一型硫氧還蛋白在內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)中的應(yīng)用及內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一型硫氧還蛋白在內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)中的應(yīng) 用及內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，構(gòu)建組織工程化血管所用內(nèi)皮種子細(xì)胞多是從成年動物或人體大血管消化 得到的成熟內(nèi)皮細(xì)胞，這不僅造成新的機(jī)體創(chuàng)傷，而且該來源的內(nèi)皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程 中，細(xì)胞擴(kuò)增量和細(xì)胞活性均不理想，很難達(dá)到預(yù)期的效果。因此急需一種增殖能力和活性 俱佳的血管內(nèi)皮細(xì)胞來作為種子細(xì)胞。
[0003] 內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì) 胞，是⑶34陽性細(xì)胞的一個(gè)亞群。1997年有文獻(xiàn)報(bào)道在體外成功地將⑶34陽性細(xì)胞誘導(dǎo) 成血管內(nèi)皮細(xì)胞，說明在成人體內(nèi)存在內(nèi)皮祖細(xì)胞。后有多篇報(bào)道證實(shí)，由EPCs分化而來 的內(nèi)皮細(xì)胞能夠參與實(shí)體腫瘤血管化，心肌局部缺血以及肢體局部缺血側(cè)枝循環(huán)的建立。 因此，EPCs有望成為血管組織工程內(nèi)皮種子細(xì)胞的一個(gè)新來源。
[0004] 然而，現(xiàn)有技術(shù)對EPCs的培養(yǎng)效果大多不甚理想，普遍存在著一些問題導(dǎo)致EPCs 無法再體外穩(wěn)定的增殖，例如：增殖天數(shù)有限（通常在12天內(nèi)）、傳代次數(shù)有限（通常在P6 代以內(nèi)）、增殖倍數(shù)不高（通常在50倍以下）、容易老化（細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長，細(xì)胞表面標(biāo) 志物⑶34+、VEGFR-2(也可寫成⑶309) +表達(dá)就越低）；同時(shí)批間差較大，不同人來源的標(biāo) 本培養(yǎng)出的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量差異較大，無法穩(wěn)定生產(chǎn)；上述這些問題都導(dǎo)致了 EPCs無法穩(wěn) 定的生產(chǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致無法在臨床上很好的應(yīng)用EPCs。
[0005] 導(dǎo)致EPCs增殖效果不佳的問題主要在于培養(yǎng)液的配方，傳統(tǒng)配方中為了維持 EPCs的活性通常需要加入胎牛血清，然而異源血清的加入提高了人體發(fā)生排異反應(yīng)的風(fēng) 險(xiǎn)，并且，異源血清雖然營養(yǎng)豐富，但是對細(xì)胞活性的維持效果其實(shí)十分有限，無法達(dá)到臨 床對EPCs培養(yǎng)效果的需求。
[0006] 硫氧還蛋白是一類在細(xì)胞內(nèi)具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質(zhì)，具有抗氧化 并促進(jìn)血管生成的作用，但其在體外的活性尚未得到證實(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一型硫氧還蛋白在內(nèi)皮祖細(xì)胞的培 養(yǎng)中的應(yīng)用及內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，一型硫氧還蛋白的加入能夠 提高EPCs的增殖倍數(shù)，延長細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，延緩EPCs的衰老，且成本較低。
[0008] 本發(fā)明提供了一型硫氧還蛋白在延緩內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老、提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖效率 中的應(yīng)用。
[0009] 硫氧還蛋白是細(xì)胞內(nèi)可溶性、對熱穩(wěn)定、具有氧還原活性的酸性小分子蛋白質(zhì)，一 型硫氧還蛋白位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，包含108個(gè)氨基酸殘基?，F(xiàn)有技術(shù)表明，一型硫氧還 蛋白在多種刺激特別是氧化應(yīng)激條件下可誘導(dǎo)表達(dá)，提示一型硫氧還蛋白是細(xì)胞抵抗氧化 應(yīng)激的重要分子，能夠保護(hù)組織或細(xì)胞免受多種刺激的損傷。且一型硫氧還蛋白在炎性病 變組織中高表達(dá)、具有抗氧化、抗凋亡、類趨化因子細(xì)胞因子活性，能夠調(diào)芐基因表達(dá)，保護(hù) 再灌注損傷、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的亞硝基化。
