本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種抗高血壓活性肽citn-pro-hyp及應(yīng)用，和一種抗高血壓的藥物組合物。

背景技術(shù)：

《中國心血管病報告2015》指出我國的心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。高血壓是心血管疾病的主要危險因素已成共識，它是我國心血管疾病患病率持續(xù)上升的推動因素。2014年衛(wèi)生部統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明我國的高血壓病患率為25.5％，一些省份達到27.9％，全國高血壓患者數(shù)估計達2.7億。

目前，許多抗高血壓藥物被認(rèn)為是臨床一線的治療藥物，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(acei)是臨床效果最好的藥物，如依那普利、卡托普利、苯那普利、賴諾普利、群多普利等。但它們?nèi)匀淮嬖谝欢ǖ母弊饔?，如干咳、皮疹、血管性水腫和腎損傷等。

acei類藥物是一類肽類和修飾氨基酸類物質(zhì)，而天然的蛋白是豐富的肽資源。因此，科學(xué)家們一直致力采用酶水解和發(fā)酵的方式制備獲得acei活性肽，以期使高血壓患者得益。如兩個具有抗高血壓生物活性三肽“vpp”(val-pro-pro，vpp)和“ipp”(ile-pro-pro，ipp)被鑒定出來。但是，這種制備方式成本高、重復(fù)性低、生物利用率低，迫切需要發(fā)展一種新的替代生產(chǎn)技術(shù)。這些研究都是基于蛋白質(zhì)中蘊含的肽信息，雖然隨著肽分子量的增大，其結(jié)構(gòu)將千差萬別，活性亦將愈加具有潛力，但是由于腸道黏膜的分子篩效應(yīng)和其富含的肽酶，制約了利用天然蛋白活性資源開發(fā)acei肽類小分子物質(zhì)。因此，如何規(guī)避化學(xué)修飾肽類或氨基酸類acei小分子藥物的副作用和避免體內(nèi)肽酶的水解而完整吸收，成為開發(fā)安全無副作用的acei小分子藥物研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抗高血壓活性肽citn-pro-hyp及應(yīng)用和藥物組合物。

本發(fā)明的第一方面是提供一種抗高血壓活性肽citn-pro-hyp，所述活性肽的氨基酸序列為：瓜氨酰-脯氨酰-羥脯氨酸，具有式i所示結(jié)構(gòu)。簡稱為citn-pro-hyp(citrulline(citn)-proline(pro)-hydroxyproline(hyp))。

本發(fā)明從定量構(gòu)效關(guān)系(qsar)出發(fā)，利用食源性稀有氨基酸，結(jié)合抗高血壓活性肽c末端pro耐受肽酶水解的構(gòu)效特點，設(shè)計一系列小分子物質(zhì)，通過clcdrugdiscoveryworkbench分析設(shè)計小分子物質(zhì)和ace的相互作用的化學(xué)特性，初步確定具有抗高血壓的肽分子，通過液相合成法制備，進一步通過體外和體內(nèi)生物活性驗證，篩選確定具有較強抗高血壓活性的合成肽。該抗高血壓活性肽可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法制得，例如液相合成法。

本發(fā)明的第二方面提供所述的抗高血壓活性肽citn-pro-hyp在制備抗高血壓的藥品和食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三方面提供一種抗高血壓的藥物組合物，包括有效成分和輔料，所述的有效成分包括所述的抗高血壓活性肽citn-pro-hyp。

根據(jù)本發(fā)明，所述輔料可以為常規(guī)的各種藥用輔料或食品添加劑。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：

本發(fā)明提出了一種不同的活性肽?，F(xiàn)有技術(shù)從天然蛋白中通過體外蛋白酶解或微生物發(fā)酵分離獲得活性肽，可以被腸道黏膜中富含的肽酶進一步水解，降低了其體內(nèi)實際作用。本發(fā)明的活性肽是由稀有氨基酸和常規(guī)氨基酸構(gòu)成，在天然蛋白中并不存在這樣序列構(gòu)成。因此，本發(fā)明的活性肽可以逃避體內(nèi)蛋白酶的進一步水解，保證了其吸收的完整性和體內(nèi)作用的穩(wěn)定性。

本發(fā)明活性肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ace)活性抑制的ic50為195.61μmol/l，采用1.0mg/kg體重的劑量灌胃先天性高血壓大鼠4小時后血壓從227mmhg下降到最低點195mmhg，持續(xù)藥效時間為1.5小時。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢將變得更加明顯。

圖1為citn-pro-hyp對先天性高血壓大鼠血壓作用分析實驗檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不限于以下實施例。以下實施例中，在沒有特別說明時，“％”均指質(zhì)量百分比。

實施例1

citn-pro-hyp三肽的合成。本發(fā)明抗高血壓活性肽通過人工化學(xué)合成，具體操作如下：

采用固相多肽合成方法合成本發(fā)明多肽，選擇預(yù)裝的叔丁基羥脯氨酸二氯三苯甲基樹脂(hyp(tbu)-2cl(trt)-resin)，采用o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)和n,n-二異丙基乙胺(diea)為縮合劑，加入適量的芴甲氧羰基-l-脯氨酸(fmoc-pro-oh)，反應(yīng)1小時。

進一步地，采用二甲基甲酰胺(dmf)作為清洗劑，清洗反應(yīng)樹脂，獲得的芴甲氧羰基脯氨酰叔丁基羥脯氨酸二氯三苯甲基樹脂(fmoc-pro-hyp(tbu)-2cl(trt)-resin)。

