本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種片段法合成西曲瑞克的方法。

背景研究

西曲瑞克，英文商品名又為cetrorelix，是一種直鏈線性十肽，其分子結(jié)構(gòu)式如下：

氨基酸序列如下：

ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-nh2

分子式：c70h92n17o14cl

分子量：1431.04

cas：120287-85-6

西曲瑞克(cetrorelix)，又名醋酸西曲瑞克，早在1999年8月瑞士ares-serono公司便完成了西曲瑞克在德國的首次上市。其作為是一種黃體酮釋放激素抑制素(lh-rh)受體阻斷劑，其能夠有效控制卵巢所受到的刺激，阻止不成熟卵泡提前排除，從而有助于受孕。

西曲瑞克作為一種腫瘤治療藥物，具有抵抗促性腺激素釋放激素(gnrh)的作用，能有效的抑制垂體分泌卵泡刺激素(fsh)及黃體生成素(lh)，從而能有效的抑制腫瘤的生長或者有效的預(yù)防、緩解及治療其他疾病，特別對于前列腺癌、子宮纖維癌以及卵巢癌等相關(guān)癌癥，并且西曲瑞克可以與癌細(xì)胞膜的lhrh受體相結(jié)合，從而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及增殖。此外，西曲瑞克能夠有效的誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。并且相關(guān)研究證實(shí)西曲瑞克還對于子宮內(nèi)膜異位、卵巢過度刺激綜合征以及良性前列腺肥大等疾病具有較好的預(yù)防、改善及治療效果。

西曲瑞克的合成基本分為固相合成及液相合成兩種，由于西曲瑞克中含有例如d-2-nal、d-phe(4cl)、d-3pal以及d-cit四種特殊氨基酸，液相縮合非常困難，其中d-2-nal、d-phe(4cl)與d-3pal相連，縮合難度更大，且每一步純化困難，因此不適合采用液相合成方法。

固相合成通常采用boc法和fmoc法。專利cn101863960a采用boc保護(hù)固相合成法，雖然有效避免了hf的使用；但是采用體積比為1～1.6:1的tfa/dcm溶液脫保護(hù)時(shí)，會(huì)造成樹脂上的肽被切除，降低粗肽收率；通過h2與pd進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)24h，反應(yīng)時(shí)間長，粗肽收率僅為60～70％，而h2使用較為危險(xiǎn)，pd金屬除盡難度大，對設(shè)備要求高。

專利cn101284863a采用fmoc保護(hù)固相合成法，雖然采用最小保護(hù)原則，但是最后脫保護(hù)，對整條鏈段進(jìn)行乙?；瑢?dǎo)致d-cit的側(cè)鏈脲基發(fā)生乙?；瑥亩a(chǎn)生毒性[d-cit(ac)]-西曲瑞克工藝雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如下：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-tyr-d-cit(ac)-leu-arg-pro-d-ala-nh2；這將嚴(yán)重影響西曲瑞克的使用安全，因此不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)；并且偶聯(lián)反應(yīng)溫度在30-50攝氏度，很容易產(chǎn)生消旋肽雜質(zhì)，從而影響最終產(chǎn)品的光學(xué)純度。

專利cn104086632a公開了一種使用fmoc-d-orn(dde)-oh代替?zhèn)然鶡o保護(hù)的fmoc-cit-oh的固相合成法,雖然此合成方法可以控制毒性[d-cit(ac)]-西曲瑞克雜質(zhì)含量在0.1％以下，但是合成過程中采用毒性水合肼試劑脫除dde保護(hù)，并且fmoc-d-orn(dde)-oh價(jià)格昂貴，且工藝復(fù)雜。

專利cn104892732a固相合成中其末端氨基酸偶聯(lián)時(shí)采取ac-d-2nal-oh，酸解切割肽樹脂后使用乙醚進(jìn)行沉淀，雖然其有效的避免了[d-cit(ac)]-西曲瑞克毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生，但是合成中其采用fmoc-d-cit-oh作為原料,側(cè)鏈未保護(hù)，后續(xù)反應(yīng)操作步驟多，易發(fā)生副反應(yīng)，引起收率低，純度不高，純化難度大。

