本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白osnhx5及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是世界上最重要的糧食作物之一。雜交稻的成功應(yīng)用在很大程度上解決了世界人口劇增帶來的吃飯問題，但隨著人們生活水平的不斷提高，培育高品質(zhì)、高營養(yǎng)以及各類功能性水稻正在成為迫在眉睫的問題。水稻種子貯藏蛋白作為稻米中的第二大營養(yǎng)物質(zhì)，在很大程度上決定了稻米的營養(yǎng)價值。因此對其合成轉(zhuǎn)運途徑的深入研究，將有助于我們通過基因工程的手段對稻米進(jìn)行改良。水稻谷蛋白首先以57kda前體的形式，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在分子伴侶的協(xié)助下正確折疊，之后輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)入高爾基體后，經(jīng)過翻譯后修飾，出芽形成囊泡，這些電子致密的囊泡會與水稻胚乳中的蛋白貯藏液泡融合，形成。水稻谷蛋白進(jìn)入蛋白貯藏液泡之后，經(jīng)過液泡加工酶的切割形成成熟的酸堿亞基，最終以這種成熟形式貯存其中。蛋白體ii中的谷蛋白可以被人體消化吸收，為稻米中主要的蛋白質(zhì)來源。上述谷蛋白分選加工的過程是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程。水稻谷蛋白57h突變體無疑是研究水稻貯藏蛋白分選的優(yōu)良材料，目前已報道了幾個57h突變體，但其中大多數(shù)尚未被克隆，因此，貯藏蛋白分選的確切機理尚不明確。nhx類蛋白在生物體中發(fā)揮重要功能，目前尚無報道關(guān)于nhx蛋白參與水稻貯藏蛋白分選的研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白(osnhx5)，來源于稻屬水稻(oryzasativavar.n22)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)由seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將seqidno.1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)的由seqidno.1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的seqidno.1由535個氨基酸殘基組成，自n端第30至460位為na+/h+轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。為了使(a)中的osnhx5便于純化，可在seqidno.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddk上述(b)中的osnhx5可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的osnhx5的編碼基因可通過將seqidno.2序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述貯藏蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白的基因(osnhx5)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因osnhx5可為如下1)或2)或3)或4)的dna分子：1)seqidno.2所示的dna分子；2)seqidno.3所示的dna分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼所述蛋白的dna分子；4)與1)或2)或3)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白的dna分子。seqidno.2由1608個核苷酸組成。所述嚴(yán)格條件可為在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子、玉米的泛素啟動子(ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為在pcambia1305載體的酶切位點smai之間插入所述基因osnhx5得到的重組質(zhì)粒，命名為pcambia1305-osnhx5。含有以上任一所述基因(osnhx5)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌。擴增所述基因(osnhx5)全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供了一種培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法。本發(fā)明提供的培育成熟谷蛋白含量增加的植物的方法，是將所述基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏?，得到成熟谷蛋白含量正常的轉(zhuǎn)基因植物；所述谷蛋白含量降低植物為籽粒中成熟谷蛋白含量顯著低于正常型的植物；所述谷蛋白含量正常的轉(zhuǎn)基因植物為籽粒中成熟谷蛋白的含量與正常型相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因植物。具體來說，所述基因通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入成熟谷蛋白含量降低的植物中；所述成熟谷蛋白含量降低的植物可為k67。