專利名稱：編碼白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白多肽的脫氧核糖核酸順序的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及免疫毒素白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白(gelonin)，具體地說(shuō)涉及白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白分子生物學(xué)，包括人工合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的方法。
人們目前對(duì)細(xì)胞毒性感興趣在于它們可能用來(lái)特定地作用于靶腫瘤細(xì)胞。植物毒素白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白就是這樣一類物質(zhì)。白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白是一種(分子量約20～30，000千道爾頓)糖蛋白，從多葉白樹(shù)(Geloniummultifoum)的種子純化而得到。它屬于一類能使核糖體失活的植物毒素。這類毒素的其它成員包括紅豆因、蓖麻毒素和modeccin的鏈。象紅豆因和蓖麻毒一樣，白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白通過(guò)破壞哺乳動(dòng)物核糖體的60S亞基而抑制蛋白質(zhì)合成。盡管蓖麻毒的A鏈?zhǔn)浅Ｓ玫拿庖叨舅兀讟?shù)種子儲(chǔ)藏蛋白對(duì)化學(xué)和物理處理似乎比RTA更穩(wěn)定(Barbieri等著的《CancerSurv.1》489-520頁(yè)(1982))。另外，白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白本身不與細(xì)胞結(jié)合，所以不具有毒性(除非濃度很高)，并且在實(shí)驗(yàn)室的操作中很安全。核糖體的失活是不可逆的，其作用似乎不需要輔因子參與，并且效率較高，這提示白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白可以象酶一樣起作用。
白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白和紅豆因是抑制蛋白質(zhì)合成的最有效毒素。白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的抑制蛋白合成的活力比紅豆因A鏈高10～1000倍。紅豆因和蓖麻毒這樣的肽由兩條鏈組成，A鏈?zhǔn)嵌拘詥挝唬珺鏈與細(xì)胞結(jié)合。與紅豆因和蓖麻毒不同，白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白由單鏈組成，并且由于它沒(méi)有一與細(xì)胞結(jié)合的B鏈，所以相對(duì)來(lái)說(shuō)其本身對(duì)完整細(xì)胞沒(méi)有毒性(Stripe等著，J.Biol.Chem.2556947-6953頁(yè)(1980))。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞顯然不能與白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白分子結(jié)合和/或使其進(jìn)入細(xì)胞。白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白與靶腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體的連接，與如針對(duì)黑素瘤細(xì)胞上抗原的單克隆抗體ZME連接可以使白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白特定地與細(xì)胞結(jié)合并進(jìn)入使白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白抗體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。用毒素白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白而不用其它毒素如紅豆因A鏈其優(yōu)點(diǎn)在于與紅豆因A鏈相比，白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白對(duì)正常組織的毒性較低。與針對(duì)相關(guān)抗腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白是一種可選擇用于治療腫瘤的有效的免疫毒性劑。
