本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一組具有廣譜抗菌活性的陽離子抗菌肽、肽衍生物、環(huán)肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自從青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素一直是人類治療病原微生物感染的有力武器，但隨著傳統(tǒng)抗生素的濫用，越來越多的病原菌開始對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性，所以急需尋找一類全新的抗菌藥物來替代抗生素進(jìn)行使用。天然抗菌肽是基因編碼或大分子蛋白水解產(chǎn)生的小分子多肽，一般是由12-50個(gè)氨基酸殘基組成的陽離子型(富含賴氨酸和精氨酸)多肽，是宿主對抗外來微生物的防御機(jī)制之一。傳統(tǒng)抗生素通過消除微生物生長或生存必不可少的條件，如使酶變性，來達(dá)到殺菌的目的，但細(xì)菌只要一種基因突變后就可以抵抗此類抗生素的攻擊?？咕牡淖饔冒悬c(diǎn)是細(xì)菌的細(xì)胞膜，通過中和電荷的方法與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，以此穿透殺死細(xì)菌，極大地減少了細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能。此外，抗菌肽還具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲及抗腫瘤等活性，具有較高的成藥價(jià)值。但天然的陽離子抗菌肽并非完美無缺，部分抗菌肽對真核生物有一定的毒性，對病原物高殺滅活性的同時(shí)往往伴隨著對真核生物的溶血作用，而且線性抗菌肽在體內(nèi)易被各類蛋白酶水解，半衰期短。因此如何提高其活性并最大程度延長半衰期、降低其毒性是目前抗菌肽藥物開發(fā)的難點(diǎn)和希望所在。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一組多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其序列通式為：r1-xaa1-xaa2-xaa3-xaa4-xaa5-xaa6-xaa7-xaa8-xaa9-xaa10-xaa11；其中r1為芴甲氧羰基、一氯乙酰基或缺失；xaa1為phe、d-phe、4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸或2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸、4,4-聯(lián)苯丙氨酸或一氯乙酰基；xaa2為lys或arg、4-三氟甲基苯丙氨酸；xaa3為arg、lys、d-lys或d-arg；xaa4為met、lys、ile或leu；xaa5為lys、d-lys、leu或d-leu；xaa6為lys或cys；xaa7為leu、lys、ile、d-leu或d-lys；xaa8為met、lys、ile或leu；xaa9為lys、arg、d-arg或d-lys；xaa10為lys或cys；xaa11為cys、phe、d-phe、4-碘苯丙氨酸、4-三氟甲基苯丙氨酸或4,4-聯(lián)苯丙氨酸。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽具有以下序列通式：r1-xaa1-lys-arg-leu-lys-xaa6-leu-leu-lys-lys-if；其中r1為一氯乙?；蛉笔В瑇aa1為4-碘苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸或2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸；xaa6為lys或cys，當(dāng)xaa6為cys時(shí)，cys和r1位的一氯乙酰基發(fā)生環(huán)化。在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽其氨基酸序列為：if-lys-arg-leu-lys-lys-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:1)；brf-lys-arg-leu-lys-lys-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:2)；5ff-lys-arg-leu-lys-lys-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:3)；環(huán)(caa-if-lys-arg-leu-lys-cys)-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:4)；環(huán)(caa-brf-lys-arg-leu-lys-cys)-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:5)；環(huán)(caa-5ff-lys-arg-leu-lys-cys)-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:6)。