上述專利技術(shù)方案的固相合成中使用氨水、h2、pd或者水合肼等危險(xiǎn)有毒試劑，所用保護(hù)氨基酸原料較為昂貴，成本高，合成工藝繁瑣，不能完全的避免[d-cit(ac)]-西曲瑞克毒性雜質(zhì)的生成，粗肽的產(chǎn)率及純度較低，為純化帶來較大困難，不利于醋酸西曲瑞克進(jìn)行規(guī)模放大生產(chǎn)。因此，本發(fā)明人對西曲瑞克的合成方法進(jìn)行了研究，從而得到本發(fā)明的技術(shù)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述指出的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種片段法合成西曲瑞克的方法，方案如下：

一種片段法合成西曲瑞克的方法，該方法具體步驟如下：

1)固相合成片段a肽樹脂:ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂；

2)固相合成片段b肽樹脂：h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂；

3)裂解片段a肽樹脂得肽片段a：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh；

4)裂解片段b肽樹脂得片段b：h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2；

5)在縮合劑存在下，片段肽a和片段肽b縮合得到西曲瑞克全保護(hù)肽：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2；

6)西曲瑞克全保護(hù)肽經(jīng)裂解試劑脫保護(hù)、制備色譜純化及轉(zhuǎn)鹽、凍干后，得到西曲瑞克精肽。

其中以上技術(shù)方案步驟1)中，固相合成肽片段a采用ctc樹脂為固相載體，與fmoc-tyr(tbu)–oh發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)得到fmoc-tyr(tbu)-ctc樹脂；然后脫fmoc保護(hù)后，以2-4倍摩爾量的投料比依次偶聯(lián)相應(yīng)的fmoc保護(hù)氨基酸，每一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)均在縮合劑存在條件下進(jìn)行，每一步偶聯(lián)過程中均以kaisertest試劑檢測反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行洗滌，然后采用脫保護(hù)試劑脫fmoc保護(hù)后，再與下一個(gè)fmoc保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；依次分別偶聯(lián)fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh、fmoc-d-2nal-oh，從而得到fmoc-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂；再進(jìn)行脫fmoc保護(hù)加入乙酰化試劑進(jìn)行乙?；舛?，從而得到肽樹脂片段ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂。

上述步驟1)中制備的fmoc-tyr(tbu)-ctc樹脂替代度為0.3-1.2mmol/g，優(yōu)選0.6-1.0mmol/g；脫fmoc保護(hù)試劑優(yōu)選為20％哌啶/dmf(體積百分比)；乙?；噭┙M合可為乙酸酐/吡啶/dcm或者乙酸酐/diea/dcm；偶聯(lián)反應(yīng)中選用的縮合劑可為以下組合dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/diea、hatu/hoat/diea的一種。

其中以上技術(shù)方案步驟2)中，固相合成肽片段b采用sieber樹脂為固相載體；sieber樹脂脫fmoc后，以2-5倍摩爾量的投料比依次偶聯(lián)相應(yīng)的fmoc保護(hù)氨基酸，每一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)均在縮合劑存在條件下進(jìn)行，每一步偶聯(lián)過程中均以kaisertest檢測反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)結(jié)束后洗滌，然后脫fmoc保護(hù)，再與下一個(gè)fmoc保護(hù)氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；依次分別偶聯(lián)fmoc-d-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-cit-oh，得到末端帶有fmoc保護(hù)的肽樹脂片段fmoc-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂，再脫處fmoc保護(hù)后得nh2-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂。更進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟2)中，sieber樹脂替代度為0.3-1.0mmol/g，優(yōu)選0.6-1.0mmol/g；脫fmoc試劑為15～25％(體積含量)哌啶/dmf溶液；偶聯(lián)反應(yīng)中選用的縮合劑可為以下組合dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/diea、hatu/hoat/diea的一種。

其中以上技術(shù)方案步驟3)和步驟4)中，裂解試劑為tfe/dcm、tfa/dcm、acoh/tfe/dcm、hfip/dcm組合中的一種。

其中以上技術(shù)方案步驟5)中，肽片段a和肽片段b進(jìn)行液相片段縮合，偶聯(lián)試劑組合可選取dic/hobt、dic/hoat、tbtu/hobt/diea、hatu/hoat/diea、pyaop/hoat、pyaop/hoat/diea或者pybop/hobt/diea中的一種。

