專利名稱：一種具有高效轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶的新基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種β -半乳糖苷酶的新基因及其重組酶和重組酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低聚糖(oligosaccharides)又稱寡糖，是指由2 10個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈的一類低度聚合糖，它是自然界存在的一類具有廣譜化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著生物功能的有機(jī)化合物.低聚糖按其生理功能可分為普通低聚糖和功能性低聚糖，功能性低聚糖主要包括低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、甘露低聚糖等，具有良好的雙岐桿菌活化效果、能改善便秘、降低血壓血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC3. 2. 1.23)，一方面，能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖；另一方面，在乳糖分子的半乳糖一側(cè)連接1-8個(gè)半乳糖，合成低聚半乳糖 (galactooligosaccharide, G0S)。低聚半乳糖是目前各類功能性低聚糖品種中唯一源自動(dòng)物乳汁中的低聚糖，具有良好的保健功能(1)廣譜益生菌增值因子及與其相關(guān)的生理功能，例如促進(jìn)有機(jī)酸生成使腸道PH下降抑制外源菌生長(zhǎng)、生成大量短鏈脂肪酸、產(chǎn)生B族維生素等；(2)低甜度低熱量，難被人體消化，食用后基本上不增加血糖血脂，但有潤(rùn)腸通便作用；(3)低齲齒性，不被引起齲齒的鏈球菌所利用；(4)改善脂質(zhì)代謝，降低總血清膽固醇濃度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例；(5)改善礦物元素的吸收利用，促進(jìn)對(duì)鈣的吸收，同時(shí)使腸道對(duì)鈉的吸收有降低的傾向，而對(duì)鈣的吸收有升高的傾向。因此，低聚半乳糖在食品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。目前，低聚半乳糖合成主要有以下幾種方法(1)化學(xué)合成由于糖具有活性羥基，傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法因需要繁瑣和高選擇性的保護(hù)和去保護(hù)步驟以及保證產(chǎn)品具有立體化學(xué)性的困難性使該方法變得不切實(shí)際。(2)糖苷轉(zhuǎn)移酶合成利用糖苷轉(zhuǎn)移酶合成低聚半乳糖主要有兩方面的問(wèn)題，一是需要價(jià)格昂貴的底物(糖核苷)，二是糖苷轉(zhuǎn)移酶來(lái)源有限、產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差；(3)糖苷合成酶作為糖苷水解酶的突變體合成低聚半乳糖，需要活化的氟代糖作為供體才能發(fā)生反應(yīng)，價(jià)格昂貴，而天然的底物(如乳糖)無(wú)活性不能直接作為供體合成低聚乳糖。(4) β -D-半乳糖苷酶β -D-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物內(nèi)，其催化的糖苷和低聚糖合成反應(yīng)途徑簡(jiǎn)單，不需要其它輔助因子，反應(yīng)底物是價(jià)格便宜的乳糖，酶容易獲得，性質(zhì)穩(wěn)定。但是，糖苷酶在合成反應(yīng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)糖基新生成的糖苷和寡糖也可以重新被該酶作為底物水解，反應(yīng)處于水解和合成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的產(chǎn)率仍然較低，并且還會(huì)產(chǎn)生許多不需要的位置同分異構(gòu)體存在，給產(chǎn)品的分離純化造成困難。為了打破這個(gè)平衡，利用酶反應(yīng)熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)原理，加大底物的濃度，采用高濃度的有機(jī)溶劑或兩相反應(yīng)體系，降低水的濃度和活度，促使反應(yīng)向糖苷合成的方向進(jìn)行，可以提高糖苷產(chǎn)物的得率。與在水溶液中進(jìn)行的酶催化反應(yīng)相比，酶在非水相中進(jìn)行催化反應(yīng)有如下優(yōu)越性①有利于疏水性底物的反應(yīng)；②酶不溶于有機(jī)溶劑，容易回收再利用；③使反應(yīng)熱力學(xué)平衡從水分解反應(yīng)轉(zhuǎn)為其逆反應(yīng)，防止依賴于水的副反應(yīng)發(fā)生，如糖合成、肽合成、酯交換反應(yīng)等；④能提高酶的穩(wěn)定性，可擴(kuò)大反應(yīng)的適應(yīng)范圍；⑤可控制底物的專一性；⑥沒(méi)有微生物污染。因此，獲得能夠耐有機(jī)溶劑中的β-D-半乳糖苷酶顯得尤為重要。微生物作為 β -D-半乳糖苷酶合成的主要來(lái)源，從耐受有機(jī)溶劑的微生物中分離耐有機(jī)溶劑的酶是一種有效的方法，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)?？紤]到微生物分離培養(yǎng)存在明顯的局限性，利用現(xiàn)有的技術(shù)，能被培養(yǎng)的微生物比例不足總數(shù)的1 %，大量未被培養(yǎng)或不能 被培養(yǎng)的微生物具有巨大的應(yīng)用潛力。