專利名稱：重組因子Ⅷ在無蛋白培養(yǎng)基中的制備的制作方法
領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及重組因子Ⅷ的制備并且特別地涉及在血清或無蛋白培養(yǎng)基中重組因子Ⅷ的制備。
背景技術(shù)：
血友病A是X-連鎖的隱性遺傳病，它是由于因子Ⅷ分子有缺陷或不足的而導(dǎo)致的出血傾向。為控制出血，可以用因子Ⅷ治療血友病。在歷史上因子Ⅷ從人類血漿中加以分離。然而，從血漿來源的因子Ⅷ的治療伴隨多種人類病毒，如肝類和人類免疫缺陷病毒的傳播。
隨著重組DNA技術(shù)的問世，人類因子Ⅷ及其基因的結(jié)構(gòu)已被闡明。源自26個(gè)外顯子的該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為約9000個(gè)堿基長(zhǎng)度的信使RNA分子，其編碼一個(gè)2351個(gè)氨基酸的大型蛋白。對(duì)因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)研究顯示其為含有較多碳水化合物殘基的糖蛋白。
編碼因子Ⅷ的cDNA己被克隆并在幼年倉(cāng)鼠腎(BHK-21)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。已開發(fā)出商業(yè)方法以制備用于治療血友病A的重組因子Ⅷ。現(xiàn)在通過遺傳工程的哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組因子Ⅷ，因此，避免了依賴血漿并且使病毒傳播的可能風(fēng)險(xiǎn)降為最低。
基因擴(kuò)增已成為獲得高產(chǎn)量治療蛋白細(xì)胞系的首選方法。擴(kuò)增策略包括將編碼所需蛋白的轉(zhuǎn)錄與可擴(kuò)增的標(biāo)記如二氫葉酸還原酶相連接。然后應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。篩選對(duì)選擇藥物如氨甲蝶呤具有增強(qiáng)抗性的細(xì)胞種群。通過限制性稀釋克隆完成建立穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。然后將這些細(xì)胞克隆適應(yīng)于無血清的制備培養(yǎng)基并檢測(cè)所需蛋白的產(chǎn)量。
對(duì)于不穩(wěn)定的蛋白如因子Ⅷ，在制備和純化步驟中加入人類清蛋白作為穩(wěn)定劑。雖然清蛋白通過巴斯德消毒加以病毒滅活，但是如果重組因子Ⅷ可在完全沒有人類及動(dòng)物血液蛋白存在時(shí)制備將是理想的。我現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)通過用一種新的細(xì)胞培養(yǎng)基這是可能的。詳述如下。
在沒有任何人類或動(dòng)物來源血漿蛋白時(shí)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中連續(xù)制備相對(duì)大量的重組因子Ⅷ(rFⅧ)的方法包括在補(bǔ)充以如Pluronic F-68的多元醇(polyo1)聚合物的無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括硫酸銅、硫酸亞鐵/EDTA復(fù)合物及微量金屬鹽如錳、鉬、硅、鋰、及鉻。
重組蛋白表達(dá)技術(shù)的最新進(jìn)展已使在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大量制備蛋白成為可能。適于因子Ⅷ制備的宿主細(xì)胞包括細(xì)胞系如幼年倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和人類胚胎腎(HEK)細(xì)胞。特別優(yōu)選的為幼年倉(cāng)鼠腎細(xì)胞，特別是那些以能夠按Wood等(1984)所述介導(dǎo)因子Ⅷ表達(dá)的基因轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞。這些細(xì)胞系保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)中并己得到許可號(hào)ATCC CRL-8544。
帶有因子Ⅷ基因的所需的宿主細(xì)胞系一般適于在補(bǔ)充以脂蛋白的無蛋白制備培養(yǎng)基中作為懸浮培養(yǎng)物而培養(yǎng)。選擇用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞系的基本培養(yǎng)基對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要的并且可以是任何一種本領(lǐng)域眾所周知的適于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基或其組合。商業(yè)上可得到的培養(yǎng)基如Dulbecco’sModified Eagle培養(yǎng)基，Ham’s培養(yǎng)基F-2,Eagle’s基本培養(yǎng)基，及RPMI-1640培養(yǎng)基等。在本領(lǐng)域中添加生長(zhǎng)因子加重組胰島素是常見的。