其中以上技術(shù)方案步驟6)中，裂解試劑為加入體積比1-5％清除劑的tfa溶液，清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巰基乙醇、苯酚、水中的一種或幾種。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明采用片段法5+5合成西曲瑞克，其中兩個(gè)片段可以同時(shí)合成，縮短了合成周期；有效的避免了[d-cit(ac)]-西曲瑞克毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生；西曲瑞克粗肽純度超過96％，產(chǎn)率在90％以上；純化后精肽收率在71％以上，純度在99.80％以上；降低了純化難度，操作簡便，有利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式：

下面用具體實(shí)施案例對本發(fā)明相關(guān)操作進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限定本專利；根據(jù)本發(fā)明改變原料投料比、反應(yīng)溶劑或縮合劑等，均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。

權(quán)利要求書與說明書中所提原料與試劑縮寫含義：

fmoc：9-芴甲氧羰基

tbu：叔丁基

pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰

ac：乙酰基

boc：叔丁氧羰基

d-ala：d-丙氨酸

pro：脯氨酸

arg：精氨酸

leu：亮氨酸

d-cit：d-瓜氨酸

tyr：酪氨酸

ser：絲氨酸

d-3-pal：d-3-吡啶基丙氨酸

d-phe(4-cl)：d-4-氯-苯丙氨酸

d-2-nal：d-2-萘基丙氨酸

d-orn：d-鳥氨酸

dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己基亞甲基)-3-甲基丁基

hatu：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯

hoat：n-羥基-7-偶氮苯并三氮唑

hbtu：苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯

hobt：1-羥基苯并三唑

dmap：4-二甲氨基吡啶

pyaop：(3h-1,2,3-三苯并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基膦六氟磷酸鹽

pybop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

dic：n,n’-二異丙基碳二亞胺

diea：n,n’-二異丙基乙胺

dmf：n,n-二甲基甲酰胺

dcm：二氯甲烷

kaisertest檢測試劑為：茚三酮

tfa:三氟乙酸

tfe:三氟乙醇

實(shí)施例1：fmoc-tyr(tbu)-ctcresins的合成

準(zhǔn)確稱取ctc樹脂20.0g(sub＝1.0mmol/g)放入多肽合成柱中，分別用200mldmf洗滌兩次，加入160mldcm溶脹樹脂30min，抽掉dcm后，用200mldmf洗滌兩次，后加入fmoc-tyr(tbu)-oh/dcm/diea的混合溶液[準(zhǔn)確稱取fmoc-tyr(tbu)-oh18.38g(40mmol，2eq)加入至100ml錐形瓶中，加入80mldcm溶解，冰水浴15分鐘，加入26.44mldiea(160mmol,8.0eq)冰水浴活化4分鐘]，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)1小時(shí)。偶聯(lián)結(jié)束后，加入dcm/ch3oh/dipea(體積比17：2：1)混合溶液200ml封端3次，每次10min；抽干反應(yīng)液，分別用180mldmf洗滌樹脂6次，每次洗滌2～3分鐘。分別用dcm，甲醇各洗滌樹脂2次，每次2～3分鐘，真空干燥樹脂得26.44g，取少量樹脂，測替代度為0.653mmol/g。

實(shí)施例2：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂的合成

稱取實(shí)施例1中替代度為0.653mmol/gfmoc-tyr(tbu)-ctcresins26.04g(合成規(guī)模17.00mmol)置于多肽合成柱中，加入200mldcm溶脹樹脂30min，抽掉dcm，分別用160mldmf洗滌2次，每次2～3分鐘；分別用20％哌啶/dmf溶液200ml脫保護(hù)2次，每次脫保護(hù)10分鐘；然后分別用160mldmf洗滌樹脂6次，每次2～3分鐘；抽干dmf后加入fmoc-ser(tbu)-oh/hobt/dic的混合溶液[稱取fmoc-ser(tbu)-oh13.04g(34.00mmol,2eq)、hobt5.28g(39.10mmol,2.3eq)加入至100ml錐形瓶中，加入80mldmf溶解，冰水浴15分鐘，加入dic6.05ml(39.10mmol,2.3eq)冰水浴活化4分鐘]，n2攪拌反應(yīng)2.5小時(shí)，反應(yīng)終點(diǎn)采取kaiser試劑檢測，反應(yīng)結(jié)束抽掉反應(yīng)液；分別用160mldmf洗滌樹脂6次，每次洗滌2～3分鐘；隨后再依次進(jìn)行上述脫保護(hù)，洗滌，偶聯(lián)，洗滌操作，其中偶聯(lián)氨基酸依次為fmoc-d-3pal-oh、fmoc-d-phe(4cl)-oh、fmoc-d-2nal-oh。從而得到fmoc-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂，同樣反應(yīng)終點(diǎn)用kaiser試劑檢測。