幾個(gè)研究者將白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白作為細(xì)胞毒性劑，用化學(xué)的方法使其與單克隆抗體或肽激素的細(xì)胞靶配位體相連接。但對(duì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白和細(xì)胞靶點(diǎn)的化學(xué)修飾會(huì)減少有效定位和白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白本身的胞毒潛力。而自然來(lái)源的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白，其細(xì)胞毒性在收獲過(guò)程中和在植物生長(zhǎng)時(shí)又受到影響。用化學(xué)方法或重組技術(shù)生產(chǎn)的人工合成的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白毒素可提供充足的、可再生的毒素來(lái)源。所以，用重組技術(shù)來(lái)制備一種白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的合成基因和制備合成基因的方法是非常必要的。
本發(fā)明提供了白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白合成基因的核苷酸順序和它的制備方法。白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白合成基因的DNA(脫氧核糖核酸)順序在順序編號(hào)1中給出。本發(fā)明也提供了含這些DNA順序的表達(dá)載體和這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了生產(chǎn)克隆和表達(dá)編碼白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的合成基因方法。首先，設(shè)計(jì)編碼來(lái)源于純化的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白最初氨基酸順序的雙鏈DNA片段，氨基酸順序改造這個(gè)DNA片段使其有利于基因的合成、克隆、表達(dá)或生物化學(xué)操作。接著，設(shè)計(jì)、合成、純化能連在一起形成目的基因的一組合成寡聚核苷酸(也叫低聚核苷酸)并使其5′磷酸化。接著，這些寡聚核苷酸退火后連接形成完整的基因。合成基因與一適當(dāng)克隆載體連接，并測(cè)出克隆基因的核苷酸順序。進(jìn)行定點(diǎn)誘變以糾正克隆基因中所有不希望的突變之后，基因被亞克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。含合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的表達(dá)載體被放入適當(dāng)?shù)妮d體宿主中，然后在適于生產(chǎn)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白產(chǎn)品的條件下保存表達(dá)宿主，并從表達(dá)該基因的細(xì)胞中分離、純化白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一實(shí)施例提供了含有核苷酸和片段及其衍生物的序列的合成DNA，它編碼的Selonin或多肽抑止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成而又不與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，其核苷酸順序是見(jiàn)順序編號(hào)1。同時(shí)也提供了帶有合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白DNA的表達(dá)載體及帶有表達(dá)合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施例提供了植物毒性蛋白白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白與抗體結(jié)合而形成的一種免疫毒素。
從本發(fā)明目的出發(fā)，術(shù)語(yǔ)“片段”是指順序編號(hào)1中的任何能產(chǎn)生抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成但不與表面受體相結(jié)合的蛋白質(zhì)的部份?！把苌铩笔侵负刑鎿Q的一種或多種單個(gè)核酸，它們產(chǎn)生同樣的蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明了解到并針對(duì)前述的長(zhǎng)期需要，充分滿足那些需要并提供不同的實(shí)施例。那些受益于本發(fā)明的示范和描述的本領(lǐng)域熟練人員，會(huì)很清楚本發(fā)明的其它及進(jìn)一步目的和優(yōu)點(diǎn)，其它的內(nèi)行人員也一樣。參照附圖，下面就描述目前的較佳實(shí)施例以揭示本發(fā)明。盡管為保證完整且?guī)椭斫?，這些描述很具體，但這并不是有意要改變專利的目的，即使后來(lái)者對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改變和形成或另外加入進(jìn)一步的改進(jìn)，本發(fā)明仍受專利保護(hù)。為了使本發(fā)明上述的目的、優(yōu)點(diǎn)和特征以及其他要說(shuō)明清楚的事項(xiàng)能被詳細(xì)了解，對(duì)本發(fā)明上述簡(jiǎn)要概括更具體的描述可參見(jiàn)實(shí)施例及其附圖。附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，值得一提的是，盡管附圖描寫(xiě)了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但并不認(rèn)為是限制它的范圍。本發(fā)明也認(rèn)可其它有同樣效果的相當(dāng)實(shí)施例。


