實(shí)顯示出效果改進(jìn)，而且，一些實(shí)驗(yàn)小結(jié)已寫(xiě)入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)"用極少量的未冷凍且選擇性別的精細(xì)胞對(duì)小母牛進(jìn)行子宮角授精"中。該文章歸納的一些數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明的效果。關(guān)于實(shí)驗(yàn)，如下所述，用選擇性別的、未冷凍的精細(xì)胞進(jìn)行的人工授精具有較高的成功率實(shí)施例1用25毫克前列腺素F—2ot以12天的間隔給月齡13—14，中等大小的Angus母牛用藥，使其同步發(fā)情，并且在觀察到出現(xiàn)發(fā)情期后6—26小時(shí)授精。將從3個(gè)14一26個(gè)月齡的公牛新收集的精液加入到38微摩爾/升的Hoechst33342中，在TALP培養(yǎng)基中以75xl(^個(gè)精子/毫升在34°C溫育1小時(shí)。使用在50psi下操作的MoFlo⑧流動(dòng)細(xì)胞計(jì)湖胞分類儀，并且用2.9%檸檬酸鈉作為外鞘液，在來(lái)自150mW下以351和364納米的激光激發(fā)的落射熒光的基礎(chǔ)上分類性染色體而分類精子。以約500個(gè)活精子/秒的速度收集帶X染色體的精子(經(jīng)再分類超聲波處理的精子等分試樣證實(shí)，純度約90%)至2毫升含100微升CornellUniversalExtender(CUE)和20%卵黃的Eppendorf管。將收集的精子以600xg離心10分鐘，并且在CUE中再懸浮到1.63><106活精子/毫升。對(duì)于液體精液性別未分類的對(duì)照，將Hoechst33342染色的精子用外鞘液稀釋到9xl()S精子廣升和離心并且在CUE中再懸浮到1.63xl(^個(gè)游動(dòng)的精子廣升。將性別選擇的精液和液體對(duì)照精液在75分鐘之內(nèi)冷卻到5°C，加載到0.25毫升的細(xì)管中(184微升/細(xì)管)。將細(xì)管置于35T:控制溫度的液體冷卻器中運(yùn)送到240km之外，用于在分類后5到9小時(shí)授精。用側(cè)幵口的藍(lán)鞘(IMV)進(jìn)行性別選擇的精液和液體對(duì)照精液授精，每個(gè)細(xì)管的一半進(jìn)入子宮角(3><105活精子/母牛)。作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，將來(lái)自同樣的公牛的精液在0.5厘米的細(xì)管中用標(biāo)準(zhǔn)方法冷凍(解凍后平均15.6xl()S個(gè)能動(dòng)精子/劑量)，在35。C解凍30秒，并且授精到子宮體中。2個(gè)授精者輪流用3只公牛精液進(jìn)行操作，對(duì)于性別選擇的精液和兩種對(duì)照精液以3:2:2母牛數(shù)的比例授精。在授精后31—34天用超聲波確定受孕，在64—67天可分辯出胎牛性別時(shí)進(jìn)一步證實(shí)。數(shù)據(jù)表示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>a、b間具有顯著性差異(P<0.02)。雖然性別選擇的精液的懷孕比例只是對(duì)照組的80%，這一差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.1)。性別選擇和冷凍對(duì)照組中的受孕數(shù)在64—67天時(shí)各減少了一個(gè)；在性別選擇組中19個(gè)胎牛中有18個(gè)是雌性(95%)，而對(duì)照組中30個(gè)胎牛中僅有20個(gè)是雌性(67%)。液體精液對(duì)照組懷孕率與含有高50多倍能動(dòng)精子(總精子超過(guò)120倍)的冷凍精液對(duì)照組有實(shí)質(zhì)上相同的懷孕率，證明了在子宮角中低劑量授精的效率。利用流式細(xì)胞計(jì)技術(shù)和人工授精，我們已經(jīng)明顯改變了牛的性別比例。同樣，用來(lái)進(jìn)行性別選擇的非冷凍精細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，報(bào)道如下實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃诶硐氲膶?shí)地條件下，確定用極低數(shù)目的冷凍精子對(duì)母牛授精時(shí)的受孕率。將生殖力高于平均數(shù)的三只Holstein公牛的精液加入勻漿的牛奶、7X的甘油(CSS)擴(kuò)充液中，再加5%的同源精液漿液中擴(kuò)充，制成每0.25毫升French細(xì)管中含2xl05、5xl05、或1(^106(對(duì)照)總精子的三種授精樣品，然后在流動(dòng)的液氮蒸發(fā)器中冷凍。在37'C水中解凍精液20秒。利用25毫克前列腺素F—2—a(Lutalyse⑧)在12天的間隔注射月齡13—15，體重350—450公斤的Holstein母牛兩次，在檢測(cè)到發(fā)情后12或24小時(shí)，利用胚移植細(xì)管槍和側(cè)開(kāi)口的鞘授精，將一半精液深入到每個(gè)子宮角中。在5個(gè)月中重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，在兩個(gè)授精技術(shù)人員交替進(jìn)行。