所述蛋白、所述基因、所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或所述方法均可應(yīng)用于水稻育種。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)、定位并克隆得到一個新的植物谷蛋白運輸儲藏相關(guān)蛋白的基因osnhx5。本發(fā)明的植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白影響植物的囊泡運輸過程。抑制該蛋白編碼基因的表達(dá)可導(dǎo)致植物種子中谷蛋白的囊泡運輸過程的障礙，并影響其剪切成熟，從而可以培育囊泡運輸變異的轉(zhuǎn)基因植物和植物成熟谷蛋白含量降低的轉(zhuǎn)基因植物。將所述蛋白的編碼基因?qū)氤墒旃鹊鞍缀拷档偷闹参镏校梢耘嘤墒旃鹊鞍缀空５闹参?。所述蛋白及其編碼基因可以應(yīng)用于植物遺傳改良。附圖說明圖1為野生型日本晴和突變體k67蛋白質(zhì)電泳圖比較。圖2為野生型日本晴和突變體k67的成熟種子外觀比較。圖3為野生型日本晴和突變體k67的發(fā)育中胚乳細(xì)胞中超細(xì)微結(jié)構(gòu)的比較。圖4為野生型日本晴和突變體k67的發(fā)育中胚乳細(xì)胞中谷蛋白分布的比較(免疫熒光)。圖5為精細(xì)定位示意圖。圖6為轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行pcr分子檢測結(jié)果。圖7為轉(zhuǎn)pcambia1305-osnhx5的植株的成熟種子外觀。圖8為轉(zhuǎn)pcambia1305-osnhx5的植株的成熟種子的蛋白質(zhì)電泳圖。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例1、植物種子谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)一、水稻成熟谷蛋白降低突變體k67的成熟谷蛋白含量分布分析及遺傳分析在秈稻品種n22突變體庫中，利用蛋白質(zhì)電泳分析，篩選得到了一個種子中成熟谷蛋白含量降低的株系，同時其谷蛋白前體相比正常型顯著的增加，命名為k67。與n22比較，k67的主要特征是：種子中成熟谷蛋白含量下降(見圖1)，伴隨谷蛋白前體大量積累，同時具有種子不透明的表型，見圖2。對發(fā)育中胚乳進(jìn)行的透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)k67中儲存成熟谷蛋白的二型蛋白體相對n22(圖3a)的大小顯著的變小，并且二型蛋白體的外形也發(fā)生了變化，具有高度不規(guī)則的外形(圖3b)。同時，k67的胚乳細(xì)胞中還出現(xiàn)了很多來源未知的聚集體pmb(圖3b)。利用免疫熒光技術(shù)，觀察到k67(圖4b)中的二型蛋白體的顯著的變小，谷蛋白除了存在于二型蛋白體中還沿著細(xì)胞壁分布，聚集體中也分布了大量的谷蛋白(圖4b)。所以，微觀觀察數(shù)據(jù)表明在k67突變體胚乳細(xì)胞中谷蛋白的存儲形式發(fā)生了大幅度的改變，部分谷蛋白沒有被正確的運送到蛋白質(zhì)儲藏型液泡中。谷蛋白的剪切成熟須在蛋白質(zhì)儲藏型液泡/二型蛋白體中完成，因此，推斷k67中因為囊泡運輸過程的障礙，谷蛋白不能全部成功運輸?shù)蕉偷鞍左w中，而以前體形式存在于細(xì)胞壁附近和聚集體中，因此，成熟的谷蛋白的含量大幅的下降。二、突變基因定位1、突變基因初步定位用n22的花粉給k67進(jìn)行了人工輔助授粉，所得種子中成熟谷蛋白含量正常，用k67的花粉給n22進(jìn)行人工輔助授粉，所得種子中成熟谷蛋白含量也表現(xiàn)正常。所得f1自交后，后代中正常型和突變型的種子符合3:1的分離比例，因此，n22中成熟谷蛋白降低的表型是由單個隱性核基因控制的。用突變體k67與粳稻品種日本晴雜交，在k67/nip的f2種子中利用蛋白質(zhì)電泳分析挑選出10個具有成熟谷蛋白含量下降的單株，提取各株的葉片中的基因組dna，利用覆蓋水稻全基因組的565對ssr引物對10單株進(jìn)行連鎖分析，將谷蛋白運輸儲藏蛋白相關(guān)基因osnhx5定位在第9染色體上標(biāo)記nj9-4和nj9-5之間。上述ssr標(biāo)記分析的方法如下所述：(1)提取上述選取單株的總dna作為模板，具體方法如下：①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于eppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型geno/grinder儀器上粉碎樣品1min。②加入660μl提取液(含100mmtris-hcl(ph8.0)，20mmedta(ph8.0)，1.4mnacl,0.2g/mlctab的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。③加入40μl20％sds，65℃溫浴10min，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。④加入100μl5mnacl，溫和混勻。⑤加入100μl10×ctab，65℃溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。⑥加入900μl氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。⑦轉(zhuǎn)移上清液至1.5mleppendorf管中，加入600μl異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。⑧棄上清液，沉淀用70％(體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。