進一步地，采用六氫吡啶(ppd)作為脫保護劑，反應(yīng)0.5小時，脫除芴甲氧羰基(fmoc)，得到脯氨酰叔丁基羥脯氨酸二氯三苯甲基樹脂(pro-hyp(tbu)-2cl(trt)-resin)。

進一步地，采用o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)和n,n-二異丙基乙胺(diea)為縮合劑，加入適量的芴甲氧羰基-l-瓜氨酸(fmoc-citn-oh)，反應(yīng)1小時。

進一步地，采用二甲基甲酰胺(dmf)作為清洗劑，清洗反應(yīng)樹脂，獲得的芴甲氧羰基瓜氨酰脯氨酰叔丁基羥脯氨酸二氯三苯甲基樹脂(fmoc-citn-pro-hyp(tbu)-2cl(trt)-resin)。

進一步地，采用六氫吡啶(ppd)作為脫保護劑，反應(yīng)0.5小時，脫除芴甲氧羰基(fmoc)，得到瓜氨酰脯氨酰叔丁基羥脯氨酸二氯三苯甲基樹脂(citn-pro-hyp(tbu)-2cl(trt)-resin)。

進一步采用適量的二甲基甲酰胺(dmf)，二氯甲烷(dcm)，甲醇各洗三次，空氣干燥2小時，收干樹脂。

進一步地，采用四氟乙酸:tis:水(95：2.5：2.5)作為裂解液，載入上一步獲得的樹脂，室溫反應(yīng)1小時，負(fù)壓抽濾；重復(fù)一次，合并抽濾液。在抽濾液中并攪拌并加入9倍體積的冰無水乙醚，進行層析、4000rpm離心3分鐘。棄上清后用乙醚重復(fù)洗滌5次，析出得到白色固體物質(zhì)進行真空干燥得到瓜氨酰脯氨酰羥脯氨酸三肽(citn-pro-hyp)粗制品。

進一步地，粗制品通過半制備型反相高效液相色譜(反相柱：30×250毫米依利特c18柱；流動相(a液100％乙腈(acn)，b液100％h2o)，線性梯度14％～80％；流速3毫升/分鐘)分離收集洗脫峰，凍干后備用。

實施例2

體外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ace)活性抑制試驗。

馬脲酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-l-histidyl-l-leucine，hhl)在ace酶的催化下快速分解產(chǎn)生馬尿酸(hippuricacid，ha)和二肽histidyl-leucine(hl)，加入ace酶抑制劑后，ace酶的活性受到抑制，ha和hl的生成量減少，本實施例中ace通過兔肺提取，酶活力為0.76mu/ml，通過dab顯色，采用分光光度計法測定ha生成量，分析ace酶活。乙酸乙酯提取反應(yīng)物中的馬尿酸，然后在乙酸酐中與含對二甲氨基苯甲醛的吡啶溶液(dab顯色劑)反應(yīng)生成桔黃色的化合物，直接在459nm比色測定其od值，按下列公式評價ace酶抑制劑對ace酶的抑制率。以50％的ace酶活性受到抑制所需合成三肽的濃度(ic50)定義合成三肽的ace抑制活性。

ace抑制活性(％)＝[(odcontrol-odsample)/(odcontrol-odblank)]×100％

具體反應(yīng)體系和條件見表1

表1

本實施例方法測得本發(fā)明的活性三肽對ace抑制活性ic50為195.61μmol/l。

實施例3

先天性高血壓大鼠(shr)體內(nèi)降壓試驗

采用softronbp-98a型大鼠智能無創(chuàng)血壓儀，利用套尾法測定測定大鼠的收縮壓(sbp)。

在shr大鼠(自發(fā)性高血壓大鼠)清醒狀態(tài)下，首先將老鼠放在鼠袋中，保持恒溫，采用softronbp-98a型大鼠智能無創(chuàng)血壓儀進行套尾測定尾靜脈血壓的方法，測定大鼠的收縮壓(sbp)。于實驗前一周開始隔天測定大鼠的血壓，待大鼠穩(wěn)定適應(yīng)后開始實驗記錄。先測定灌胃前的大鼠血壓，然后1.0mg/kg體重劑量進行樣品(實施例1的活性三肽，citn-pro-hyp)灌胃，空白對照組灌胃等體積生理鹽水(saline)，藥物對照組灌胃10mg/kg體重的抗高血壓藥物卡托普利(captopril)連續(xù)進行血壓監(jiān)測5小時，樣品灌胃后每30分鐘連續(xù)記錄大鼠血壓。每個測試點均測定3次大鼠的血壓，每次測定的間隔時間約1分鐘，取3次測定值的平均值作為該測試點大鼠的血壓，結(jié)果如圖1所示。

圖1為生理鹽水對照組、抗高血壓藥物對照組和合成活性肽組大鼠灌胃給藥后的血壓變化情況，其測得數(shù)據(jù)用spss系統(tǒng)軟件進行系統(tǒng)處理，采用t檢驗方法。由實驗結(jié)果可知，與藥物對照組相比，合成肽的降壓效應(yīng)比藥物組遲滯120分鐘左右，同時效應(yīng)時間相對較短，大約為1.5小時。合成活性肽灌胃4小時后，shr血壓顯著下降到最低點，在灌胃5小時后，血壓回升到初始壓值。說明本發(fā)明活性肽(citn-pro-hyp)具有較好的降血壓效果。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。