孕育的環(huán)境溫度往往是一IO到一20'C,所以必須小心保持授精儀器溫暖。在發(fā)情后40—44天超聲波檢測(cè)到能成活的胎牛確定受孕，在發(fā)情后55—62天進(jìn)一步確認(rèn)，在這段時(shí)間202個(gè)受孕數(shù)少了4個(gè)。55一62天時(shí)每次授精2xl05，5xl()S和10xl06個(gè)總精子的受孕比例是55/103(53%)，71/101(70%)，和72/102(71%)(P<0.1)。與母牛在公牛中自然懷孕的比例是不同的(P0.05)(59，62和74%)，但兩個(gè)技術(shù)人員進(jìn)行的操作結(jié)果無(wú)差別(64%和65%)，在發(fā)情期后的不同時(shí)間授精，結(jié)果也無(wú)差別(12小時(shí)65%，24小時(shí)64%，每次N-153)。用上述方法，每次授精用5><105和10><106總精子，母牛懷孕的比例是相同的。對(duì)已選擇性別、未冷凍的精子細(xì)胞也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，報(bào)道如下；實(shí)施例3將從大西洋育種公司收集的公牛精液，用HEPES緩沖的擴(kuò)充液十0.1%BSA以1:4比例稀釋，約用2小時(shí)運(yùn)到160km處的Beltsville，Maryland，在那里用前述的方法，在環(huán)境氣溫下用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分類至TEST生產(chǎn)的20。/。擴(kuò)充液中(BoilReprod41:199)。每種性別，每5—6小時(shí)分類速度高達(dá)2><106個(gè)精子，純度約為90%。經(jīng)離心(300克4分鐘)濃縮精子到2><106精子/毫升。將一些精子分類到含有同源精液漿液的擴(kuò)充液中(終濃度為5%)?？者\(yùn)分類的精子到克羅拉多(2,600km)，并且分別在大氣溫度或5T:儲(chǔ)藏(運(yùn)載6小時(shí)中用Equitainer冷卻，即一種帶有冰室的隔熱裝置)。在精子分類后9到29小時(shí)內(nèi)對(duì)發(fā)情11到36小時(shí)授精檢測(cè)到的小母牛或無(wú)奶母牛進(jìn)行授精。將精子(O.l毫升中1到2><105)置于授精時(shí)超聲波確定的最大卵泡的卵巢一側(cè)的子宮角的深處。用運(yùn)送并儲(chǔ)藏在大氣溫度的精子授精，io只母牛中沒(méi)有一個(gè)受孕。用運(yùn)送過(guò)程中冷藏在5'C的精子授精，29只母牛在第4周有14個(gè)受孕，27第8周12個(gè)(41%)受孕。分類后10小時(shí)內(nèi)授精的22只母牛，8周時(shí)受孕11只，但在分類后17到24個(gè)小時(shí)授精的7只牛中只有1只懷孕。加入精液漿液沒(méi)有明顯的效果。在懷孕的60—70天時(shí)超聲波成象確定，12個(gè)胎牛中只有l(wèi)只不是預(yù)期的性別，一只性別不清楚，IO只是預(yù)期的性別。隨后，將0.05毫升上述擴(kuò)充的精液植入另外33個(gè)母牛子宮角；在授精后4個(gè)星期只有3個(gè)授孕，8周時(shí)只有一只仍懷孕(未用超聲波成象確認(rèn))。但是，用前面組的不同公牛，所有授精在分類后18到29小時(shí)進(jìn)行。用另一只公牛的精子對(duì)距我們實(shí)驗(yàn)室200km處的另38只母牛進(jìn)行了類似的人工授精，授精在分類后約22小時(shí)進(jìn)行。這些牛沒(méi)有一個(gè)在授精后8星期懷孕?？傊?，用經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行性染色體分類的精子進(jìn)行人工授精，使牛懷孕是可能的，并且胎牛的性別比例接近于90%再分析分類的精子的DNA含量預(yù)測(cè)。但是，在這些需要長(zhǎng)距離運(yùn)送精子的初步實(shí)驗(yàn)中受孕率變化很大。分類這17小時(shí)后生殖力明顯下降，但是其中有一些混亂，因?yàn)椴煌瑫r(shí)間用了不同的公牛。需要進(jìn)行進(jìn)一步研究，以確定所觀察到的受孕率的變化是否由于公牛的不同、授精技術(shù)、精子分類與授精時(shí)間的間隔或其它原因造成的。最后，用未進(jìn)行性別選擇并未冷凍的精子細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，報(bào)告如下實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖谴_定在理想的實(shí)驗(yàn)條件下，用極低數(shù)目精子對(duì)母牛進(jìn)行授精的受孕率，來(lái)自三個(gè)Holstein公牛的精液加入到CornellUniversalExtender,力卩5%的同源精液漿液，擴(kuò)充到每0.1毫升中l(wèi)xl()S或2.5xl(^個(gè)精子；用每0.25毫升2.5><106個(gè)總精子的精液作對(duì)照。將擴(kuò)充完全的精液裝入改進(jìn)的0.25毫升塑料French細(xì)管，可每次釋放出0.1或0，25毫升授精劑量。將精液冷卻到5'C，在收集后26—27小時(shí)使用。