⑨加入100μl1×te(121克tris溶于1升水中，用鹽酸調(diào)ph值至8.0得到的溶液)溶解dna。⑩取2μl電泳檢測dna質(zhì)量，并用du800分光光度儀測定濃度(bechmaninstrumentinc.u.s.a)。(2)將上述提取的dna稀釋成約20ng/μl，作為模板進(jìn)行pcr擴增；pcr反應(yīng)體系(10μl)：dna(20ng/μl)1μl，上游引物(2pmol/μl)1μl，下游引物(2pmol/μl)1μl，10xbuffer(mgcl2free)1μl，dntp(10mm)0.2μl，mgcl2(25mm)0.6μl，rtaq(5u/μl)0.1μl，ddh2o5.1μl，共10μl。pcr反應(yīng)程序：94.0℃變性5min；94.0℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循環(huán)35次；72℃延伸7min；10℃保存。pcr反應(yīng)在mjresearchptc-225熱循環(huán)儀中進(jìn)行。(3)ssr標(biāo)記的pcr產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的dnaladder為對照比較擴增產(chǎn)物的分子量大小，銀染顯色。2、突變基因精細(xì)定位根據(jù)初步定位的結(jié)果，在突變基因所在區(qū)域附近尋找公共圖譜上的分子標(biāo)記，并自行開發(fā)ssr標(biāo)記。用f2群體中的成熟谷蛋白含量下降的單株驗證，在該染色體的相關(guān)區(qū)段篩選更多標(biāo)記進(jìn)一步定位突變體基因。從k67/nip衍生的f2分離群體中挑出確認(rèn)為成熟谷蛋白含量下降的單株208株(用于突變基因精細(xì)定位。利用公共圖譜上的分子標(biāo)記和基于水稻基因組序列數(shù)據(jù)自行開發(fā)的ssr分子標(biāo)記對突變基因進(jìn)行了精細(xì)定位，并根據(jù)定位結(jié)果初步確定突變基因，具體方法如下：ssr標(biāo)記開發(fā)：將公共圖譜的ssr標(biāo)記與水稻基因組序列進(jìn)行整合，下載突變位點附近的bac/pac克隆序列。用ssrhunter(李強等，遺傳，2005，27(5):808-810)或ssrit軟件搜索克隆中潛在的ssr序列(重復(fù)次數(shù)≥6)；將這些ssr及其鄰近400～500bp的序列在ncbi通過blast程序在線與相應(yīng)的秈稻序列進(jìn)行比較，如果兩者的ssr重復(fù)次數(shù)有差異，初步推斷該ssr引物的pcr產(chǎn)物在秈、粳間存在多態(tài)性；再利用primerpremier5.0軟件設(shè)計ssr引物,并由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。將自行設(shè)計的ssr成對引物等比例混合，檢測其在k67和nip之間的多態(tài)性，表現(xiàn)多態(tài)者用作精細(xì)定位k67基因的分子標(biāo)記。用于精細(xì)定位的分子標(biāo)記見表2。表2用于精細(xì)定位的分子標(biāo)記引物前引物后引物所屬bacnj9-4gcatactgcttttacgacaactgccactgggattagaaosjnba0009h03k67-3tcatcatgcctgcaatgccggcgccacaaatctagcaatoj1190_b07k67-6aggatttaagtcactatgctccttcatatgtgttgggtgcgacaoj1190_b07nj9-5gaatcgtattgccagcgaaatcagagaagtagagagcgtp0663h05最終把k67基因精細(xì)定位在標(biāo)記k67-3和k67-6之間，這兩個標(biāo)記位于同一bac克隆oj1190_b07上，物理距離約為98kb(圖7)。(3)突變基因的獲得經(jīng)過對98kb區(qū)間內(nèi)的測序，發(fā)現(xiàn)了k67基因的第六個外顯子缺失7bp(圖5)，根據(jù)網(wǎng)上公布的序列設(shè)計引物，序列如下所述：primer1：5'atggcgctggagctgagcctgg3'(seqidno.4)；primer2：5'ctattggtcatagaatccgcgtc3'(seqidno.5)。以primer1和primer2為引物，以n22的發(fā)育中胚乳cdna為模板，進(jìn)行pcr擴增獲得目的基因。擴增反應(yīng)在ptc-200(mjresearchinc.)pcr儀上進(jìn)行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35個循環(huán)；72℃5min。將pcr產(chǎn)物回收純化后連接到pmd18-t(日本takara公司上)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(北京tiangen公司cb101)，挑選陽性克隆后，進(jìn)行測序。序列測定結(jié)果表明，pcr反應(yīng)獲得的片段具有seqidno.2所示的核苷酸序列，編碼535個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(見序列表的seqidno.1)。將seqidno.1所示的蛋白命名為osnhx5，將seqidno.1所示的蛋白的編碼基因命名osnhx5。