圖1是化學(xué)合成寡聚核苷酸方法的圖示。
圖2是固相基因裝配過(guò)程的描寫(xiě)。
圖3是白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因裝配過(guò)程的圖示。
圖4示出寡核苷酸在白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因中的排列。
圖5描寫(xiě)了用于組裝白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的低聚核苷酸順序。
分子生物學(xué)的最近發(fā)展已使許多編碼在生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上有重要意義的蛋白質(zhì)的基因的克隆、表達(dá)和遺傳工程成為可能，此領(lǐng)域中的最近一個(gè)重要的進(jìn)展是能夠設(shè)計(jì)并生產(chǎn)合成基因。合成基因能編碼已知氨基酸順序的蛋白質(zhì)以及不是天然存在的新的蛋白質(zhì)，這對(duì)有醫(yī)療價(jià)值的蛋白質(zhì)特別有用。例如白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白設(shè)計(jì)、合成、克隆并表達(dá)以蛋白質(zhì)的氨基酸順序?yàn)榛A(chǔ)的基因是可行的。即使有關(guān)天然基因的特定信息還不知道時(shí)，比如，基因還未克隆，此設(shè)計(jì)、順序、克隆和表達(dá)仍然是可能的。還有，基因合成有利于對(duì)不同基因產(chǎn)品的工程化，這些產(chǎn)品具有天然蛋白沒(méi)有的特性。例如，對(duì)通常僅在植物或動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的基因可被設(shè)計(jì)，合成并克隆到載體中，此載體能在微生物宿主內(nèi)產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)。
合成基因的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與遺傳密碼的多重性有關(guān)。許多氨基酸在一個(gè)基因內(nèi)大多數(shù)氨基酸可由多個(gè)三聯(lián)密碼子編碼，不同生物體趨向于使用不同類型的蛋白質(zhì)的密碼子(S.Aota等.，《NucleicAcidsRes.》第16卷附卷pp.r315-r391(1987))。也就是說(shuō)，一種有機(jī)體“較好”的密碼子與另一種有機(jī)體較好的密碼子的是不同的。這種現(xiàn)象據(jù)信是與tRNA分子的多重性的差別有關(guān)，這種多重性表現(xiàn)為對(duì)一種給定的氨基酸，可以有多個(gè)特異接受相同性的tRNA相對(duì)應(yīng)的相同。即使基因產(chǎn)品是來(lái)自“異源”的宿主生物體，且該生物體對(duì)某些氨基酸較好的密碼子與表達(dá)宿主不一樣，同樣能設(shè)計(jì)出帶有給定表達(dá)系統(tǒng)所較好的密碼子合成基因。已經(jīng)表明，如果在基因設(shè)計(jì)中選擇的密碼子是與微生物宿主常用密碼子相應(yīng)的，合成的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的基因能在微生物宿主中產(chǎn)生較大量的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。此現(xiàn)象在白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的設(shè)計(jì)中(最初從植物來(lái))也已考慮到引入大腸桿菌表達(dá)宿主。為在一個(gè)不同的宿主系統(tǒng)中表達(dá)，一個(gè)本技術(shù)領(lǐng)域的一般人員可容易地重新設(shè)計(jì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因使其具有不同宿主的最佳密碼子。
合成基因的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)實(shí)際上在此案中是通過(guò)重復(fù)的基因密碼來(lái)實(shí)現(xiàn)。即編碼目的基因的DNA順序可被修飾，(不改變編碼的氨基酸順序)使整個(gè)基因含有最大量的限制酶識(shí)別的單一位點(diǎn)。大量單切位點(diǎn)的存在大大有利基因的生物化學(xué)操作。例如，可以切開(kāi)基因的一段并用不同的DNA順序取代它(通過(guò)位置相近的單一限制酶切位點(diǎn)實(shí)現(xiàn))，使新的遺傳信息通過(guò)重組DNA技術(shù)引入基因。此過(guò)程有用的操作包括把突變引入基因的特定區(qū)域，校正基因合成裝配和克隆過(guò)程中出現(xiàn)的突變，并產(chǎn)生嵌合基因或融合基因，以編碼具有不同蛋白質(zhì)的功能區(qū)域的蛋白質(zhì)。