每次25毫克前列腺素F—2a(Lutalyse⑧)以12天的間隔注射月齡13—15，體重350-450公斤的Holstein小母牛，用胚移植細(xì)管槍和側(cè)幵口鞘在檢測(cè)到發(fā)情后24小時(shí)在一側(cè)子宮角授精。授精在與發(fā)情后12小時(shí)超聲波確定的最大卵泡同側(cè)；在發(fā)情后7—9天超聲波檢測(cè)到黃體證實(shí)了排卵的一側(cè)。在發(fā)情28后42—45天超聲波檢測(cè)到胎牛確定懷孕。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了四次，由三個(gè)授精技術(shù)人員輪流進(jìn)行。在225個(gè)小母牛中有205個(gè)準(zhǔn)確地確定了排卵側(cè)(91%);驚人的是，同側(cè)和對(duì)側(cè)授精懷孕的比例幾乎相同。對(duì)于lxl05，2,5xl05禾卩2.5x106個(gè)精子/授精(PX).l)懷孕比例是38/93(41%)，45/87(52%)，和25/45(56%)。不同技術(shù)人員操作，母牛懷孕比例有明顯的差異(P0.05)，但在用不同公牛精液沒(méi)有差異。用上述方法，減少每次授精的精子數(shù)，使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分類的精子用于商業(yè)是可能的。從上述各種實(shí)驗(yàn)可以看出，實(shí)施結(jié)論根據(jù)實(shí)地結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出。因此還可設(shè)計(jì)一些實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行適當(dāng)?shù)木C合與限制。這樣，可以使各種影響因素起到進(jìn)一步協(xié)同作用。例如，可以研究染色劑和與激光激發(fā)結(jié)合的染色劑的影響。本發(fā)明申請(qǐng)所討論的只是基本的說(shuō)明。讀者應(yīng)理解特定的實(shí)驗(yàn)并不能清楚敘述所有可能實(shí)施的方案，本發(fā)明這些實(shí)驗(yàn)包含了許多可以替代的情況。本申請(qǐng)也沒(méi)有完全解釋本發(fā)明的全部性質(zhì)，不可能明確顯示每個(gè)特征或要素如何代表了更廣的功能范圍或多種可替代或作用相同的要素。實(shí)際上，這些都包含在本發(fā)明中。在本發(fā)明著重?cái)⑹瞿吃O(shè)備時(shí)，該設(shè)備的每個(gè)部件都包含著一種功能。有關(guān)設(shè)備的權(quán)利要求不僅包括設(shè)備本身，也包括方法、步驟以說(shuō)明本發(fā)明及每個(gè)部件的功能。說(shuō)明及術(shù)語(yǔ)都不限于權(quán)利的范圍，應(yīng)理解在未脫離本發(fā)明的精神下可作各種改變，這些改變都包含在說(shuō)明書(shū)中，仍落入本發(fā)明的范圍。本發(fā)明公開(kāi)的范圍既包括了直接的實(shí)施例，大量可替代的隱含的實(shí)施方案，也包括了方法和步驟等。此外，本發(fā)明中的每一部分也可用多種方法去實(shí)現(xiàn)。應(yīng)理解為包括每種改變，任一設(shè)備方案的改變、方法的改變，或這些要素中的任一改變。尤其是，在本發(fā)明公開(kāi)的申請(qǐng)文件中，每項(xiàng)內(nèi)容都可以用意義相同的儀器術(shù)語(yǔ)或方法術(shù)語(yǔ)表示，即使僅有功能或結(jié)果相同。這種意義相同，范圍寬甚至更概括的術(shù)語(yǔ)應(yīng)認(rèn)為包含于說(shuō)明書(shū)中每項(xiàng)內(nèi)容中。在本發(fā)明所包括的廣義的范圍中需要明確之處，可以替換這些術(shù)語(yǔ)。應(yīng)該理解，一切行動(dòng)都可以用完成這個(gè)行動(dòng)的手段或引起這個(gè)行動(dòng)產(chǎn)生的因素來(lái)表示。同樣，所公開(kāi)的每項(xiàng)實(shí)際內(nèi)容應(yīng)理解為包括了該實(shí)際內(nèi)容所導(dǎo)致產(chǎn)生的行動(dòng)。例如，公開(kāi)了"收集器"，應(yīng)該理解為包括了"收集"這個(gè)行為，無(wú)論文中是否已直接討論過(guò)這種行為。反之，如果僅公開(kāi)了"收集"，應(yīng)理解為也公開(kāi)了"收集器"。這種變化和可替代的術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為已清楚的包括在說(shuō)明書(shū)中。另外，應(yīng)該理解，除了最初提出的權(quán)利要求，權(quán)利要求可擴(kuò)展為更廣泛的范圍，至少i)如本文公開(kāi)和敘述的裝置，ii)公開(kāi)和敘述的有關(guān)方法，iii)與每個(gè)裝置和方法相似的、相同的和暗含變化的裝置、方法，i力完成公開(kāi)和敘述的每個(gè)功能的那些可取代的設(shè)計(jì)，V)隱含了完成公開(kāi)和敘述的每個(gè)功能的那些可取代的設(shè)計(jì)和方法，Vi)分開(kāi)和獨(dú)立的發(fā)明所示的每個(gè)特征，組成和步驟，和vii)上面每項(xiàng)的各種結(jié)合和變換。為有助于理解本發(fā)明，各種公開(kāi)的參考文獻(xiàn)可能是有幫助的。這些參考文獻(xiàn)在下面列出了，并且引入本文作為參考；但是，在敘述與這些發(fā)明的專利不一致的情況下，可以認(rèn)為這些陳述明顯不出自該申請(qǐng)人。