[0010] 本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)液中添加一型硫氧還蛋白培養(yǎng)EPCs，細(xì)胞傳代7 代仍保持旺盛的生長和良好的活力，傳代7代細(xì)胞增殖1686倍，細(xì)胞傳代10代，表面標(biāo)志 物⑶309的表達(dá)量為98 %，干細(xì)胞特性保持良好。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，一型硫氧還蛋白能夠 提高EPCs的增殖倍數(shù)，延長細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，延緩EPCs的衰老。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、人類轉(zhuǎn)化因子、干細(xì)胞 生長因子、丙酮酸鈉、胰島素、牛血清白蛋白、堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和一 型硫氧還蛋白。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0013] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，人類轉(zhuǎn)化因子、干細(xì)胞生長因子、胰島素、牛血清白蛋白、 堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和一型硫氧還蛋白的質(zhì)量比為15 :15 :15000 : 40000 :20 :20 : (10 ~40)。
[0014] 在一些實(shí)施例中，人類轉(zhuǎn)化因子、干細(xì)胞生長因子、胰島素、牛血清白蛋白、堿性成 纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和一型硫氧還蛋白的質(zhì)量比為15 :15 :15000 :40000 :20 : 20 ：40〇
[0015] 在一些實(shí)施例中，一型硫氧還蛋白的濃度為10ng/mL~40ng/mL。
[0016] 優(yōu)選的，一型硫氧還蛋白的濃度為40ng/mL
[0017] 在一些實(shí)施例中，丙酮酸鈉的濃度為20 μ mol/mL。
[0018] 人類轉(zhuǎn)化因子（TGF-β)是一多功能蛋白質(zhì)，能夠影響細(xì)胞生長、分化、凋亡及免 疫調(diào)節(jié)。干細(xì)胞生長因子（Stem Cell Growth Factors)為一種具有刺激自體內(nèi)源性干細(xì) 胞生長的高效蛋白質(zhì)、酶組合，也是體外培養(yǎng)干細(xì)胞必不可少的各種細(xì)胞生長因子的組合， 富含表皮生長因子（EGF)、纖維細(xì)胞生長因子（FGF)、神經(jīng)生長因子（NGF)、肝細(xì)胞生長因 子（HGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)、血小板源性生長因子（PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)等多重有效成分。胰島素能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，提高細(xì)胞對葡萄 糖的利用率。牛血清白蛋白在動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和機(jī)械保護(hù) 作用和載體作用。堿性成纖維生長因子（bFGF)在體內(nèi)具有潛在的促血管生成活性。血管 內(nèi)皮生長因子（VEGF)由多數(shù)腫瘤細(xì)胞、傷口中角質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其受體僅表達(dá)于 血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，能增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管形成。丙酮酸鈉 可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加上述生長因子，從而對內(nèi)皮 祖細(xì)胞的生長起到良好的促進(jìn)作用。維持了內(nèi)皮祖細(xì)胞良好的生長活力和干細(xì)胞特性。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液將單 個(gè)核細(xì)胞懸浮至密度為I X IO4個(gè)/mL~9X 10 4個(gè)/mL，培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液及未貼壁 細(xì)胞，以本發(fā)明提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞70 %~90 %融合，傳代。
[0020] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為：將臍帶血或骨髓經(jīng)ficoll淋巴 細(xì)胞分離液分離后以PBS緩沖液清洗，制得單個(gè)核細(xì)胞。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，傳代的次數(shù)為10次。
[0022] 層黏連蛋白包被能夠促進(jìn)細(xì)胞貼壁。
[0023] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，培養(yǎng)采用經(jīng)層黏連蛋白包被的容器，層黏連蛋白包被的濃 度為 10 μ g/mL。
[0024] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，培養(yǎng)的溫度為37°C，條件為5% C02。
[0025] 本發(fā)明提供了一型硫氧還蛋白在延緩內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老、提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖效率 中的應(yīng)用。并提供的培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法。本發(fā)明在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加多 種生長因子并添加一型硫氧還蛋白，從而對內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長起到良好的促進(jìn)作用。維持 了內(nèi)皮祖細(xì)胞良好的生長活力和干細(xì)胞特性。本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)液中添加一 型硫氧還蛋白培養(yǎng)EPCs，細(xì)胞傳代7代仍保持旺盛