本發(fā)明屬于新基因的制備，特別是指抗蚜蟲基因ppa-7、制備、編碼的蛋白及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蟲害是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因之一，全球每年因管理和利用化學殺蟲劑防治費用高達100億美元。即使如此，每年蟲害導致?lián)p失占農(nóng)作物總產(chǎn)量的20％－30％。與化學藥劑相比，利用抗蟲基因資源開展作物抗蟲遺傳育種是最經(jīng)濟有效和安全的措施，但是傳統(tǒng)育種方法培育抗蟲品種技術(shù)難度大、周期長，很難獲得突破性的進展。轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的出現(xiàn)為防治植物病蟲害開拓了新的思路，利用bt抗蟲轉(zhuǎn)基因的植物取得了顯著的成果，但是使用bt基因抗源單一，且這類基因不能有效防治某些刺吸式害蟲如蚜蟲等害蟲，尤其是這些重要的農(nóng)業(yè)昆蟲還是植物病毒的傳播介體，因此篩選新的抗蟲基因尤其是抗蚜蟲的基因具有重要的意義。目前已開發(fā)的眾多抗蟲基因資源中，唯有植物凝集素能有效控制同翅目害蟲。植物凝集素是一類能可逆和糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，可凝集人和動物的紅細胞，具有多種活性功能，如抗蟲、抗病毒、抗真菌等，但其最重要的功能還是體現(xiàn)為對同翅目害蟲的抗性。植物凝集素是目前所知的唯一可以識別并結(jié)合昆蟲腸胃及真菌、細菌等微生物表面的糖綴合物的植物蛋白，在植物中廣泛存在，按氨基酸序列同源性和進化相關(guān)性分類為7個不同的植物凝集素家族，主要有豆科凝集素、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、2型核糖體失活蛋白、木菠蘿(jacalin)家族、葫蘆科韌皮部凝集素、莧科凝集素等。人工飼喂試驗及轉(zhuǎn)凝集素基因植株的抗蟲分析均表明，植物凝集素能顯著抑制多種同翅目害蟲(如蚜蟲、褐飛虱等)的生存和繁殖。研究表明植物凝集素的抗蟲活性與其特異性結(jié)合糖類的能力有關(guān)，能與同翅目昆蟲消化道上皮細胞的糖蛋白結(jié)合，降低了昆蟲消化道膜的通透性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收。此外凝集素還能在昆蟲消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促使消化道內(nèi)細菌繁殖，使昆蟲感病、拒食，生長發(fā)育受抑制甚至死亡。1998年keyanzhu-salzman使用定點突變技術(shù)，使豆科凝集素gsⅱ喪失了糖結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)該凝集素同時也喪失了抗蟲活性。由此可見，凝集素的抗蟲活性與其能與糖類可逆性結(jié)合的能力密切相關(guān)。大多數(shù)凝集素的特異結(jié)合活性通常不是針對植物細胞內(nèi)的糖分子，而常常是微生物或害蟲的內(nèi)表面的寡糖，在結(jié)合糖的過程中植物凝集素表面局部結(jié)構(gòu)的構(gòu)象會有所變化，這種變化有利于識別不同的糖而結(jié)合不同的外來糖綴合物，發(fā)揮其防御功能。目前成功用于植物抗病蟲基因工程的植物凝集素主要有菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin,pha)、豌豆外源凝集素(pealectin，p-lec)、雪花蓮凝集素基因(galanthusnivalisagglutinin,gna)、麥胚凝集素(wheatgermagglutinin,wga)等。研究最多、應(yīng)用最廣、抗蟲活性較好的為單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素雪花蓮凝集素(galanthusnivalisagglutinin，gna)。天南星科半夏屬的掌葉半夏(pinelliapedatisectaagglutinin,ppa)為我國特有的中草藥，黃大昉等以蟲齡24-48h的桃蚜若蚜作生物測定，當人工飼喂中掌葉半夏凝集素ppa含量為0.15％時，處理后兩天桃蚜的死亡率達50％左右，此外用麥蚜作試驗也得到了類似的結(jié)果。半夏凝集素(pinelliaternataagglutinin,pta)粗提液對棉蚜有強致死作用，當粗提液：飼料為1：1時，48h死亡率為40％，84h死亡率可達70％，且使成蚜繁殖力降低，以pta0.2％(w/v)劑量飼喂棉蚜，處理后5天成蚜死亡率可達80％－90％，暗示半夏屬植物凝集素具有致死效應(yīng)，半夏屬凝集素能凝集羊、豬、狗、貓、鼠等的血紅細胞，而且和生長旺盛的肝癌細胞集合，并使其凝集，顯示其在醫(yī)學治療方面的應(yīng)用前景，是一種對人無毒害作用的凝集素，因此排除了其轉(zhuǎn)基因后對人安全性的影響，因此天南星科植物凝集素基因是gna基因的可替代的有重要應(yīng)用價值的抗蟲基因,研究表明天南星科凝集素如異葉天南星凝集素、半夏凝集素、虎掌凝集素、花南星凝集素等的同源性很高，可達79-80％，具有3個保守甘露糖結(jié)合位點(qdny)。