宏基因組方法是從未培養(yǎng)微生物中尋找新型功能基因和活性物質(zhì)的一種重要手段，至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)克隆到單加氧酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶等新基因，因此該方法為發(fā)現(xiàn)半乳糖苷酶新基因提供了新思路。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用宏基因組技術(shù)從海底泥中獲得具有高效轉(zhuǎn)糖基性能的β“半乳糖苷酶研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種半乳糖苷酶的新基因。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述半乳糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供含有上述半乳糖苷酶基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供利用上述表達(dá)載體構(gòu)建的重組半乳糖苷酶及其制備方法。本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供上述重組酯酶在將乳糖高效轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖混合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明提供的上述新型β -半乳糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種半乳糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法，提取海底泥的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接到克隆載體P Δ LacZ上，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)涂布含 X-gal的LB平板顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。上述克隆載體P Δ LacZ是通過(guò)如下方法獲得的用NdeI和SmaI雙酶切pUC19質(zhì)粒去除其中大約200bp的IacZ序列產(chǎn)生約2400bp無(wú)IacZ序列，膠回收并用Klenow大片段酶補(bǔ)平末端，用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化Ecoli DH5 α，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、搖菌并提取P Δ LacZ質(zhì)粒。用BamHI單酶切P Δ LacZ質(zhì)粒，并用堿性磷酸酶 (CIAP,TAKARA)去磷酸化制備載體，具體操作方法參照Alkaline Phosphatase (CIAP)說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有上述的半乳糖苷酶基因。本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種重組半乳糖苷酶的制備方法，包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組β-半乳糖苷酶。上述重組β-半乳糖苷酶的制備方法中，表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌。上述重組β -半乳糖苷酶的制備方法，其具體過(guò)程為包括用BamHIdindIII雙酶切獲得目的基因并連接pET-32a(+)載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。 所述的IPTG終濃度為0. 6-1. 8mM，誘導(dǎo)溫度為18_37°C。本發(fā)明提供的重組半乳糖苷酶，包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組β “半乳糖苷酶的方法和步驟。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述重組β-半乳糖苷酶在將乳糖高效轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖混合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是①.本發(fā)明從海底泥樣品構(gòu)建好的宏基因組文庫(kù)中得到一個(gè)新的β _半乳糖苷酶的DNA序列，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)其功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，減去融合蛋白，初步確定該β-半乳糖苷酶的分子量約為75KDa。②.本發(fā)明將SEQ ID NO. 1所示的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下(1)在大腸桿菌表達(dá)體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達(dá)；(2)以乳糖為底物，測(cè)得重組β-半乳糖苷酶M221的最適反應(yīng)溫度為55°C，升高或降低溫度都會(huì)導(dǎo)致酶活性的減少。該酶在50°C、35°C、25°C時(shí)酶活分別為最高酶活性的 91%、55%、29%。在50°C以下，該乳糖酶的活性很穩(wěn)定。但是，在65°C時(shí)，殘留酶活性為 22%，在70°C條件，幾乎完全失活。該酶的最適反應(yīng)pH為8.0，在pH 6. 