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽具有以下序列通式：caa-xaa1-lys-xaa3-leu-xaa5-cys-xaa7-leu-xaa9-lys-xaa11；其中xaa1為phe或d-phe，xaa3為arg或d-arg，xaa5為lys或d-lys，xaa7為leu或d-leu，xaa9為lys或d-lys，xaa11為phe或d-phe，上述序列中cys可以與一氯乙?；l(fā)生環(huán)化。在某些特定的實(shí)施方式中，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽其氨基酸序列為：caa-d-phe-lys-d-arg-leu-d-lys-cys-d-leu-leu-d-lys-lys-d-phe-nh2(seqidno:7)；caa-phe-lys-arg-leu-lys-cys-leu-leu-lys-lys-phe-nh2(seqidno:8)；環(huán)(caa-d-phe-lys-d-arg-leu-d-lys-cys)-d-leu-leu-d-lys-lys-d-phe-nh2(seqidno:9)；環(huán)(caa-phe-lys-arg-leu-lys-cys)-leu-leu-lys-lys-phe-nh2(seqidno:10)。作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選方案，上述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽中，具有以下序列：phe-lys-arg-met-lys-lys-leu-met-lys-lys-phe-nh2(seqidno:11)；fmoc-phe-lys-lys-lys-lys-lys-lys-lys-arg-lys-phe-nh2(seqidno:12)；d-phe-lys-d-lys-leu-d-leu-lys-d-lys-leu-d-arg-cys-d-phe-nh2(seqidno:13)；環(huán)(caa-phe-lys-lys-leu-leu-lys-lys-leu-arg-lys-cys)(seqidno:14)；環(huán)(caa-phe-lys-arg-ile-lys-lys-ile-ile-lys-lys-cys)(seqidno:15)；環(huán)(caa-fmf-lys-leu-lys-lys-leu-leu-lys-cys)-fmf-nh2(seqidno:16)；環(huán)(caa-dpf-arg-lys-leu-lys-lys-leu-leu-lys-cys)-dpf-nh2(seqidno:17)。本發(fā)明所涉及的氨基酸殘基包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本發(fā)明所涉及的天然氨基酸所對應(yīng)的三字母代碼表如表1所示，本發(fā)明說涉及的非天然氨基酸所對應(yīng)的代碼表及結(jié)構(gòu)如表2所示。本發(fā)明所涉及的所有氨基酸若不特別限定其結(jié)構(gòu)，代表l型氨基酸。本發(fā)明所涉及的多肽，既可以是線性肽，也可以是環(huán)肽。當(dāng)肽鏈中同時(shí)存在cys和一氯乙酰時(shí)，在堿性水溶液條件下，肽鏈可以發(fā)生分子內(nèi)取代反應(yīng)，脫去巰基上的氫和一氯乙酰氨基上的氯，形成硫醚鍵，使線性肽鏈環(huán)化。本發(fā)明所涉及的多肽為線性肽時(shí)，其c末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，優(yōu)選以酰胺的形式存在。表1天然氨基酸三字母代碼表表2非天然氨基酸和n末端基團(tuán)的代碼表及結(jié)構(gòu)本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的固相化學(xué)合成技術(shù)制備線性肽以及利用上述部分多肽在堿性水相中自身環(huán)化的特性制備環(huán)肽。固相化學(xué)合成技術(shù)的制備方法如下：(1)在樹脂上固相合成多肽；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物在三氟乙酸或氫氟酸中進(jìn)行裂解，優(yōu)選三氟乙酸；并加入側(cè)鏈保護(hù)基清除劑，然后用5-20倍體積的冰乙醚混合，離心，棄上清，沉淀多肽，再用冰乙醚反復(fù)洗滌沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽；(3)任選的，通過堿性水溶液處理步驟(2)的粗肽。條件是，當(dāng)所制備的多肽為線性肽時(shí)，所述制備方法不包括步驟(3)；當(dāng)所制備的多肽為環(huán)肽時(shí)，所述制備方法包括步驟(3)。步驟(1)是在液相環(huán)境中進(jìn)行，具體包括：浸泡樹脂—脫除氨基保護(hù)基—洗滌—監(jiān)測—偶聯(lián)氨基酸—監(jiān)測—洗滌—脫除氨基保護(hù)基—順序偶聯(lián)剩余氨基酸—干燥樹脂。本發(fā)明所涉及的多肽c末端若為羧酸形式，則步驟(1)采用wang樹脂進(jìn)行合成；本發(fā)明所涉及的多肽c末端若為酰胺形式，步驟(1)采用rinkamidembha樹脂進(jìn)行合成。其中氨基保護(hù)基是指為保護(hù)參與縮合反應(yīng)的氨基而引入的化學(xué)基團(tuán)。