可能有幫助的參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利5660997;5589457;5514537;5439362;5346990;5135759;5021244;4999283;4749458;4688142;4680258;4511661;4448767;4362246;4339434;4276139;4225405;4192749;4155831;4092229;4085205;4083957;4067965;4009260;3894529;3687806;RE32350。有幫助的參考文獻(xiàn)可以包括下面出版物"利用非常少的非冷凍精子授精Holstein小母牛"G.E.Seidel,Jr.，C.H.Allen，Z,Brink,J.K.Graham，和M.B.Cattell,克羅拉多州立大學(xué)，F(xiàn)ortCollins,大西洋育種公司，Lancaster,PA.，DUODairy,Loveland，CO.1995年7月；"用X禾卩Y小牛精子人工授精"，GE.Seidel，Jr.，L.A.Johnson，C.A.Allen,GR.Welch,M.D.Holland,Z.Brink和M.B.Cattell，動(dòng)物繁殖和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，克羅拉多州立大學(xué)，F(xiàn)ortCollins,CO;Germplasm和種質(zhì)和配子生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，ARS，USDA，Beltsville，MD;大西洋育種公司，Lancaster,PA;DUODiary,Loveland，CO,USA1996年l月；"利用非常少的冷凍精子授精小母牛"GE.Seidel，Jr.，C.H.Allen,Z.Brink，M.D.Holland,M.B.Cattell,克羅拉多州立大學(xué)，F(xiàn)ortCollins,大西洋育種公司，Lancaster,PA，DUODairy,Lovdand，CO,1996年7月；"利用流式細(xì)胞計(jì)分類和未分類的精液低劑量子宮內(nèi)授精繁殖山羊"，D.GCran，W.A.C.McKelvey,M.E.King,D.F.Dolman,T.G.McEvoy，P丄Broadbent和J丄Robinson，Mastercalf，Craibstone,Bucksburn，Aberdeen,AB219TN，UKScottish農(nóng)業(yè)學(xué)院，Craibstone，Bucksburn，Aberdeen。AB219YA，UK，獸類遺傳學(xué)，第267頁(yè)；"利用非常少的非冷凍和性別選擇的精子子宮角授精小母牛，，，G.E.Seidel,Jr.,C.H.Allen，L.A.Johnson,M.D.Holland,Z.Brink，G.R.Welch,J.K.Gmham和M.B.Cattell,克羅拉多州立大學(xué)動(dòng)物繁殖和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，大西洋育種公司，Lancaster,PA17601,種質(zhì)和配子生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室ARS，USDA，Beltsville，MD20705,DUODiary,Loveland，CO80538，獸類遺傳學(xué)48:1255—1264，1997;"利用Hepqrin的是小牛精子獲能"，J丄Parrish，J.Susko-Parrish，M.A.Winer，和N丄.First,威斯康星大學(xué)肉類和動(dòng)物科學(xué)系，麥迪生，WI53706,繁殖生物學(xué)38，117—1180(1988);"前列腺素F2a——種乳牛的繁殖藥物？"，K.L.Macmillan和A.M.Day,Ruakura動(dòng)物研究站，PrivateBag，Hamilton，新西蘭，獸類遺傳學(xué)，1982年9月，18巻，第3期，245—253頁(yè)；"選擇性別的哺乳動(dòng)物精子的遠(yuǎn)景"，克羅拉多聯(lián)合大學(xué)出版社，克羅拉多州立大學(xué)，獸醫(yī)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)學(xué)院，F(xiàn)ortCollins,CO，80523RupertRAmann和GeorgeE.Seidel,Jr.，編輯，1982年；"卵黃擰檬酸鹽和牛奶擴(kuò)充液對(duì)冷藏公牛精子的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和存活率的影響"，乳品科學(xué)雜志74:3836，D.S.Karabinus和D.P.Evenson和M.T.Kaproth;"在流動(dòng)細(xì)胞計(jì)分類細(xì)胞過(guò)程中測(cè)定公羊和公豬精子"，Reprod.DomAnim32:251;"利用限量pLH補(bǔ)充的純化pFSH進(jìn)行山羊超排卵"，獸類學(xué)，43:797，M.A.Nowshari，J.F.Beckers和W.Holtz;"綜述在哺乳動(dòng)物中預(yù)選擇性別"，Dtsch.tierarztl.Wschr.103:285，L.A.Johnson。