張宏宇等將該基因轉(zhuǎn)入煙草和水稻中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入的pta基因?qū)ρ料x和水稻褐飛虱的存活率和發(fā)育進度均有明顯的抑制作用，表現(xiàn)了明顯的抗蟲作用，2005年江蘇農(nóng)科院轉(zhuǎn)pta基因的棉花大田試驗表明對棉蚜表現(xiàn)高抗水平，選育出蘇棉8號、新路中t等抗棉蚜的新品系,顯示了半夏屬植物在抗蟲基因工程研究中的潛力。到目前為止，雖然已發(fā)現(xiàn)了眾多有抗蟲活性的凝集素基因，然而對蚜蟲等同翅目昆蟲的抗性仍不盡如人意。盡管凝集素對蚜蟲等同翅目害蟲有抑制作用，但是現(xiàn)有的凝集素僅能在一定程度上抑制害蟲的發(fā)育，并不能完全抑制其發(fā)育和繁殖，害蟲在轉(zhuǎn)凝集素的植株上仍能以較低速度進行繁殖，因此，如何進一步提高凝集素的抗蟲活性成為擺在人們面前的嚴峻事實。要解決這一問題，一方面有必要深入研究凝集素的作用機制,從而制訂相應(yīng)策略提高抗蟲效果；另一方面應(yīng)著手新的抗蟲基因的發(fā)掘，為獲得高抗甚至具有致死效應(yīng)的凝集素基因用于抗蟲基因工程研究中。申請人在專利號為200910073815.1的發(fā)明專利中公開了一個對蚜蟲有良好的抗性的ppa基因，ppa基因有2個保守的甘露糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其序列全長為777bp。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種抗蚜蟲基因ppa-7。本發(fā)明的第二個目的在于提供抗蚜蟲基因ppa-7的制備方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供利用抗蚜蟲基因ppa-7編碼的蛋白。本發(fā)明的第四個目的是提供抗蚜蟲基因ppa-7在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：抗蚜蟲基因ppa-7，其序列如下：atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggccttgtcattcctcggtcagctgccgcagtgggcaccaactatatgctgtccggcgaaaccctagacacgaacggccatctcaggaacggcgacttcgacttggtcatgcaggatgactgcaacgccgtcctgtacaacggcaactggcagtccaacacagccaacaaaggacgggactgcaagctcaccctcaccgaccgcggcgaactcatcatcgacagcggcgagggatccaccgtctggaggagcggctcccagtccgagagagacggcttcggcgtcatctacggccctgccatttgggcgaccagctcgaagcgctccattgctgcggagtag。抗蚜蟲基因ppa-7的制備，以掌葉半夏塊莖中的rna反轉(zhuǎn)錄所合成的cdna為模板,以5'-atggcctccaagctcctcctct-3'為5’端上游引物ppaf，以5'-ctactccgcagcaatggagcgc-3'為3’端下游引物ppar，采用pcr擴增方法獲得。利用抗蚜蟲基因ppa-7編碼的蛋白，其序列如下：metalaserlysleuleuleupheleuleuproalaileleuglyleuvalileproargseralaalaalavalglythrasntyrmetleuserglygluthrleuaspthrasnglyhisleuargasnglyasppheaspleuvalmetglnaspaspcysasnalavalleutyrasnglyasntrpglnserasnthralaasnlysglyargaspcyslysleuthrleuthraspargglygluleuileileaspserglygluglyserthrvaltrpargserglyserglnsergluargaspglypheglyvaliletyrglyproalailetrpalathrserserlysargserilealaalaglu。抗蚜蟲基因ppa-7在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。本發(fā)明的制備方法中的具體工藝過程及反應(yīng)條件還有：所述的制備方法包括如下工藝步驟：a、pcr反應(yīng)模板的制備；b、引物的制備；c、基因ppa7全序列的擴增和克隆。