5-9.0的范圍內(nèi)活性比較穩(wěn)定，仍保留大于70%的酶活。測(cè)定金屬離子和生化試劑對(duì)酶活力影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含稀釋酶液的反應(yīng)體系中分別含有 IOOmM EDTAUOmM MgCl2UOmM MnCl2UmM FeCl2UmMZnSO4 時(shí)，β -半乳糖苷酶Μ221的活性沒(méi)有顯著的改變；但是當(dāng)含有ImM CuSO4時(shí)，酶活受到強(qiáng)烈的抑制，而Na+、K+和Ca2+在低濃度時(shí)(IOmM)則對(duì)酶活性有輕微的促進(jìn)作用。③.本發(fā)明在研究重組β-半乳糖苷酶Μ221以乳糖為底物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)在含有30%乳糖溶液的反應(yīng)體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)12-24h，經(jīng)薄層層析(TLC)掃描和 HPLC分析，低聚半乳糖產(chǎn)量為47. 8%。


圖1為實(shí)施例1中重組β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量maker，1為重組蛋白粗提物，2為純化的重組蛋白；圖2為實(shí)施例2中的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為實(shí)施例3中pH值對(duì)重組β -半乳糖苷酶降解乳糖時(shí)酶活性(■)和穩(wěn)定性(·)的影響折線圖；圖4為實(shí)施例3中溫度值對(duì)重組β -半乳糖苷酶降解乳糖時(shí)酶活性(■)和穩(wěn)定性(·)的影響折線圖；圖5為實(shí)施例4中重組β -半乳糖苷酶Μ221以乳糖為底物的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)生成低聚半乳糖的薄層層析(TLC)分析結(jié)果圖，其中1為反應(yīng)生成產(chǎn)物；2為葡萄糖、半乳糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)樣品。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1宏基因組文庫(kù)的建立和陽(yáng)性克隆子的獲得、基因克隆與表達(dá)1、總DNA的提取稱取5g樣品，樣品為海洋底泥，加入13.5mL DNA提取緩沖液(0. 1M Tris, 0. IMEDTA-Na, 0. 1M Na3PO4,1. 5M NaCl，1 % CTAB，pH 值 8. 0)，劇烈振蕩混勻，加入 300 μ L 溶菌酶(100mg/ml)，反復(fù)顛倒 5-6 次，37°C水浴 30min，加入 1. 5ml 20% SDS，65°C水浴 1h (期間每隔15min上下顛倒幾次)，8000r/min離心5min，取上清液，用等體積氯仿抽提2次， 8000r/min離心lOmin，取上清，加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置2h，20000r/min離心 20min,棄上清，沉淀加5mL預(yù)冷的70%乙醇，20000r/min離心lOmin，收集DNA沉淀，風(fēng)干， 用適量TE緩沖液溶解。2、試劑盒法純化DNA 按照OMEGA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3、宏基因組電泳檢測(cè)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA量和純度。4、酶切總DNA 用限制性內(nèi)切酶BamHI部分酶切總DNA，回收2_8kb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。5、克隆載體PALacZ的構(gòu)建用NdeI和SmaI進(jìn)行雙酶切pUC19質(zhì)粒去除其中大約200bp的IacZ序列產(chǎn)生約2400bp無(wú)IacZ序列，膠回收并用Klenow大片段酶補(bǔ)平末端， 用T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化Ecoli DH5 α，涂布含氨芐青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、搖菌并提取P Δ LacZ質(zhì)粒。用BamHI單酶切P Δ LacZ質(zhì)粒，并用堿性磷酸酶(CIAP，TAKARA) 去磷酸化制備載體，具體操作方法參照Alkaline Phosphatase (CIAP)說(shuō)明書(shū)。5、酶切片段及克隆載體的電泳檢測(cè)方法同宏基因組電泳檢測(cè)。6、酶切片段的鏈接將回收得到的酶切片段和上述構(gòu)建好的克隆載體連接過(guò)夜， 按照OMEGA Micro Elute 丨CycIe-Pure Kit操作回收連接產(chǎn)物。7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化吸取3 μ L的連接產(chǎn)物加入到100 μ L的大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)中，2500V/cm(Eppdoff2510 電擊儀)電擊 1 次，46°C熱激 6-lOmin，37°C，180_200rpm 搖床培養(yǎng)45-60min，吸取20-50 μ 涂布于含氨芐青霉素(100 μ g/ml)、IPTG(ImM)和 X-gal (24 μ g/ml)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。由此構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量達(dá)20000個(gè)轉(zhuǎn)化子、多樣性好的宏基因組文庫(kù)。