實施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定一、重組表達(dá)載體構(gòu)建以日本晴(來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所種質(zhì)資源庫)的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴增獲得osvps9a基因，pcr引物序列如下：primer3：5'aattcgagctcggtacccgggacccacctgaaaaaaaaaaaaat3'(seqidno.6)；primer4：5'cgactctagaggatccccgggctcgagggtgtagtgcccctgctgg3'(seqidno.7)。上述引物位于seqidno.2所示基因的上游2.2kb和下游1.2kb，擴增產(chǎn)物包含了該基因的啟動子部分，將pcr產(chǎn)物回收純化。采用infusion重組試劑盒(日本takara公司)將pcr產(chǎn)物克隆到載體pcambia1305中。infusion重組反應(yīng)體系(10μl)：pcr產(chǎn)物1.0μl，pcambia13056.0μl，5×infusionbuffer2.0μl，infusionenzymemix1μl。短暫離心后將混合體系37℃水浴15分鐘，而后50℃水浴15分鐘，取2.5μl反應(yīng)體系用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞(北京tiangen公司；cb101)。將全部轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含50mg/l卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)16h后，挑取克隆陽性克隆，進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，得到了含有seqidno.3所示基因的重組表達(dá)載體，將含有osnhx5的pcambia1305命名為pcambia1305-osnhx5,osnhx5基因片段利用infusion重組試劑盒(日本takara公司)插入到該載體的sami酶切位點之間。二、重組農(nóng)桿菌的獲得用電擊法將pcambia1305-osnhx5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105菌株(購自美國英俊公司)，得到重組菌株，提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr及酶切鑒定。將pcr及酶切鑒定正確的重組菌株命名為eh-pcambia1305-osnhx5。用pcambia1305作為對照載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105菌株，方法同上，得到轉(zhuǎn)空載體對照菌株。三、轉(zhuǎn)基因植物的獲得分別將eh-pcambia1305-osnhx5和轉(zhuǎn)空載體對照菌株轉(zhuǎn)化水稻成熟谷蛋白含量降低突變體k67，具體方法為：(1)28℃培養(yǎng)eh-pcambia1305-osnhx5(或轉(zhuǎn)空載體對照菌株)16小時，收集菌體，并稀釋到n6液體培養(yǎng)基(sigma公司，c1416)中至濃度為od600≈0.5，獲得菌液；(2)將培養(yǎng)至一個月的t5390水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟(1)的菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(n6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，sigma公司)中，24℃共培養(yǎng)3天；(3)將步驟(2)的愈傷接種在含有100mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第一次篩選(16天)；(4)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有100mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第二次篩選，每15天繼代一次；(5)挑取健康愈傷轉(zhuǎn)入含有50mg/l潮霉素的n6固體篩選培養(yǎng)基上第三次篩選，每15天繼代一次；(6)挑取抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上分化；得到分化成苗的t0代陽性植株。四、轉(zhuǎn)基因植株的鑒定1、pcr分子鑒定將步驟三獲得的t0代植株提取基因組dna,以基因組dna為模板，利用primer5和primer6為引物對進(jìn)行擴增：primer5：atggcgctggagctgagcctg(seqidno.8)primer6：ctattggtcatagaatccgcgt(seqidno.9)。pcr反應(yīng)體系：dna(20ng/μl)2μl，primer1(10pmol/μl)2μl，primer2(10pmol/μl)2μl，10xbuffer(mgcl2free)2μl，dntp(10mm)0.4μl，mgcl2(25mm)1.2μl，rtaq(5u/μl)0.4μl，ddh2o10μl，總體積20μl。擴增反應(yīng)在ptc-200(mjresearchinc.)pcr儀上進(jìn)行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35個循環(huán)；72℃5min。用試劑盒(北京tiangen公司)純化回收pcr產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測,圖6中泳道2為k67突變體基因組dna，作為陰性對照；泳道1為pcambia1305.1-osnhx5質(zhì)粒，作為陽性對照；泳道3-5為轉(zhuǎn)基因陽性株系。