此合成基因的設(shè)計(jì)也能改變可以非編碼“旁側(cè)”DNA順序以利用基因的克隆和表達(dá)。例如，可把限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別順序加入基因的旁側(cè)區(qū)域，使基因特定連接到所用的克隆載體。另外，遺傳信號(hào)也可加入合成基因用于在體內(nèi)控制基因的表達(dá)。
另外，基因的從新設(shè)計(jì)使將基因產(chǎn)品在體內(nèi)定位于某一組織或細(xì)胞器成為可能，這可提高基因產(chǎn)品的治療作用。比如，通過(guò)把一順序加入相關(guān)的基因可使治療劑位于特定細(xì)胞類型，此順序能編碼與靶細(xì)胞表面受體特異結(jié)合的多鈦區(qū)域。
合成基因設(shè)計(jì)進(jìn)一步包括短DNA鏈的化學(xué)合成和將寡聚核苷酸連接到較長(zhǎng)的雙鏈DNA片段。DNA的化學(xué)合成可避免低效偶合，當(dāng)連續(xù)把大量G或C殘基加入鏈時(shí)常出現(xiàn)這種情況。同樣，也希望能避免鏈內(nèi)次級(jí)結(jié)構(gòu)(發(fā)夾結(jié)構(gòu))或分子內(nèi)互補(bǔ)的形成，它們會(huì)在寡聚核苷酸退火時(shí)干擾基因的正常裝配。
基因裝配的過(guò)程包括下列步驟，第一，寫(xiě)出與目的編碼區(qū)域的相應(yīng)的兩鏈核苷酸順序，提供兩股之間最佳的互補(bǔ)配對(duì)堿基。然后加入任意所需的旁側(cè)順序，例如可在編碼順序鄰近加入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。然后，基因被分組成重疊的單鏈片段。用自動(dòng)化DNA合成儀化學(xué)合成單鏈片段。結(jié)合成基因的連續(xù)核苷酸互補(bǔ)重迭的長(zhǎng)度是可選擇的，但典型的為6～20堿基。在合成基因的所有寡聚核苷酸化學(xué)合成后，最好用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法純化。然后用多鈦激酶和腺苷5′-三磷酸鹽使純化的低聚核苷酸5′-磷酸化。然后在單一混合物、3-10個(gè)重疊的核苷酸中，或通過(guò)分步加入寡核苷酸到固相載體上，一起對(duì)鏈狀物退火。組裝的基因末端形成用于基因克隆的限制位點(diǎn)。為方便DNA測(cè)序組成的基因典型地先克隆到單鏈載體M13。如果有必要，可用寡核苷酸定點(diǎn)誘變校正突變。
合成基因的所希望有的特點(diǎn)(最佳密碼子使用，單限制位點(diǎn)，次級(jí)結(jié)構(gòu)的消除等)可在幾種任意的商用微機(jī)DNA順序分析程序幫助下進(jìn)行設(shè)計(jì)。
本發(fā)明使用了兩個(gè)最新的進(jìn)展，使基因更快、更經(jīng)濟(jì)地合成，且為蛋白質(zhì)工程創(chuàng)造了機(jī)會(huì)(K.L.Beattie等人，《Biotechnol.Appl.Biochem.，》10，510-521(1988);K.L.Beattie和R.F.Fowler，《自然》，352，548-549(1991))。第一個(gè)進(jìn)展是圖1中所描寫(xiě)的大量低聚核苷酸的快速經(jīng)濟(jì)合成技術(shù)。此技術(shù)使在一天里就能制備組裝一個(gè)基因所需的所有的合成DNA。參考圖1，核苷衍生化控制的孔玻璃被放入單個(gè)合成片中，片由Teflon圓柱體組成，具有孔的末端，以使液體流過(guò)一系列的片。同時(shí)，通過(guò)用氨基磷酸脂方法讓反應(yīng)劑流過(guò)柱體來(lái)把A，G，C或T加到與CPG相連并在片中的DNA鏈上(L.J.McBride和M.H.Carnthers，TetrahedroLett.，24，245-248(1983))。在每次化學(xué)反應(yīng)循環(huán)完成之后，片被分入不同的柱中，以提供在每張片中不同核苷酸順序的合成。一張通過(guò)四次循環(huán)的片的連續(xù)位置(涂黑)被示出，此使AGCT被加入到不斷加長(zhǎng)的DNA鏈中。
第二利于基因合成的技術(shù)進(jìn)展是提供一種把合成低聚核苷酸分步加到固相載體上以形成基因的方法。參照?qǐng)D2，目的基因被設(shè)計(jì)成從由一系列重疊互補(bǔ)的低聚核苷酸裝配合成。合成從一端結(jié)合于固相載體的一個(gè)寡核苷酸開(kāi)始，5′-磷酸化核苷酸被連續(xù)(摩爾過(guò)量)加到載體結(jié)合的鏈上。在每用一步退火反應(yīng)前，非結(jié)合的DNA被沖洗去。整個(gè)合成用DNA連接酶處理以封住裂口，然后在載體結(jié)合的低聚核苷酸中所含的唯一限制位點(diǎn)進(jìn)行酶切，從載體上釋放基因。被釋放的DNA被連接到一適當(dāng)?shù)臏y(cè)序和表達(dá)載體中。