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非本文需要，詞"含有"或"包括"、"包含"，將理解為包括所述的部分或整體，或包括了幾個(gè)部分、幾個(gè)整體的組合，但并不表示排斥任何其它部分、整體或部分、整體的組合。3權(quán)利要求1.為分類所需的細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，包括a.提供流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析細(xì)胞的一種細(xì)胞源；b.為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種外鞘液環(huán)境的外鞘液源；c.一個(gè)噴嘴，進(jìn)入所述外鞘液環(huán)境的所述細(xì)胞可以通過(guò)其噴出；d.一個(gè)振蕩器，當(dāng)所述外鞘液通過(guò)所述噴嘴時(shí)作用于該外鞘液；e.一個(gè)能夠?qū)λ黾?xì)胞起反應(yīng)的細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)；f.一個(gè)可以分出所需特性細(xì)胞的分類區(qū)別系統(tǒng)；g.放置具有所需特性細(xì)胞的收集器，該收集器含有約6％卵黃的檸檬酸鹽收集液。2.權(quán)利要求2所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的外鞘液源含有約2.9%檸檬酸鈉溶液。3.權(quán)利要求1或2所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括牛精子細(xì)胞。4.權(quán)利要求1所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括對(duì)其液體環(huán)境中的化學(xué)成分高敏感的細(xì)胞。5.權(quán)利要求1所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器用于供應(yīng)低劑量的精子。6.權(quán)利要求5所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的噴嘴、振蕩器、細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)和分類區(qū)別系統(tǒng)是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)的組件，其中所述流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)包括一個(gè)高速細(xì)胞分類器°7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)產(chǎn)生的性別分類的精子樣品。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的性別分類的精子樣品，其中所述的收集器用于供應(yīng)低劑量的精子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的性別分類的精子樣品，其中所述的噴嘴、振蕩器、細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)和分類區(qū)別系統(tǒng)是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)的組件，其中所述流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)包括一個(gè)高速細(xì)胞分類器。10.使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)產(chǎn)生的性別分類的精子樣品繁殖的哺乳動(dòng)物。11.權(quán)利要求10所述的哺乳動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物通過(guò)使用低劑量的精子繁殖。12.權(quán)利要求10所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的噴嘴、振蕩器、細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)和分類區(qū)別系統(tǒng)是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)的組件，其中所述流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)包括一個(gè)高速細(xì)胞分類器。13.為分類所需的細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，包括a.提供一種供流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析精子細(xì)胞的細(xì)胞源；b.為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種外鞘液環(huán)境的化學(xué)協(xié)調(diào)的外鞘液源；c.