2、表型鑒定分別將t0代轉(zhuǎn)pcambia1305.1-osnhx5植株，n22和k67種植在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗網(wǎng)室內(nèi)。種子成熟后，收取各材料種子，觀察到pcambia1305-osnhx5植株的種子中出現(xiàn)了透明的種子(圖7，其中l(wèi)1、l2、l3是三個不同的轉(zhuǎn)基因株系)，進(jìn)一步的蛋白質(zhì)電泳分析顯示，轉(zhuǎn)入pcambia1305-osnhx5的k67種子的成熟谷蛋白的含量上升至正常水平(圖8，其中l(wèi)1、l2、l3是三個不同的轉(zhuǎn)基因株系)。因此證明k67中的突變表型是由osnhx5的突變造成的。pcambia1305-osnhx5可以使k67株系的成熟谷蛋白增加至正常水平。序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一個植物谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白osnhx5及其編碼基因與應(yīng)用<160>9<210>1<211>535<212>prt<213>水稻（n22）<220><223>谷蛋白轉(zhuǎn)運儲藏相關(guān)蛋白osnhx5氨基酸序列<400>1metalaleugluleuserleuvalseralaserproproglyglyleu151015alaalaserproproproproalaalaileproglylysgluglngln202530valalaglyvalglyileleuleuglnilesermetleuvalleuser354045phevalleuglyhisvalleuargarghisargphetyrtyrleupro505560glualaseralaserleuleuileglyleuvalvalglyglyleuala65707580asnileserasnthrgluthrasnthrargmettrppheasnphehis859095aspgluphephepheleupheleuleuproproileilethrglnser100105110glypheserleuserprolysprophephealaasnpheglyalaile115120125valthrphealaileleuglythrpheilealaservalvalthrgly130135140valleuvaltyrleuglyglyleuthrpheleumettyrlysleupro145150155160phevalglucysleumetpheglyalaleuileseralathrasppro165170175valthrvalleuserilepheglngluleuglythraspvalasnleu180185190tyralaleuvalpheglygluservalleuasnaspalametalaile195200205serleutyrargthrmetserleuvalargserglnalaalaalagly210215220gluasnphephemetmetvalpheglnpheleugluthrphevalgly225230235240serleuserserglyvalglyvalglypheileseralaleuleuphe245250255lystyralaglyleuaspileaspasnleuglnasnleuglucyscys260265270leuphevalleupheprotyrphesertyrmetleualagluglyleu275280285glyleuserglyilevalserileleuphethrglymetvalmetlys290295300histyrthrpheserasnleuserasnasnserglnargphevalser305310315320alaphephehisleuleuserserleualagluthrphevalpheile325330335tyrmetglypheaspilealametglugluhissertrpserhisval340345350glypheilephepheserileilepheileileilealaargalaval355360365asnvalphesercysalatyrleuvalasnmetserargprogluhis370375380argargileproleulyshisglnlysalaleutrppheserglyleu385390395400argglyalametalaphealaleualaleuglnseralaasngluleu405410415proglyglyhisglylysthrilephethrthrthrthralaileval420425430valleuthrvalleuleuileglyglyserthrglythrmetleuglu435440445alaleuaspvalileglyaspgluasnargserilegluasntyrasp450455460aspasnasnglytyrileproprothrtyrglugluglyserserser465470475480glyglyglyleuargmetlysleulysgluphehislysserthrthr485490495serphethralaleuaspargasntyrleuthrprophephethrser500505510glnthraspgluaspaspaspvalpheglygluglnproglnasngln515520525argargglyphetyraspgln530535<210>2<211>1608<212>dna<213>水稻（n22）<220><223>osnhx5基因cds<400>2atggcgctggagctgagcctggtgtccgcttcgccccctggtgggctggcggcgagcccg60cccccgcccgccgccatcccggggaaggagcagcaggtggccggggtggggatcctgctg120cagatctccatgctcgtgctctccttcgtgctcgggcacgtcctccgccgccaccggttc180tactacctccccgaggccagcgcgtctctcctcatcggtctagttgtcggtgggcttgct240aatatttcaaatacagagaccaacactaggatgtggttcaacttccatgacgaatttttc300ttcttgttcttattgcctccaataatattccaatcaggattcagtctatccccaaaacca360ttctttgcaaattttggggctattgtaacttttgccatccttgggacattcattgcttct420gttgtaacaggagttctcgtctatcttggtgggttgacatttctaatgtacaaacttcca480tttgttgagtgcctcatgttcggtgctcttatatctgcaactgatcctgtcactgtgtta540tcaatattccaggagctgggcactgatgttaacttgtatgctcttgtgtttggagaatct600gttctaaatgatgcgatggcgatttcgctttacaggacaatgtcattggtcagaagtcaa660gcagcagctggggagaacttctttatgatggttttccagttccttgagacctttgttggt720tcattgtcatcaggtgttggagttggatttatctctgctcttctgtttaagtatgctgga780ctggatattgacaatcttcaaaacttggagtgctgcctttttgttctcttcccatacttc840tcgtatatgttagcagaaggacttgggttgtcaggaattgtttccatactattcacagga900atggttatgaagcactatacattttccaatctctcaaacaactctcagcgcttcgtttct960gccttctttcacttgctgtcatctttagcagaaacatttgtgttcatttatatgggcttt1020gatattgccatggaagaacatagctggtctcatgtgggcttcatattcttctcaattata1080tttataatcattgcaagggcagtaaatgtcttttcttgtgcatatttggttaacatgtca1140cggccagaacatcgacgcatacctctaaagcatcagaaagcactttggtttagtgggctt1200agaggggccatggcttttgcacttgctctccaatctgccaatgaacttcctggaggacat1260ggaaaaacaatattcacaaccaccacagctattgttgttttaacggtacttcttatcgga1320ggatcgacgggcaccatgctggaagctttggatgtaattggtgatgaaaacagatcaata1380gaaaattatgacgacaacaatggttacatccccccaacgtatgaggaaggttcatcatct1440ggaggaggattaagaatgaaactgaaggaattccacaaaagcacgacatcgttcactgcc1500cttgacaggaactatctgactccatttttcaccagtcaaactgatgaggatgatgatgtc1560ttcggtgaacaaccccaaaaccagagacgcggattctatgaccaatag1608<210>3<211>10377<212>dna<213>稻屬水稻（n22）<220><223>谷蛋白分選相關(guān)蛋白osnhx5的基因序列<400>3acccacctgaaaaaaaaaaaaattctccgcccgaaatcgcgaccccaccaaagtccaaac60cccgcattccccccacgctttcccccccgcgagccttctggaagaagcacgcatcgattg120accgcgaccgacctcgccgccggcgaccgtacggattccgcccctccccgccgcggcggc180ggcaccaccggggcgcgcgcgccgggatggcgctggagctgagcctggtgtccgcttcgc240cccctggtgggctggcggcgagcccgcccccgcccgccgccatcccggggaaggagcagc300aggtggccggggtggggatcctgctgcagatctccatgctcgtgctctccttcgtgctcg360gccacgtcctccgccgccaccggttctactacctccccgaggccagcgcgtctctcctca420tcggtacgtacgcgcgctacgaattgatcgtgcgagtcgcaaaccctagctgtcaaggat480cgtttcgtttatagagtttggattagtttgttgaggtgattattggtttgtgggatttag540aaattagaagtgggatgttcagatggagatggtatggggattgatgcatgtttccgatgc600cctgcaaatactgtgaagggttggaattcagtgccattctagg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