可選擇許多表達(dá)合成基因的載體-宿主環(huán)境來(lái)生產(chǎn)編碼蛋白質(zhì)。這在“MethodsinGazymolgy第152卷，1987年，《AcademiPress》中有具體討論。簡(jiǎn)單講，特殊的表達(dá)載體是可用于細(xì)菌、真菌動(dòng)物和植物宿主的。大腸桿菌是表達(dá)外源基最常用的宿主，啤酒酵母也是一個(gè)常用的宿主。如前所述，如果克隆基因被化學(xué)合成，在基因設(shè)計(jì)時(shí)為增加表達(dá)水平使用的是表達(dá)宿主的最佳密碼子。大多數(shù)表達(dá)載體在與克隆位鄰近的地方含有遺傳控制因子，它促使高水平基因表達(dá)。表達(dá)載體中可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子典型的是從細(xì)菌(如tac，trp)和病毒(如λ，SV40)衍生出來(lái)的?！靶盘?hào)順序”元素有時(shí)被包含在載體中，以把基因產(chǎn)品運(yùn)到宿主細(xì)胞之外。信號(hào)順序能利于純化和減少蛋白降解。在合成基因的情況下，任何希望的遺傳控制因子都可被包括在“裝配”的雙鏈DNA中。一些表達(dá)載體在緊靠克隆位置的地方含編碼順序，這樣，外源編碼順序正確插入閱讀框架導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在合成基因的情況下，可在組合順序中提供附加的編碼順序?；虍a(chǎn)生為融合蛋白質(zhì)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括增加表達(dá)、較大的穩(wěn)定性、高親合力純化(利用能與附加的多肽成份結(jié)合的載體上的配位體)和基因產(chǎn)品在細(xì)胞內(nèi)定位(例如，定位于表面具有附加多肽成份受體的細(xì)胞類型)。在白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白治療的進(jìn)一步發(fā)展中，基因工程與后面的特征將被結(jié)合。
在編碼植物毒素白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的DNA順序的克隆和表達(dá)中，可用多種載體。這些包括，例如，由染色體片段，非染色體和合成的DNA順序組成的載體，如各種已知SV40的衍生物、已知的細(xì)菌質(zhì)粒，(例如，來(lái)自于大腸桿菌的質(zhì)粒col El，pCR1，pBR322，pMB9和它們的衍生物)，廣泛宿主質(zhì)粒，((例如)，RP4)、噬菌體DNA(例如，各種噬菌體入衍生物，如NM989和其它DNA噬菌體DNA，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體)、酵母質(zhì)粒(如2ll質(zhì)粒或它的衍生物)和從質(zhì)粒和噬菌體DNA的共同衍生的載體，(如可用于噬菌體DNA或其它表達(dá)控制順序的修飾過(guò)的質(zhì)粒)。
在每種特定的克隆或表達(dá)載體中，可選擇各種位點(diǎn)來(lái)插入本發(fā)明的DNA順序。這些位點(diǎn)通常存在于限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，且為此技術(shù)領(lǐng)域一般人員所熟知。各種把DNA順序插入這些位點(diǎn)以形成重組DNA分子的方法也是被熟知的。它們包括，例如，dG-dc或dA-dT加尾，直接連接、合成接頭、核酸外切酶和多聚酶修補(bǔ)反應(yīng)后連接，或用DNA聚合酶和一適當(dāng)?shù)膯捂湗影逖娱L(zhǎng)DNA鏈后再連接。當(dāng)然，本發(fā)明所用的克隆和表達(dá)載體對(duì)于選擇的DNA片段的插入是不需有限制核酸內(nèi)切酶切位點(diǎn)的。而不同的，此載體可通過(guò)另外的方法來(lái)與片段連接。
為表達(dá)本發(fā)明的DNA順序，這些DNA順序與一種或多種表達(dá)載體中的表達(dá)控制順序連接。這種有效連接可在選擇的DNA順序被引入克隆載體之后或之前，使表達(dá)控制順序能控制并促進(jìn)引入的DNA順序的表達(dá)。
控制DNA順序表達(dá)的多種表達(dá)控制順序都可在這些載體中應(yīng)用以表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。這樣有用的表達(dá)控制順序包括，例如SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，噬菌體入的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域，fd外殼蛋白質(zhì)的控制區(qū)域，3-磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶基因的啟動(dòng)子，酸性磷酸酶，比如Pho5基因的啟動(dòng)子，酵母α-配合因子的啟動(dòng)子和其他已知的控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或它們的病毒及這些順序的結(jié)合基因表達(dá)的順序。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過(guò)將表達(dá)單位與脫氫葉酸還原酶基因連接并選用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞作宿主也可能擴(kuò)增表達(dá)單位。
載體或表達(dá)載體和引入選擇的DNA片段位點(diǎn)的選擇和本發(fā)明所用的表達(dá)控制順序由各種因素決定。例如，這些因素包括對(duì)一特定限制酶可能的位點(diǎn)數(shù)目，被表達(dá)的蛋白質(zhì)大小，表達(dá)特征比如與載體順序相關(guān)的起始和終止密碼子的地點(diǎn)。其他因素也為本技術(shù)領(lǐng)域一般人員所熟知。對(duì)一特定磷酯酶抑制蛋白質(zhì)順序，其插入位點(diǎn)，載體的選擇、表達(dá)控制順序是由這些因素內(nèi)的平衡決定，在一給定情況下，不是所有選擇都是等效的。