所述的步驟a是選取新鮮的掌葉半夏塊莖，洗凈后陰干，然后在液氮中研磨成粉末狀，提取的rna置于預(yù)先凍存在冰上無rnase的離心管中，反轉(zhuǎn)錄合成cdna用于pcr反應(yīng)的模板，采用clontech公司的cdna合成試劑盒進行cdna合成。反轉(zhuǎn)錄的過程包括如下步驟：a、向rnase-free離心管中加入rna2μg，濃度為0.5μg/μl的oligodt182μl，depc-h2o7.75μl,在溫度70℃的條件下反應(yīng)5分鐘，迅速冰??；b、向步驟a的溶液中加入以下反應(yīng)液后制成混合液將上述混合液在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30秒，42℃的條件下于pcr儀中反應(yīng)1小時；c、混合液在72℃的條件下反應(yīng)10分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，混合液的體積為20μl，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-70℃凍存。所述的步驟c是以ppar引物為互補引物，按照clontech公司的cdna合成試劑盒合成cdna第一鏈后進行pcr擴增，反應(yīng)條件是：94℃、3min，94℃、30s，57℃、30s，72℃、1min，35個循環(huán)；72℃、10min，pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳觀察結(jié)果，pcr產(chǎn)物按照常規(guī)方法克隆到質(zhì)粒pgem-t載體上，隨機挑取3個克隆進行測序，獲得全長的ppa-7基因序列。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所具有的實質(zhì)性特點和顯著技術(shù)進步在于：1、通過以掌葉半夏塊莖為材料提取總rna，采用rt-pcr技術(shù)結(jié)合獲得了一個全長的掌葉半夏甘露糖凝集素ppa-7基因序列，與之前的報道的掌葉半夏專利基因ppa相比，序列長度只有384bp，基因更小，證明該基因是一個新的單子葉甘露糖凝集素基因。2、對ppa-7基因與ppa專利基因的結(jié)構(gòu)域進行比較分析表明，ppa-7基因只有一個保守的甘露糖結(jié)構(gòu)域，而ppa基因有2個結(jié)構(gòu)域，說明ppa-7基因和ppa專利基因是不同類型的凝集素家族成員。3、對ppa-7基因進行功能驗證結(jié)果表明，ppa-7轉(zhuǎn)基因煙草接種蚜蟲后表明，ppa-7基因不僅表現(xiàn)了良好的抑制效果，同時具有殺死蚜蟲的效應(yīng)，植株接種后5天后蚜蟲全部死亡，而ppa轉(zhuǎn)基因植株接種蚜蟲7天后蚜蟲全部死亡，對比結(jié)果說明ppa-7殺死蚜蟲的時間更短。4、本發(fā)明與ppa專利基因相比，具有殺蟲周期短、蚜蟲致死效果強的作用，這在轉(zhuǎn)基因作物上應(yīng)用更為簡單、經(jīng)濟和有效，可以避免基因長度太長引起的能量消耗，因此ppa-7基因與ppa基因相比更適合用于轉(zhuǎn)基因作物的抗蚜蟲改良。附圖說明圖1是ppa7基因全長檢測結(jié)果。圖1表明擴增出現(xiàn)一條384bp的特異帶，含有全長的ppa-7基因片段，marker分子量標準為2000，1000，750，500，250，100bp；ck為空白對照，1，2，3為ppa7基因在掌葉半夏的3個塊莖樣本中rt-pcr的產(chǎn)物，大小在250至500bp之間。圖2是ppa-7基因序列及利用其編碼的蛋白序列表。圖3是不同植物凝集素基因氨基酸序列同源性比較結(jié)果。圖3結(jié)合表一表明：ppa-7基因在氨基酸序列上與天南星科已經(jīng)報道的基因不同，與ppa專利基因比較分析表明：ppa-7是一個新的凝集素基因。注：國際基因庫上的單子葉甘露糖基因及其登錄號:國際基因庫上的單子葉甘露糖基因及其登錄號：aha：ay338965；ala為華南星(alobatum)：ay557617；ama：海芋(alocasiamacrorrhizos)：dq340864；aurm為斑葉疆南星(arummaculatum)：u12198；cea為芋頭(colocasiaesculenta)：jx435122；pca為滴水珠(pinelliacordata)：kf154980；ppa為掌葉半夏(pinelliapedatisecta)；hm593586；pta為三葉半夏(pinelliaternata)：ay191305；gna為雪花蓮(galanthusnivalis)：m55556。圖4是ppa-7基因與ppa基因的結(jié)構(gòu)比較分析圖。采用ncbi在線blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)分析本發(fā)明中的基因ppa-7和專利基因ppa的結(jié)構(gòu)域。