得到的fmoc-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc樹脂后，分別用200ml20％哌啶/dmf試劑脫保護(hù)2次，每次10分鐘；然后依次用200mldmf、dcm各洗滌3次，每次2～3分鐘；加入乙酸酐、吡啶、dcm(1:0.85:2.15,v/v)的混合溶液160ml進(jìn)行乙?；舛耍?～25℃溫度下封端2.0小時(shí)。結(jié)束后用160mldmf洗滌樹脂6次，每次2～3分鐘；再分別用180mldcm和甲醇各洗滌收縮樹脂3次，每次進(jìn)行3分鐘，收縮完畢后于真空干燥箱干燥樹脂。肽樹脂稱重為36.24g，肽樹脂ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc增重率為98.86％。

實(shí)施例3：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh的合成

準(zhǔn)確稱取36.24g實(shí)施例2中的ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-ctc肽樹脂，加入至500ml三口圓底燒瓶中，然后配置裂解試劑，裂解試劑用量為360ml，裂解試劑配制為tfe:醋酸:dcm體積比為2:2:6，先混合均勻后，加入反應(yīng)瓶中，室溫裂解3.0小時(shí)；裂解完成后抽濾，樹脂用25ml裂解試劑洗滌樹脂2次，合并濾液，加入至4l冰甲叔醚中，沉降半小時(shí)后離心，并用甲叔醚洗滌6次，離心轉(zhuǎn)速3500r/min，時(shí)間3分鐘，真空干燥過夜，稱重肽片段ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh重量為15.76g，產(chǎn)率高達(dá)97.34％，純度99.14％。

實(shí)施例4：fmoc-d-ala-sieberresins的合成

準(zhǔn)確稱取sieber樹脂35.0g(sub＝0.60mmol/g)置于多肽合成柱中，分別用350mldmf洗滌兩次，然后加入350mldmf溶脹樹脂30min，抽掉dmf后，加入20％哌啶/dmf溶液260ml脫保護(hù)2次，每次10min，然后用300mldmf洗滌6次；抽掉dmf后加入fmoc-d-ala-oh/hobt/dic的混合溶液[準(zhǔn)確稱取fmoc-d-ala-oh13.08g(42mmol，2eq)；hobt6.53g(48.3mmol，2.3eq)加入至150ml錐形瓶中，加入130mldmf溶解，冰水浴15分鐘，加入7.47mldic(48.3mmol,2.3eq)冰水浴活化4分鐘]，將活化溶液加入多肽合成柱中，氮?dú)鈹嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，抽掉反應(yīng)液分別用300mldmf洗滌樹脂6次，后進(jìn)行封端處理，封端試劑為250ml(50ml乙酸酐、42.5ml吡啶和158mldmf)，封端反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后抽掉封端液，分別用300mldmf，dcm，甲醇各洗滌樹脂2次，每次2～3分鐘，真空干燥樹脂得40.5g，取少量樹脂，測替代度為0.475mmol/g。

實(shí)施例5：h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂的合成

稱取實(shí)施例4中替代度為0.475mmol/gfmoc-d-ala-sieber樹脂38.95g(合成規(guī)模18.50mmol)置于多肽合成柱中，加入380mldcm溶脹樹脂30min，抽掉dcm，用350mldmf洗滌2次，每次2～3分鐘；分別用20％哌啶/dmf溶液380ml脫保護(hù)2次，每次脫保護(hù)10分鐘；然后用350mldmf洗滌樹脂6次，每次2～3分鐘；抽干后加入fmoc-pro-oh/hobt/dic的混合溶液[稱取fmoc-pro-oh14.66g(37.0mmol,2eq)、hobt5.75g(42.55mmol,2.3eq)加入至200ml錐形瓶中，加入150mldmf溶解，冰水浴15分鐘，加入dic6.59ml(42.55mmol,2.3eq)冰水浴活化4分鐘]，n2攪拌偶聯(lián)反應(yīng)2.5小時(shí)，反應(yīng)終點(diǎn)采取kaiser試劑檢測，反應(yīng)結(jié)束抽掉反應(yīng)液；分別用350mldmf洗滌樹脂6次，每次洗滌2～3分鐘；隨后再依次進(jìn)行上述操作：脫保護(hù)，洗滌，偶聯(lián)，洗滌操作。其中，偶聯(lián)的fmoc保護(hù)氨基酸依次為fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-cit-oh。偶聯(lián)溫度均在20℃，同樣偶聯(lián)每個(gè)氨基酸反應(yīng)終點(diǎn)均采用kaisertest檢測，均在1小時(shí)左右完全反應(yīng)，從而得到fmoc-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂。然后分別用20％哌啶/dmf溶液380ml脫保護(hù)2次，每次脫保護(hù)10分鐘；然后分別用350mldmf洗滌樹脂3次，每次2～3分鐘，再分別用360mldcm和甲醇各洗滌收縮樹脂3次，每次進(jìn)行3分鐘，抽掉甲醇后于真空干燥箱干燥樹脂。肽樹脂稱重為48.93g，肽樹脂h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber增重率為98.86％。