所述的氨基保護(hù)基選自：叔丁氧羰基(boc)、芐氧羰基(z)或9-芴基-甲基羰基(fmoc)，優(yōu)選9-芴基-甲基羰基(fmoc)。作為固相多肽合成技術(shù)的一個(gè)優(yōu)勢，對部分氨基酸的側(cè)鏈可以引入化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，例如cys可以采用三苯甲基(trt)；lys可以采用叔丁氧羰基(boc)；arg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺?；?pbf)。所述保護(hù)基不限于此，可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方案進(jìn)行合理選擇。步驟(1)的液相環(huán)境所用溶劑選自：二甲基酰胺(dmf)或二氯甲烷(dcm)，優(yōu)選dmf。步驟(1)中脫除氨基保護(hù)基需要加入氨基保護(hù)基的脫除劑，氨基保護(hù)基的脫除劑選用哌啶(pip)溶液，濃度10-40％(pip/dmf)，脫除時(shí)間為20-50min；優(yōu)選濃度為20-25％(pip/dmf)，脫除時(shí)間25-35min。步驟(1)中偶聯(lián)氨基酸所使用的偶聯(lián)試劑選自碳二亞胺型試劑與1-羥基苯并三氮唑(hobt)，或苯并三氮唑鎓鹽型試劑與1-羥基苯并三氮唑(hobt)。碳二亞胺型試劑選自二環(huán)己碳二亞胺(dcc)、二異丙基碳二亞胺(dic)或n-二氨基丙基-n-乙基碳二亞胺(edc)。苯并三氮唑鎓鹽型試劑選自2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、o-苯并三唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(bop)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)。偶聯(lián)試劑優(yōu)選二異丙基碳二亞胺(dic)和1-羥基苯并三唑(hobt)，或2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)和1-羥基苯并三唑(hobt)，進(jìn)一步優(yōu)選二異丙基碳二亞胺(dic)和1-羥基苯并三唑(hobt)。步驟(1)中的“監(jiān)測”采用茚三酮檢測法檢測多肽的縮合反應(yīng)。步驟(1)中的順序連接氨基酸是指根據(jù)多肽氨基酸序列從c端向n端逐個(gè)連接氨基酸。步驟(2)所述的側(cè)鏈保護(hù)基清除劑包括但不限于三異丙基硅烷、茴香硫醚、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、間甲酚或上述任意兩種或者兩種以上的組合，并與三氟乙酸或氫氟酸按5-20％(體積比)進(jìn)行配制得到。優(yōu)選三氟乙酸(tfa):茴香硫醚:75％苯酚:水＝85:5:5:5。特別有益的是為滿足醫(yī)藥用途的質(zhì)量要求，本發(fā)明所提供的多肽制備方法還可以進(jìn)一步包括純化步驟，所采用的純化方法選自反相色譜法或離子交換色譜法，優(yōu)選反相色譜法。本發(fā)明所涉及多肽的體外抗菌活性可以通過測定其最低抑菌濃度(mic)來鑒定。美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(nccls)推薦采用微量肉湯稀釋法來測定各抗菌肽的最低抑菌濃度(mic)，培養(yǎng)基采用mueller-hinton(mh)肉湯培養(yǎng)基以及改良型rpmi-1640培養(yǎng)基。以兩性霉素b、硫酸多黏菌素e及鹽酸萬古霉素作為陽性對照。體外活性測定表明，本發(fā)明提供的抗菌肽對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、耐藥銅綠假單胞菌均具有顯著的殺菌效果，具有廣譜、高效的特點(diǎn)。因此本發(fā)明所涉及的多肽可以在臨床上作為活性成分替代傳統(tǒng)抗生素進(jìn)行治療。以下實(shí)施例僅代表本發(fā)明闡述的一個(gè)方面，不是本發(fā)明主題的局限。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：tamp-1的制備及純化氨基酸序列：if-lys-arg-leu-lys-lys-leu-leu-lys-lys-if-nh2(seqidno:1)(1)材料及試劑rinkamidembha樹脂，取代值0.63mmol/g。氨基酸為：fmoc-l-arg(pbf)-oh、fmoc-l-leu-oh、fmoc-l-lys(boc)-oh、fmoc-l-4-碘苯丙氨酸-oh。試劑：hobt、dic、dmf、哌啶。(2)儀器psi300型多肽合成儀、waters600半制備型高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)。(3)操作步驟(以0.15mmol為例)a.固相化學(xué)合成多肽稱取rinkamidembha樹脂0.24g，置于多肽合成儀反應(yīng)器中，加入15mldmf，浸泡2h，然后加入20％pip/dmf溶液10ml，混合30min脫除氨基保護(hù)基，dmf洗滌樹脂7次，然后向反應(yīng)器中加入0.45mmolfmoc-l-4-碘苯丙氨酸-oh、等摩爾的偶聯(lián)試劑dic(0.3mol/l)和hobt(0.3mol/l)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為室溫，以茚三酮反應(yīng)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測無色則為反應(yīng)完成，用dmf洗滌樹脂5次。