從圖4a中可以看出，ppa-7基因的只有1個保守結(jié)構(gòu)域，從圖4b中可以看出，ppa專利基因的含2個保守結(jié)構(gòu)域。圖5是ppa-7基因植物表達載體的構(gòu)建示意圖。從圖5中可以看出，pbi121-ppa-7質(zhì)粒酶切結(jié)果表明：ppa-7基因已經(jīng)插入到植物表達載體pbi121中，m為dna分子量標準，1為pbi121-ppa-7質(zhì)粒酶切的結(jié)果，2為未酶切的質(zhì)粒pbi121-ppa-7。圖6是不同ppa-7煙草轉(zhuǎn)基因植株westernblot檢測結(jié)果。圖6表明，ppa-7基因在煙草基因組織中表達水平不一樣。圖7是ppa-7基因與專利基因ppa轉(zhuǎn)基因功能驗證。圖7結(jié)合表二中的結(jié)果表明：ppa-7的轉(zhuǎn)基因煙草植株接種蚜蟲5天后蚜蟲全部死亡(圖7a)，ppa基因接種蚜蟲7天后蚜蟲全部死亡(圖7b)。具體實施方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例作進一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定。本發(fā)明的保護范圍一權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準，任何依據(jù)本發(fā)明的說明書所作出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護范圍。本實施例中的抗蚜蟲基因ppa7序列以及編碼的蛋白序列如前述，其具體制備及抗蚜蟲功能鑒定包括：所述的制備方法包括如下工藝步驟：a、pcr反應(yīng)模板的制備；b、引物的制備；c、基因ppa7全序列的擴增和克隆。所述的步驟a是選取新鮮的掌葉半夏塊莖，洗凈后陰干，然后在液氮中研磨成粉末狀，提取的rna置于預(yù)先凍存在冰上無rnase的離心管中，反轉(zhuǎn)錄合成cdna用于pcr反應(yīng)的模板，采用clontech公司的cdna合成試劑盒進行cdna合成。反轉(zhuǎn)錄的過程包括如下步驟：a、向rnase-free離心管中加入rna2μg，濃度為0.5μg/μl的oligodt182μl，depc-h2o7.75μl,在溫度70℃的條件下反應(yīng)5分鐘，迅速冰浴；b、向步驟a的溶液中加入以下反應(yīng)液后制成混合液將上述混合液在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30秒，42℃的條件下于pcr儀中反應(yīng)1小時；c、混合液在72℃的條件下反應(yīng)10分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，混合液的體積為20μl，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-70℃凍存。所述的步驟c是以ppar引物為互補引物，按照clontech公司的cdna合成試劑盒說明書合成cdna第一鏈后進行pcr擴增，反應(yīng)條件是：94℃、3min，94℃、30s，57℃、30s，72℃、1min，35個循環(huán)；72℃、10min，pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳觀察結(jié)果，pcr產(chǎn)物按照常規(guī)方法克隆到質(zhì)粒pgem-t載體上，隨機挑取3個克隆進行測序，獲得全長的ppa-7基因序列。申請人對ppa-7基因功能進行了如下驗證：1、ppa7基因植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化通過雙酶切方法將ppa-7基因亞克隆到植物載體pbi121的相應(yīng)位點上，構(gòu)建成35s：ppa+gus:nos結(jié)構(gòu)的植物表達載體，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株eha105中。采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草獲得抗卡那霉素(nptii)標記的轉(zhuǎn)化再生植株(王關(guān)林等，2002)。2、轉(zhuǎn)基因植株westerblot檢測取少量新鮮轉(zhuǎn)基因煙草葉片，將葉片放入研體中加入液氮充分研碎；選取一干凈離也心管加入100mg左右研碎后的樣品；向離心管中加入兩倍樣品質(zhì)量體積的sdsloadingbuffer，放入65℃金屬浴中保溫1h；保溫完成后1200rpm離心15min，吸取上層液體進行聚丙痛斯胺凝膠電泳。westerblot采用王關(guān)林等的辦法(王關(guān)林等，2002)，其中抗體為gus基因的抗體。