由于因子Ⅷ的不穩(wěn)定性質(zhì)，工程宿主細(xì)胞產(chǎn)率在無蛋白條件下嚴(yán)重下降。人類血清蛋白常用作重組蛋白制備的無血清培養(yǎng)添加劑。人類血清蛋的具有多種功能，包括(1)作為脂肪酸、膽固醇和親脂維生素、類固醇激素及生長(zhǎng)因子的載體；(2)作為抵御剪切力損傷的保護(hù)劑；(3)作為pH變化的緩沖劑；及(4)作為滲透壓調(diào)節(jié)劑。血清蛋白另一至關(guān)重要的作用或許是通過用作蛋白酶的底物而保護(hù)不穩(wěn)定的蛋白如因子Ⅷ免受蛋白水解。
存在于血清制品中的不純物也可有利于清蛋白的穩(wěn)定效應(yīng)。已鑒定出因子如脂蛋白(Chan,1996)作為在無血清條件下用于制備重組因子Ⅷ的人類血清蛋白的替代品。
我們的開發(fā)人類血漿來源清蛋白的制備培養(yǎng)基的嘗試導(dǎo)致了本公開的發(fā)明，即用于重組因子Ⅷ制備的無蛋白基本培養(yǎng)基。優(yōu)選的培養(yǎng)基由修改的Dulbeceo’s基本培養(yǎng)基(Minimum Essential Medium)和補(bǔ)充以10μg/ml重組胰島素(Nucellin,Eli Lillg)及FeSO4·EDTA(50μM)的Ham’s F-12培養(yǎng)基所組成(50∶50重量比)。除了因子Ⅷ的制備以外，工程BHK細(xì)胞在此無蛋白基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。
令人驚奇的是，添加多元醇(polyol)如Pluronic F-68對(duì)生長(zhǎng)沒有影響但增強(qiáng)了BHK細(xì)胞因子Ⅷ的特異產(chǎn)率。令人神奇的是，添加硫酸銅進(jìn)一步增強(qiáng)了因子Ⅷ的產(chǎn)生。包括一組微量金屬如錳、鉬、硅、鋰、及鉻也導(dǎo)致因子Ⅷ產(chǎn)量的進(jìn)一步增加。然后開發(fā)出用于在無人類血漿來源蛋白條件下因子Ⅷ制備的連續(xù)方法。關(guān)于Pluronic多元醇(polyols)使用的進(jìn)一步信息可見于Papoutsakis(1997)及Schmolka(1977)。
Pluronic F-68，一種聚二醇(polyglycol),(BASF,Wyandot)常用于防止在攪拌的培養(yǎng)物中出現(xiàn)的泡沫形成，并用于保護(hù)細(xì)胞免受剪切力及少數(shù)培養(yǎng)物中水泡的損害。Pluronic F-68為非離子性的嵌段共聚物(blockcopolymer)，平均分子量為8400，在兩端由聚氧丙烯poly(oxypropylene)中心嵌段(20％重量)和聚氧乙烯poly(oxyethylene)嵌段所組成。對(duì)PluronicF-68作用的廣泛研究表明Pluronic F-68作為表面活性劑而起作用并通過讓細(xì)胞避開攪拌或混勻(sparging)過程中生物反應(yīng)器中形成的水泡而防止對(duì)細(xì)胞的損害。然而，多位研究者已注意到在剪切力最小培養(yǎng)條件下PluronicF-68對(duì)生長(zhǎng)的有利影響(Mizrahi,1975；Murhammer和Goochee,1990)。在產(chǎn)品純化過程中從Pluronic F-68對(duì)脂類的共純化提供奇特的證據(jù)，即Pluronic聚體不僅可替代清蛋白作為表面活性劑，而且還可作為脂類的載體而起作用。Pluronic F-68也可能通過直接插入到膜中而可在修復(fù)完成之前防止膜損害殺死細(xì)胞。Pluronic F-68在作為金屬離子緩沖劑而起作用過程中的作用完全未知。
盡管有培養(yǎng)基中的Pluronic F-68可增加容積產(chǎn)率的報(bào)導(dǎo)，其作用機(jī)制似乎是維持細(xì)胞生存力(Schneidet,1989；Qi,1996)。據(jù)我們所知，已見到Pluronic F-68增加特定蛋白產(chǎn)品特異性產(chǎn)量尚屬首次。由于在我們的系統(tǒng)中具有和不具有Pluronic F-68時(shí)生存力和生長(zhǎng)速率是相似的，所以在我們的系統(tǒng)中維持細(xì)胞生存力不會(huì)是Pluronic F-68的作用機(jī)制。然而，無論什么機(jī)制，Pluronic F-68添加的效應(yīng)是直接而巨大的。
預(yù)計(jì)其它多元醇(Polyols)系統(tǒng)將具有類似的效應(yīng)。這種其它多元醇(Polyols)包括具有約1000至約16,000分子量的非離子聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
除了常規(guī)的懸浮培養(yǎng)技術(shù)如搖瓶，旋轉(zhuǎn)瓶及滾動(dòng)瓶外，本發(fā)明方法也可用于灌流及分批生物反應(yīng)器。培養(yǎng)宿主細(xì)胞后，通過常規(guī)的方法如超濾或離心可從消耗的培養(yǎng)基中回收因子Ⅷ。如果需要，回收的因子Ⅷ可通過，例如，離子交換或大小排阻層析、免疫親和或金屬螯合層析加以純化。