8、文庫(kù)篩選和陽(yáng)性克隆子的鑒定將涂布后的平板至于37°C培養(yǎng)72h，由于β-半乳糖苷酶氧化X-gal生成吲哚衍生物顯藍(lán)色，因而顯藍(lán)色的菌落即為陽(yáng)性克隆子。通過(guò)篩選得到一株陽(yáng)性克隆子。從平板中將陽(yáng)性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素 (100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C,220r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取2mL菌體進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)插入片段測(cè)序，將測(cè)定的序列經(jīng)過(guò)NCBI的BLASTn軟件分析比較，發(fā)現(xiàn)該DNA由1995個(gè)堿基組成，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該DNA編碼的多肽，含664個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 3 所示，將其命名為M221。其中SEQ ID N0. 2為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3的對(duì)照?qǐng)D。
9、基因片段的克隆根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)引物F1和F2，引物兩端引入能插入 pET-32a(+)載體的HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)，引物序列如下Fl 5' -CGCGGATCC ATG AAC TTC CCA CAT TTC CTT TAT GGC GGCF2 5' -CCCAAGCTT CTA GCC TCG ATC CAC TTG AAG GAT GGC AAC利用兩條引物，以質(zhì)粒P Δ LacZ-M221為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系如下

權(quán)利要求
1.一種β-半乳糖苷酶，其特征是它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種β-半乳糖苷酶，其特征是它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的β-半乳糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征是提取海底泥的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)BamHI酶切，連接到克隆載體P Δ LacZ上，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)涂布含X-gal的LB平板顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。
4.一種表達(dá)載體，其特征是所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1或2所述的β -半乳糖苷酶基因。
5.一種重組半乳糖苷酶的制備方法，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組β -半乳糖苷酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組酯酶的制備方法，其特征是其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組半乳糖苷酶的制備方法，其特征是其具體過(guò)程為 包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體的目的片段經(jīng)BamHI、HindIII雙酶切，與pET_32a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組β-半乳糖苷酶的制備方法，其特征是所述的IPTG終濃度為0. 6-1. 8mM，誘導(dǎo)溫度為18-37°C。
9.一種重組半乳糖苷酶，其特征是包括用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組β -半乳糖苷酶的步驟的方法制備。
10.權(quán)利要求9所述的重組酯酶在將乳糖高效轉(zhuǎn)化為低聚半乳糖混合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種β-半乳糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明還公開(kāi)了含上述β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建，及重組酶及其在以乳糖為底物的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成低聚半乳糖中的應(yīng)用。該新型重組β-半乳糖苷酶在大腸桿菌表達(dá)體系中具有高效的可溶性表達(dá)，且該重組β-半乳糖苷酶在含30％乳糖體系中轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)合成低聚半乳糖產(chǎn)量為47.8％。
文檔編號(hào)C12N9/38GK102154239SQ201110001568
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者劉孝龍, 劉玉煥, 王魁, 魯毅 申請(qǐng)人:中山大學(xué)