一個(gè)噴嘴，進(jìn)入所述外鞘液環(huán)境的所述細(xì)胞可以通過(guò)其噴出；d.—個(gè)振蕩器，當(dāng)所述外鞘液通過(guò)所述噴嘴時(shí)作用于該外鞘液；e.—個(gè)能夠?qū)λ黾?xì)胞起反應(yīng)的細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)；f.一個(gè)可以分出所需特性細(xì)胞的分類區(qū)別系統(tǒng)；g.放置具有所需特性細(xì)胞的收集器，該收集器包括有一種化學(xué)協(xié)調(diào)的收集器液體外鞘液源，為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種收集器液體環(huán)境，該外鞘液源被前述細(xì)胞液體環(huán)境所協(xié)調(diào)。14.權(quán)利要求13所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器液體含有一種營(yíng)養(yǎng)劑，在所述細(xì)胞完成分類后，該營(yíng)養(yǎng)劑在收集液中的含量仍保持平衡。15.權(quán)利要求14所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器液體含有約6%卵黃的行檬酸鹽收集液。16.權(quán)利要求14所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括在所述收集液環(huán)境中對(duì)化學(xué)成分高敏感的細(xì)胞。17.權(quán)利要求13或14所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括精子細(xì)胞。18.權(quán)利要求17所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括牛精子細(xì)胞。19.權(quán)利要求13所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器用于提供低劑量的精子。20.權(quán)利要求19所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的低劑量的精子包括精子劑量低于典型人工授精劑量的約腦。21.權(quán)利要求19所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的精子細(xì)胞包括牛精子細(xì)胞，其中所述低劑量的精子包括低于50萬(wàn)精子數(shù)目。22.權(quán)利要求19所述的為分類所需細(xì)胞改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的精子細(xì)胞包括牛精子細(xì)胞，其中所述低劑量的精子包括低于30萬(wàn)精子數(shù)目。23.權(quán)利要求13、17或19所述的為所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的噴嘴、振蕩器、細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)和分類區(qū)別系統(tǒng)是流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的組件，其中流式細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)包括一個(gè)高速細(xì)胞分類器。24.權(quán)利要求23所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的高速細(xì)胞分類器以每秒至少500個(gè)的速度分類所述待分析細(xì)胞。25.權(quán)利要求23所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的高速細(xì)胞分類器在每平方英寸至少50磅的壓力下進(jìn)行操作。26.權(quán)利要求23所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的外鞘液源包括一種化學(xué)協(xié)調(diào)的外鞘液源，為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種外鞘液環(huán)境，使分類前后的細(xì)胞的液體環(huán)境協(xié)調(diào)一致。27.權(quán)利要求25所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的化學(xué)協(xié)調(diào)的外鞘液源包括一種含有約2.9%檸檬酸鈉的溶液。28.權(quán)利要求13、17或19所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器具有緩沖因素。29.權(quán)利要求28所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的收集器包括一個(gè)具有緩沖因素的容器。30.權(quán)利要求29所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的容器有一個(gè)粗的收集管。