根據(jù)ppa目的蛋白串聯(lián)的gus蛋白，其中一抗為gus單克隆抗體(anti-gus購自北京華大蛋白公司)，二抗為偶聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗鼠抗體。對照為actin蛋白。3、轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜蟲鑒定將通過westernblot鑒定表達ppa-7最高的轉(zhuǎn)基因植株進行抗蚜蟲接種鑒定，和專利基因ppa抗蚜蟲效果最好的轉(zhuǎn)基因煙草同時進行鑒定，比較兩者的抗性差異。桃蚜(myzuspersicae)采自河北省農(nóng)林科學院植保所溫室內(nèi)煙草上自然發(fā)生的種群，于溫室內(nèi)飼養(yǎng)穩(wěn)定一段時間后，選取健康活潑、生理狀態(tài)一致的無翅成蚜供試。將室內(nèi)飼養(yǎng)的桃蚜分別接種到8～10葉齡的轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株中層葉片上，每處理3株煙苗，每株苗接無翅成蚜20頭，置于同一條件下(23-25℃)飼養(yǎng)，隔日調(diào)查記載各處理煙草幼苗上蚜蟲數(shù)量，直至15天。按照袁正強等的方法以轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲的種群抑制率作為指標(袁正強等,2001)，來評價各轉(zhuǎn)基因煙草對蚜蟲的毒力效果：種群抑制率(％)＝(對照株活蚜數(shù)-處理區(qū)活蚜數(shù))/對照株活蚜數(shù)×100。表一名稱ahaalaamaarumceagnapcappa專利ptaaha100.0ala84.0100.0ama79.283.9100.0arum70.871.968.6100.0cea77.378.878.269.0100.0gna35.734.635.334.434.0100.0pca86.484.878.870.377.333.1100.0ppa專利96.185.680.471.278.034.488.3100.0pta84.481.279.571.477.337.782.085.2100ppa-784.986.484.166.976.236.486.585.785.0表二sequencelisting<110>河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所<120>抗蚜蟲基因ppa-7、制備、編碼的蛋白及應(yīng)用<130>200910073815.1<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>384<212>dna<213>anartificialsequence<400>1atggcctccaagctcctcctcttcctcctcccggccatcctcggccttgtcattcctcgg60tcagctgccgcagtgggcaccaactatatgctgtccggcgaaaccctagacacgaacggc120catctcaggaacggcgacttcgacttggtcatgcaggatgactgcaacgccgtcctgtac180aacggcaactggcagtccaacacagccaacaaaggacgggactgcaagctcaccctcacc240gaccgcggcgaactcatcatcgacagcggcgagggatccaccgtctggaggagcggctcc300cagtccgagagagacggcttcggcgtcatctacggccctgccatttgggcgaccagctcg360aagcgctccattgctgcggagtag384<210>2<211>127<212>prt<213>anartificialsequence<400>2metalaserlysleuleuleupheleuleuproalaileleuglyleu151015valileproargseralaalaalavalglythrasntyrmetleuser202530glygluthrleuaspthrasnglyhisleuargasnglyasppheasp354045leuvalmetglnaspaspcysasnalavalleutyrasnglyasntrp505560glnserasnthralaasnlysglyargaspcyslysleuthrleuthr65707580aspargglygluleuileileaspserglygluglyserthrvaltrp859095argserglyserglnsergluargaspglypheglyvaliletyrgly100105110proalailetrpalathrserserlysargserilealaalaglu115120125當前第1頁12