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)氨基酸偶聯(lián)到樹脂上后，即可按照上述方法繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)，如此循環(huán)，直至全部氨基酸偶聯(lián)完成。b.裂解及沉淀肽合成結(jié)束后，真空干燥樹脂，稱重。按照1ml裂解試劑/100mg樹脂的比例加入裂解試劑，試劑配比為tfa:茴香硫醚:75％苯酚:水＝85:5:5:5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，抽濾。之后向裂解抽濾液中加入10倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復(fù)洗滌沉淀4～5次，真空干燥，稱重粗肽。c.反相色譜純化用制備型hplc，采用反相色譜法，純化上述粗肽。1)制備hplc條件如下：色譜柱：chromatorexc18制備柱(250mm×10mm，10μm)流速：5ml/min檢測波長：220nm流動(dòng)相：a：含0.1％tfa水溶液b：含0.1％tfa的乙腈溶液梯度洗脫程序見表3：表3純化梯度洗脫表2)分析色譜柱：dionexc18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)流速：1ml/min檢測波長：215nm柱溫：35℃流動(dòng)相：a：含0.05％tfa水溶液b：含0.05％tfa的乙腈溶液梯度洗脫程序見表4：表4分析梯度洗脫表用步驟1)方法進(jìn)行制備，收集流份，并用步驟2)的分析方法檢測各流份，將目標(biāo)肽純度大于95％的流份合并，然后35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積，最后冷凍干燥。經(jīng)esi-ms測定，該肽的分子量為1700.07，理論分子量為1669.73。實(shí)施例2：環(huán)肽tamp-14的制備及純化氨基酸序列：環(huán)(caa-phe-lys-lys-leu-leu-lys-lys-leu-arg-lys-cys)(seqidno:14)(1)材料及試劑rinkamidembha樹脂，取代值0.63mmol/g。氨基酸為：fmoc-l-cys(trt)-oh，fmoc-l-lys(boc)-oh，fmoc-l-arg(pbf)-oh、fmoc-l-leu-oh、fmoc-l-phe-oh。試劑：hobt、dic、dmf、哌啶、一氯乙酸。(2)儀器psi300型多肽合成儀、waters600半制備型高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍干燥機(jī)。按照實(shí)施例1中的操作步驟a合成序列rinkamidembha-cys-lys-arg-leu-lys-lys-leu-leu-lys-lys-phe-fmoc，然后加入20％pip/dmf溶液15ml，混合30min脫除氨基保護(hù)基，用dmf洗滌樹脂7次，加入0.45mmol的一氯乙酸、等摩爾偶聯(lián)試劑dic(0.3mol/l)和hobt(0.3mol/l)，反應(yīng)2h，反應(yīng)溫度為室溫，以茚三酮反應(yīng)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，監(jiān)測無色則為反應(yīng)完成，用dmf洗滌樹脂5次。再用dcm洗滌5次，真空干燥后稱重。之后按照實(shí)施例1中的操作步驟b進(jìn)行，得到線性粗肽。粗肽加水，稀釋成1mg/ml的水溶液，用0.1mol/ml的naoh溶液調(diào)節(jié)ph至8.0，攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)結(jié)束后用10％冰醋酸水溶液調(diào)節(jié)ph至4.0，得到環(huán)肽水溶液。之后按照實(shí)施例1中操作步驟c進(jìn)行純化，收集目標(biāo)肽純度大于95％的部分，然后35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積，最后冷凍干燥。該肽的分子量為1443.57，理論值為1443.89。實(shí)施例3：表5中其余tamp系列抗菌肽的制備及純化(1)材料及試劑rinkamidembha樹脂，取代值0.63mmol/g。氨基酸為：fmoc-l-cys(trt)-oh、fmoc-l-lys(boc)-oh、fmoc-d-lys(boc)-oh、fmoc-l-arg(pbf)-oh、fmoc-d-arg(pbf)-oh、fmoc-l-leu-oh、fmoc-l-ile-oh、fmoc-d-leu-oh、fmoc-l-phe-oh、fmoc-d-phe-oh、fmoc-l-4-碘苯丙氨酸-oh、fmoc-l-4,4-聯(lián)苯丙氨酸-oh、fmoc-l-4-三氟甲基苯丙氨酸-oh、fmoc-l-4-碘苯丙氨酸-oh、fmoc-l-4-溴苯丙氨酸-oh、fmoc-l-2,3,4,5,6-五氟苯丙氨酸。試劑：hobt、dic、dmf、哌啶、一氯乙酸。