含與表達(dá)控制順序有效相連的目的基因的重組DNA分子可被用于轉(zhuǎn)化多種適當(dāng)?shù)乃拗饕允惯@樣的宿主(轉(zhuǎn)化子)表達(dá)基因或它們片段產(chǎn)生雜交DNA編碼的多肽或多肽的部分。
多種宿主在產(chǎn)生本發(fā)明的抗原和DNA順序中也是有效的。這些宿主包括，例如，細(xì)菌，如大腸桿菌、桿菌屬和鏈霉菌屬，真菌如酵母菌和動(dòng)物如CHO細(xì)胞和組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。適當(dāng)宿主的選擇由本技術(shù)認(rèn)識(shí)到的多種因素來(lái)決定。它包括，例如與選擇載體的相容性、輔產(chǎn)品的毒性、得到目的多肽容易性、表達(dá)特征、生物安全性和費(fèi)用。從這些因素的單獨(dú)一個(gè)不能作出對(duì)一個(gè)特定重組DNA分子或多肽的宿主的絕對(duì)選擇。而一定取決于這些因素的平衡，對(duì)一個(gè)特定重組DNA分子的表達(dá)是不會(huì)所有的宿主都等效的。
如前所述，被引入到克隆或表達(dá)載體選擇的位點(diǎn)的DNA順序可包括不是為目的多肽編碼的基因部分，或可僅包括蛋白質(zhì)的整個(gè)基因的一段，只要求不論使用什么DNA順序，轉(zhuǎn)化的宿主都能產(chǎn)生實(shí)際上是含有與白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白相同功能行為的多肽或蛋白質(zhì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白。例如，本發(fā)明的DNA順序以相同的閱讀框架被融入表達(dá)載體中的一部分DNA順序中，此順序分別編碼至少一種真核或原核或原核載體蛋白質(zhì)，或至少一種真核或原核信號(hào)順序或這兩者的結(jié)合。這種構(gòu)建可有利于目的DNA順序表達(dá)，改進(jìn)宿體細(xì)胞中目的多肽的純化或分泌和較好地成熟。DNA順序也可包括ATG起始密碼子，以單獨(dú)或與其他密碼子一起直接與目的多肽的第一氨基酸的密碼子順序融合。這種構(gòu)建能使比如甲硫氨?；蚱渌幕嚯漠a(chǎn)生，是本發(fā)明的一部分。此N端甲硫氨酸或肽然后可用各種已知的方法在細(xì)胞內(nèi)或外的切除，也可使用與甲硫氨酸或成分中其他相連的融合物配合使用的多肽和本發(fā)明的方法。
實(shí)施例合成和組裝白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因?qū)嵤├?把5′-生物素低聚核苷酸結(jié)合到抗生蛋白鏈菌素涂覆的乳汁微球體上。
0.2mlDYNABEADSM280抗生蛋白鏈菌素(Dynal公司)樣品被放入1.5ml的Eppendof試管。試管對(duì)著一塊磁板(AdvancedMagnetiesInc.)保持幾分鐘以使磁乳汁微球體被吸引到試管的一邊，然后倒掉液體。這些珠(beads)用0.2ml退火緩沖液(成份下面給出)在室溫洗滌2次，然后再懸浮于0.2ml退火緩沖液中。
在珠懸浮液中加入1mol的5′-生物素低聚核苷酸，30分鐘之后室溫下珠用0.2ml退火緩沖液洗滌2次，再懸浮于0.2ml退火緩沖液中。在洗滌中對(duì)未結(jié)合的低聚核苷酸的分光光度計(jì)分析表明約300pmol的低聚核苷酸結(jié)合在珠上。
實(shí)施例2退火/洗滌循環(huán)，重復(fù)加入每個(gè)連續(xù)的低聚核苷酸在用于基因組裝前，用聚丙烯酰胺膠電泳純化低聚核苷酸并用T4多肽激酶使5′-磷酸化。
在150pmol載體結(jié)合的低聚核苷酸中加入750pmol重疊互補(bǔ)的低聚核苷酸，退火在0.10ml50mM的磷酸鈉緩沖液、pH7.5、1MNacl(退火緩沖液)中在45℃進(jìn)行5分鐘，然后混合物冷卻至室溫至少7分鐘。然后用0.2ml同樣緩沖液在室溫洗滌珠兩次，此循環(huán)被重復(fù)直到最后的低聚核苷酸加入。
實(shí)施例3產(chǎn)物連接和用限制酶消化從載體釋放在組合完成后，珠被洗滌并重懸浮于0.04ml連接酶緩沖液中。加入0.005mlDNA連接酶后(NewEnglandBidabs，高活力)，混和物被在室溫保溫2小時(shí)，然后在0.04ml限制消化緩沖液中洗滌和再懸浮。加入10單位限制性核酸內(nèi)切酶ECoRI后，混和物在37℃保溫90分鐘。液體被放掉，釋放的DNA用乙醇沉淀并且再懸浮于0.01ml連接酶緩沖液中。
實(shí)施例4白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的組裝用圖3和圖4所描述的兩種方式組合基因。低聚核苷酸順序在圖5中說(shuō)明?；?′-端組合(約500bpN-端編碼區(qū)域)從載體結(jié)合的Btgell開(kāi)始，且低聚核苷酸以下列次序加入(每個(gè)包括一個(gè)退火/洗滌循環(huán))gel39，gel1，gel38，gel2，gel37，gel3，gel36，gel4，gel35，gel5，gel34，gel6，gel33，gel7，gel32，gel8，gel31，gel9，gel30，gel10，gel29，gel11，gel28，gel12，gel27。
基因3′-端的組合(約300bpC-端編碼區(qū)域)從載體結(jié)合Btge12開(kāi)始，且低聚核苷酸以下列次序加入gel20，gel19，gel21，gel18，gel22，gel17，gel23，gel16，gel24，gel15，gel25，gel14，gel26，gel13.