如這里所使用的，“無人類或動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基”為無任何人類來源或動(dòng)物來源蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基。從人類或動(dòng)物來源分離的蛋白固有導(dǎo)入病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此無人類或動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基的目的是排除或至少大大降低病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。
實(shí)施例1以能夠指導(dǎo)因子Ⅷ表達(dá)的幼年倉(cāng)鼠腎(BHK-21)細(xì)胞獲自Genentech,Inc,South San Francisco，加利福利亞，美國(guó)。按Wood等(1984)詳述制備細(xì)胞系并保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心且得到許可號(hào)ATCC CRL-8544該細(xì)胞系的克隆變異體也獲自Genentech,Inc.，且用于所有實(shí)施例中。
用無血清的基本培養(yǎng)基將含有編碼因子Ⅷ基因的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)成搖瓶中的懸浮培養(yǎng)物，基本培養(yǎng)基中含有如下成分Ham’s F-12培養(yǎng)基和Dulbecco’s基本培養(yǎng)基(50∶50重量比)，Nucellin(重組胰島素，5-10ug/ml)，F(xiàn)eSO4·EDTA(50uM)及MgCl2(15mM)。維持細(xì)胞并以48小時(shí)的間隔進(jìn)行傳代。以800×g5分鐘旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以1×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度重新接種。每瓶中含有50-100ml新鮮培養(yǎng)基。將搖瓶置于旋轉(zhuǎn)器上，于37℃，卵育，并通過在90-1l0r.p.m之間輕旋轉(zhuǎn)維持為懸浮培養(yǎng)物。顯示于下表中如F-68(0.1％)的polyol及硫酸銅(50nm)對(duì)因子Ⅷ產(chǎn)生的效應(yīng)在搖瓶中加以檢測(cè)。因子Ⅷ通過生色分析加以定量。該分析作為稱作Coatest Ⅷ:C/4的測(cè)試試劑盒在商業(yè)上出售并且可從Baxter Health Care Products中獲得。通過該方法保持細(xì)胞24小時(shí)。以Coatest Ⅷ:C/4試劑盒測(cè)定的每種培養(yǎng)基中因子Ⅷ的活性顯示于表1中。
表1

>*36個(gè)樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。按上述監(jiān)測(cè)24天時(shí)期內(nèi)細(xì)胞的因子Ⅷ產(chǎn)量。
**效價(jià)實(shí)驗(yàn)顯示0.1％是Pluronic F-68的最佳劑量。增加其濃度至0.3％對(duì)因子Ⅷ的產(chǎn)量沒有顯著影響。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示50-800nM硫酸銅對(duì)因子Ⅷ產(chǎn)量是最適的。
如表1中所示，單獨(dú)添加Pluronic F-68或優(yōu)選與硫酸銅共同加入顯著地增強(qiáng)了在無蛋白條件下含有編碼因子Ⅷ基因的BHK細(xì)胞的效價(jià)及特異性產(chǎn)率。
實(shí)施例2為了進(jìn)一步優(yōu)化無蛋白條件下因子Ⅷ的制備，將微量金屬加入到無蛋白制備培養(yǎng)基中。然后按在實(shí)施例1中所述通過連續(xù)搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)分析16天因子Ⅷ的產(chǎn)量。數(shù)據(jù)顯示于表2中。無硫酸銅時(shí)，微量金屬對(duì)因子Ⅷ的產(chǎn)率沒有影響。見表2。
表2

>*金屬包括CuSO4·5H2O(50nM),MnSO4(3nM),Na2SiO3·9H2O(1.5uM),[NH4]Mo7O24·4H2O(3nM),CrK(SO4)2·4H2O(1.5nM)，及LiCl(236M)。
實(shí)施例3微量金屬及銅對(duì)因子Ⅷ產(chǎn)生的影響進(jìn)一步在灌流發(fā)酵罐中加以評(píng)估。用表1中所述的基本培養(yǎng)基以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將兩只1.5-升的發(fā)酵罐按種以BHK克隆變異體，發(fā)酵罐以0.5升/天的速率灌流。將一只發(fā)酵罐保留為對(duì)照且將另一只發(fā)酵罐按表2中所述補(bǔ)充銅和微量金屬。將發(fā)酵罐以～2-3×106個(gè)細(xì)胞/ml的平均細(xì)胞濃度維持15天。如表3中所示，PluronicF-68，銅及微量金屬的添加顯著地增強(qiáng)連續(xù)灌流條件下無蛋白時(shí)，帶有編碼的因子Ⅷ基因BHK細(xì)胞的特異性產(chǎn)率。該制備分法可容易地適應(yīng)于裝配有細(xì)胞維持裝置如沉淀器(cell retention devices such as settlers)的大型發(fā)酵罐(200至500升)。