實(shí)施例6：h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2的合成

準(zhǔn)確稱取48.93g實(shí)施例5中合成的肽樹脂h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-sieber樹脂，加入至1000ml三口圓底燒瓶中，然后配置裂解試劑，裂解試劑用量為500ml，裂解試劑配制為tfe:醋酸:dcm體積比為2:2:6，先混合均勻后，加入反應(yīng)瓶中，室溫裂解3.0小時(shí)；裂解完成后抽濾，樹脂用40ml裂解試劑洗滌樹脂2次，合并濾液，濃縮后加入至冰甲叔醚中，沉降半小時(shí)后離心，并用甲叔醚洗滌6次，離心轉(zhuǎn)速3500r/min，時(shí)間3分鐘，真空干燥過夜，稱重片段肽h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2重量為15.03g，產(chǎn)率高達(dá)94.12％，純度98.96％。

實(shí)施例7：ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2的合成

準(zhǔn)確稱取14.97g(16mmol)實(shí)施例3中合成的肽片段ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-oh加入三口圓底燒瓶中，加入140mldcm充分溶解同時(shí)加入20mldmf助溶，冰水浴條件下冷卻，再依次稱取9.18gpyaop、2.40ghoat以及8.27gdiea加入燒瓶中活化后，再加入事先用130mldcm及20mldmf溶解的13.82g(16mmol)實(shí)施例6中合成的h-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2肽片段，升至室溫反應(yīng)2小時(shí)，不斷進(jìn)行hplc檢測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸濃縮后加入甲叔醚析出固體，并用甲叔醚洗滌，所得固體再進(jìn)行重結(jié)晶得到全保護(hù)肽ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2稱重為27.23g，產(chǎn)率為95.50％,純度為97.69％。

實(shí)施例8：西曲瑞克粗肽ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-conh2的合成

將實(shí)施例7中得到的全保護(hù)肽ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-cit-leu-arg(pbf)-pro-d-ala-conh2(26.73g，15mmol)加入至500ml三口圓底燒瓶中，然后配置裂解試劑，裂解試劑用量為220ml，裂解試劑組分為tfa、tis、苯基甲基硫醚與h2o，其中各組分的體積比分別為90:2.5:2.5:5，先預(yù)凍裂解試劑2小時(shí)，后加入燒瓶中，冰浴半小時(shí)，后升溫室溫裂解2.0小時(shí)；裂解完成后抽濾，合并濾液，加入至冰甲叔醚中沉降半小時(shí)后離心，并用甲叔醚洗滌6次，離心轉(zhuǎn)速3500r/min，時(shí)間3分鐘，真空干燥過夜，得到西曲瑞克粗肽ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-conh2，重量為20.07g，產(chǎn)率93.05％，純度96.86％。

實(shí)施例9：西曲瑞克粗肽ac-d-2nal-d-phe(4cl)-d-3pal-ser-tyr-d-cit-leu-arg-pro-d-ala-conh2純化

將西曲瑞克粗肽溶于乙腈和水的混合溶液中，抽濾，濾液采用c18或者c8反相色譜柱子上樣純化，流動(dòng)相采用三氟乙酸鹽：乙腈(0.1-100:100-0.1，v/v),檢測波長為220nm，收集樣品峰并合并合格樣品后，進(jìn)行脫鹽，凍干，得到西曲瑞克精肽，純化后精肽收率71.86％，純度為99.86％。