參考圖3，基因的5′-端(N-端編碼區(qū)域)通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的消化從載體釋放，并且基因的3′-端(C-端編碼區(qū)域)用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ消化從載體釋放。參考圖4，在低聚核苷酸gel27和gel13中兩基因片段含有互補(bǔ)的20個(gè)堿基，兩基因片段被一起退火，然后連接形成完整的基因。
實(shí)施例5合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的克隆按照分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)方法，完整的DNA產(chǎn)品與已用EcoRI和HindⅢ酶切的M13mp19RFDNA連接實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，E.F.Sambrook等人，1989。
實(shí)施例6合成的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的序列測(cè)定M13mp19中的合成基因順序用雙脫氧法測(cè)定。在克隆合成基因中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變，都在5′-端上(N-端編碼區(qū)域)實(shí)施例7定點(diǎn)誘變校正克隆合成基因的突變進(jìn)行寡聚核苷酸指導(dǎo)的誘變來(lái)校正白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因中的兩種突變，在此過(guò)程后使用體外誘變?cè)噭┖?Amersham公司)。
實(shí)施例8合成基因克隆λ表達(dá)載體用EcoRI和HindⅢ作用從M13mp19載體切下合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因，且此含基因片段用瓊脂糖膠電泳純化并被連接入EcoRI/HindⅢ解理的表達(dá)載體pkk223-3(Pharmacia)。
實(shí)施例9合成的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)分析培養(yǎng)50ml帶有合成的白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的pkk223-3質(zhì)粒的大腸桿菌JM105，用IPTG誘導(dǎo)和并裂解以得到粗抽提物，用SDS聚丙烯酰胺膠電泳分析粗提物(旁邊使用不含插入片段的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞粗提物作對(duì)照)，也進(jìn)行Weskemblot分析和功能測(cè)定，以肯定蛋白質(zhì)表達(dá)和活力。
總之，本發(fā)明在此揭示的實(shí)施例看來(lái)，是能夠很好適于完成開(kāi)始提出的目標(biāo)和結(jié)果的。某些方法和裝置上的變化不會(huì)離開(kāi)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。應(yīng)該了解變化是可能的，也應(yīng)進(jìn)一步知道下面權(quán)利要求中所述的任何因素和步驟是指那些相同的因素和步驟，以實(shí)際上是相同或相似的方式完成實(shí)際上是相同的結(jié)果。不管本發(fā)明的原則以何種形式利用，都認(rèn)為是廣義覆蓋了本發(fā)明。所以，本發(fā)明能很好適應(yīng)于完成提到的目的、結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)以及其它固有的東西。
順序編號(hào)1的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度783基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假想的是(ⅵ)最初來(lái)源(A)有機(jī)物多葉白樹(shù)(GeloninMultiforum)(D)發(fā)育階段種子(F)組織類型核
(Xj)順序描寫(xiě)順序編號(hào)權(quán)利要求
1.一種編碼白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的合成基因的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括下列步驟設(shè)計(jì)含編碼白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的順序的第-DNA片段，所述的順序在白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白順序中含有每種氨基酸所對(duì)應(yīng)的三聯(lián)密碼子，所述的三聯(lián)密碼子是從一組能最大表達(dá)編碼各種氨基酸的三聯(lián)密碼子中選出的，操作并固定DNA片段于表達(dá)載體中，合成所述的第-DNA片段。合成所述第-DNA片段的互補(bǔ)DNA片段；且通過(guò)對(duì)所述第-DNA片段和互補(bǔ)DNA片段退火形成DNA雙鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的合成步驟包括把所述DNA片段分成一組低聚核苷酸單鏈重疊片段，所述片段被化學(xué)地合成，純化所述的低聚核苷酸;在5'端磷酸化所述的低聚核苷酸;并對(duì)核苷酸鏈一起退火。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于旁側(cè)順序是與所述雙鏈DNA連在一起的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括向所述合成基因或旁側(cè)順序中引入限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位。
5.如權(quán)利要求1所述的把合成基因克隆入表達(dá)載體的方法，其特征在于包括下列步驟(a)酶切編碼基因的雙鏈DNA基因成線性雙鏈狀態(tài);(b)用限制性內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體;(c)把所述含基因的線性雙鏈DNA與所述表達(dá)載體連接在一起;并(d)把步驟(c)的DNA轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主中。
6.如權(quán)利要求5所述方法的產(chǎn)品。