31.權(quán)利要求30所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的粗的收集管至少有約15mm寬。32.權(quán)利要求29所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的容器包括一個(gè)與液流物理性質(zhì)相配的容器的試管。33.權(quán)利要求30所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括機(jī)械性質(zhì)脆弱的細(xì)胞。34.權(quán)利要求33所述的為分類所需細(xì)胞而改進(jìn)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞源包括精子細(xì)胞。35.—種分類細(xì)胞的方法，包括a.建立一種可以提供待分類的細(xì)胞的細(xì)胞源；b.配制一種外鞘液，為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種外鞘液環(huán)境；c.檢測(cè)所述細(xì)胞的性質(zhì)；d.辯認(rèn)出所需性別的細(xì)胞；e.在一種收集液中收集所需性別的細(xì)胞；f.調(diào)配所述收集液，為所述細(xì)胞創(chuàng)造一種終端收集液環(huán)境，使與分類前收集液環(huán)境一致。36.權(quán)利要求35所述的分類細(xì)胞的方法，其中所述建立一種細(xì)胞源包括為所述細(xì)胞提供一種初始營(yíng)養(yǎng)，還包括為所述細(xì)胞提供一種收集液營(yíng)養(yǎng)，其中所述的在一種收集液中收集具有所需特性的細(xì)胞，包括使所述初始營(yíng)養(yǎng)與完成收集所述細(xì)胞后收集液中的營(yíng)養(yǎng)保持平衡。37.權(quán)利要求36所述的分類細(xì)胞的方法，其中所述的在一種收集液中收集具有所需特性的細(xì)胞，包括開(kāi)始所述的收集之前制備含有約6%卵黃的檸檬酸鹽收集液。38.權(quán)利要求36所述的分類細(xì)胞的方法，其中所述的建立一種細(xì)胞源包括建立一種牛精子細(xì)胞源。39.權(quán)利要求35所述的分類細(xì)胞的方法，還包括用低劑量的所述精子細(xì)胞對(duì)一種哺乳動(dòng)物進(jìn)行人工授精。40.制備性別選擇的精子樣品的方法，包括用權(quán)利要求35的方法制備所述樣品。41.權(quán)利要求40所述的制備性別選擇的精子樣品的方法，還包括以高速分類所述細(xì)胞。42.權(quán)利要求40所述的制備性別選擇的精子樣品的方法，還包括為了用低劑量的所述精子細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行人工授精提供所述性別選擇的精子細(xì)胞樣品。43.權(quán)利要求41所述的制備性別選擇的精子樣品的方法，還包括為了用低劑量的所述精子細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行人工授精提供所述性別選擇的精子細(xì)胞樣品。44.繁殖所需性別的哺乳動(dòng)物的方法，包括用權(quán)利要求35中所述的方法繁殖所述動(dòng)物。45.權(quán)利要求44所述的繁殖哺乳動(dòng)物的方法，還包括以高速分類所述細(xì)胞。46.權(quán)利要求45所述的制備性別選擇的精子樣品的方法，還包括用低劑量的所述精子細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行人工授精。47.權(quán)利要求46所述的制備性別選擇的精子樣品的方法，還包括用低劑量的所述精子細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行人工授精。全文摘要本發(fā)明提供一種以少量精細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行有性別選擇的授精技術(shù)，特別是以商業(yè)上可實(shí)施的方式并用以前認(rèn)為在商業(yè)上不可能實(shí)現(xiàn)的精子劑量進(jìn)行人工授精，繁殖性別選擇的哺乳動(dòng)物后代。本發(fā)明通過(guò)采用精子性別選擇的分類技術(shù)，還實(shí)現(xiàn)了超數(shù)排卵、產(chǎn)生多個(gè)胚胎以得到選擇性別的胚胎。本發(fā)明的授精技術(shù)結(jié)合了包括改進(jìn)外鞘液的技術(shù)和其它使精細(xì)胞壓力最小化的技術(shù)，改進(jìn)了精子收集系統(tǒng)和收集技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了精子樣品及其所繁殖的動(dòng)物在商業(yè)上的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N5/00GK101498711SQ20081012805公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期1998年12月31日優(yōu)先權(quán)日1997年12月31日發(fā)明者麗沙·赫里克夫,喬治·E·賽德,約翰·申克申請(qǐng)人:Xy公司;科羅拉多州州立大學(xué)研究基金會(huì)