(2)儀器psi300型多肽合成儀、waters600半制備型高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍干燥機(jī)。(3)操作步驟(以0.15mmol為例)以類似實(shí)例1中操作步驟a-c的方法制備及純化表5中的多肽，若為環(huán)肽則按照實(shí)施例2中的操作步驟進(jìn)行制備，收集純度大于95％的部分，然后35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至適當(dāng)體積，冷凍干燥。esi-ms測定值如表5所示。表5tamp系列抗菌肽對應(yīng)序列號(hào)及分子量抗菌肽序列號(hào)分子量(理論值)分子量(esi-ms)tamp-2seqidno:21652.501651.79tamp-3seqidno:31664.371664.85tamp-4seqidno:41714.691714.79tamp-5seqidno:51667.691668.50tamp-6seqidno:61678.791678.51tamp-7seqidno:71499.351498.79tamp-8seqidno:81499.351499.63tamp-9seqidno:91463.891463.26tamp-10seqidno:101463.891463.69tamp-11seqidno:111483.961483.95tamp-12seqidno:121716.111717.68tamp-13seqidno:131422.861422.73tamp-15seqidno:151443.891443.91tamp-16seqidno:161616.861616.53tamp-17seqidno:171616.861616.53實(shí)施例4：體外抗菌活性測定根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(nccls)推薦的微量肉湯稀釋法測定系列抗菌肽的最低抑菌濃度(mic)，細(xì)菌培養(yǎng)基采用mueller-hinton(mh)肉湯培養(yǎng)基，白色念球菌培養(yǎng)基采用hyclone改良型rpmi-1640培養(yǎng)基。具體步驟為：(1)抗菌藥物貯備液制備精確配制濃度為320μg/ml的tamp-1～17和80μg/ml陽性對照品兩性霉素b、硫酸多粘菌素e及鹽酸萬古霉素。配置好的各貯備液至于-20℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?2)培養(yǎng)基配制細(xì)菌mic測試采用mhbroth培養(yǎng)基：稱取mh肉湯培養(yǎng)基24.00g，溶于蒸餾水中并定容至1l，121℃高溫滅菌30min。真菌mic測試采用hyclone改良型rpmi-1640培養(yǎng)基，具體配制方法如下：稱取18.00g葡萄糖溶于一定量蒸餾水中，定容到500ml，115℃高溫滅菌15min。在無菌環(huán)境中，向已滅菌的葡萄糖溶液中加入500mlrpmi-1640培養(yǎng)基，混合后4℃貯存?zhèn)溆谩?3)接種物的制備用接種環(huán)挑去形態(tài)相似待檢菌落3～5個(gè)，細(xì)菌接種于4～5ml的mh肉湯培養(yǎng)基中(真菌接種于改良型rpmi-1640培養(yǎng)基中)，細(xì)菌35℃孵育16～20h、真菌28℃孵育24h。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或?qū)?yīng)的培養(yǎng)基校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1～2×108cfu/ml。細(xì)菌用mh肉湯培養(yǎng)基、真菌用改良型rpmi-1640培養(yǎng)基將上述菌懸液進(jìn)行1:1000稀釋備用。整個(gè)過程需要在無菌環(huán)境中進(jìn)行。(4)稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種取一塊96孔板，在第1孔中加入160μlmh肉湯培養(yǎng)基或改良型rpmi-1640培養(yǎng)基，第2-12孔中各加入100μl相對應(yīng)培的養(yǎng)基，然后向第1孔加入抗菌藥物原液(320μg/ml)40μl，混勻，接著吸取100μl至第2孔，混勻后再從第2孔中吸取100μl至第3孔，如此連續(xù)倍比稀釋至第10孔，并從第10孔中吸取100μl棄去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制備好的接種物各100μl，使每孔最終菌液濃度約為0.5×105cfu/ml。第1-10孔藥物濃度分別為32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，第11孔為不含抗菌藥物及接種物的空白對照，第12孔為不含抗菌藥物的陰性對照。(5)孵育接種細(xì)菌的96孔板置于35℃空氣培養(yǎng)箱孵育16～20h，接種真菌的96孔板置于28℃空氣培養(yǎng)箱中孵育40～50h。(6)結(jié)果以肉眼觀察，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為該樣品的最低抑菌濃度(mic)。各抗菌肽的mic測定結(jié)果如表6所示。表6tamp系列抗菌肽的mic測試結(jié)果當(dāng)前第1頁12