表3

提供上述實(shí)施例作為說明本發(fā)明的手段而不構(gòu)成對(duì)權(quán)利要求中單獨(dú)定義發(fā)明的限制。參考文獻(xiàn)Bihoreau，N.，等.，歐洲生物化學(xué)雜志.222:41-48(1994)Chan,S.Y.，美國(guó)專利.No.5,576,194(1996)Eis-Hubinger,A.M.，等.，Thromb.Haemost.76:1120(1996)Mizrahi,A.，臨床微生物學(xué)雜志.11-13(19975)Murhammer,D.W.，等.生物技術(shù)進(jìn)度.6:142-148(1990)Papoutsakis,E.T.，生物技術(shù)趨勢(shì)(Tibtech)9:316-324(1991)Qi,Y-M.等.，細(xì)胞技術(shù)21:95-109(1996)Schmolka,1.R.，美國(guó)石油化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志.54:110-116Schneidet,Y-J.，免疫學(xué)方法雜志.116:65-77(1989)Wood.W.,等.，自然312:330-337(1984)Xu,D.，等.，中國(guó)生物技術(shù)雜志.11:101-107(1995)Zhang,J.，等.生物技術(shù)33:249-258(1994)
權(quán)利要求
1.一種從帶有重組因子Ⅷ基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備重組因子Ⅷ的方法，包括在補(bǔ)充以多元醇的無人類或動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的培養(yǎng)基包括銅離子。
3.權(quán)利要求1的方法。其中的多元醇為Pluronic F-68并以約0.025至約0.2％重量的濃度范圍存在于培養(yǎng)基中。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的培養(yǎng)基包括約50至約800nM范圍的量的硫酸銅。
5.權(quán)利要求2的方法，其中的錳離子以約1.5至約4.5nM范圍的量存在。
6.權(quán)利要求2的方法，其中的包括鉬的離子以約1.5至約4.5nM范圍的量存在。
7.權(quán)利要求2的方法，其中的包括硅的離子以約75至約300nM范圍的量存在。
8.權(quán)利要求2的方法，其中的鉻離子以約1.0至約4.0nM范圍的量存在。
9.權(quán)利要求2的方法，其中的鋰離子以約120至約480nM范圍的量存在。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞選自幼年倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、人類胚胎腎細(xì)胞及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1方法制備的重組因子Ⅷ產(chǎn)品，其中的產(chǎn)品無人類或動(dòng)物蛋白。
12.用于制備重組因子Ⅷ的無人類或動(dòng)物蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中包括含有多元醇的基本培養(yǎng)基。
13.包括銅離子的權(quán)利要求12的培養(yǎng)基。
14.權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中包括至少一種選自錳、鉬、硅、鉻及鋰的微量金屬。
15.包括胰島素的權(quán)利要求14的培養(yǎng)基。
全文摘要
在無任何動(dòng)物來源蛋白如清蛋白存在時(shí)通過在補(bǔ)充以多元醇共聚物,優(yōu)選在微量金屬如銅存在下的無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞可連續(xù)地從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備相對(duì)大量的重組因子Ⅷ。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,培養(yǎng)基包括稱為Pluronic F－68的多元醇、硫酸銅、硫酸亞鐵/EDTA復(fù)合物及微量金屬如錳、鉬、硅、鋰和鉻的鹽。
文檔編號(hào)C12R1/91GK1210866SQ9811497
公開日1999年3月17日 申請(qǐng)日期1998年4月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月18日
發(fā)明者陳深源, K·哈里斯 申請(qǐng)人:美國(guó)拜爾公司