7.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)基因的方法，其特征在于包括下列步驟(a)把基因克隆入表達(dá)載體;(b)在誘導(dǎo)基因產(chǎn)物合成適當(dāng)數(shù)量的條件下，培養(yǎng)含被克隆λ表達(dá)載體的基因的宿主細(xì)胞;(c)純化來(lái)自于所述細(xì)胞的基因產(chǎn)品。
8.一種免疫毒素，其特征在于包括(a)是權(quán)利要求7方法生產(chǎn)的產(chǎn)品;且(b)結(jié)合于所述產(chǎn)品的抗體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括用SDS膠電泳、Western blot分析，活性檢測(cè)或其他適當(dāng)手段檢測(cè)基因產(chǎn)物的方法。
10.權(quán)利要求7方法的產(chǎn)品。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇能在適當(dāng)細(xì)菌宿主中表達(dá)的三聯(lián)密碼子。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述宿主是大腸桿菌。
13.如權(quán)利要求11所述的方法的產(chǎn)品。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇能在適當(dāng)真菌宿主中表達(dá)的三聯(lián)密碼子。
15.如權(quán)利要求14所述的方法的產(chǎn)品
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述的宿主是酵母。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇能在哺乳細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法的產(chǎn)品。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇提供在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)的密碼子。
20.如權(quán)利要求19所述的方法的產(chǎn)品。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇能在植物細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。
22.如權(quán)利要求21所述的方法的產(chǎn)品。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所有的低聚核苷酸在一個(gè)反應(yīng)混和物中一起退火來(lái)組裝基因。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，低聚核苷酸分批退火，隨后這些被一起退火并一起連接形成完整的基因。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因由含有下列步驟的固相組合方法構(gòu)建a.把一合成低聚核苷酸在或靠近它的一端處與固相載體物質(zhì)結(jié)合;b.沖洗掉多余的非結(jié)合的低聚核苷酸;c.加入(摩爾過(guò)量低聚核苷酸，此低聚核苷酸與結(jié)合于載體上的低聚核苷酸，在其全部或部分長(zhǎng)度上，堿基順序完全互補(bǔ)，并把鏈一起退火產(chǎn)生雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，然后沖洗掉過(guò)量的非結(jié)合的低聚核苷酸;d.重復(fù)步驟C直到整個(gè)基因組成;e.用DNA連接酶處理組成的基因以形成完整的雙鏈DNA;并f.用限制性核酸內(nèi)切酶或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ购铣苫驈妮d體中釋放。
26.合成的DNA含有編碼蛋白質(zhì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白或多肽的核苷酸順序，此蛋白質(zhì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白或多肽抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成但不與細(xì)胞表面受體結(jié)合。
27.如權(quán)利要求26所述的合成DNA，其特征在于，所述的核苷酸順序是順序編號(hào)1和片段及其衍生物。
28.如權(quán)利要求27所述的合成DNA順序，其特征在于所述的DNA順序抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，但不與細(xì)胞表面受體結(jié)合。
29.一種含有權(quán)利要求26或27的DNA的表達(dá)載體。
30.如權(quán)利要求29所述的載體，其特征在于所述的載體是pkk223-3。
31.如權(quán)利要求29所述的載體，其特征在于所述載體是pkc30或它的一種衍生物。
32.一種含有并且能表達(dá)權(quán)利要求26或27的重組DNA分子的宿主細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是從細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物宿主中選出的。
34.如權(quán)利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是選自大腸桿菌、假單胞菌、桿菌和酵母。
35.如權(quán)利要求32所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是選自大鼠、豬和人組織細(xì)胞。
36.如權(quán)利要求34所述的宿主，其特征在于，大腸桿菌是JM105大腸桿菌。
37.如權(quán)利要求27所述的合成DNA，其特征在于所述的DNA順序與表達(dá)控制順序有效連接。
38.如權(quán)利要求37所述的合成DNA，其特征在于所述的表達(dá)控制順序控制原核生物細(xì)胞、真核生物細(xì)胞或它們的病毒的基因的表達(dá)。
39.如權(quán)利要求37所述的合成DNA，其特征在于所述的表達(dá)控制順序是選自早期SV40啟動(dòng)子、晚期SV40啟動(dòng)子、loc系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、TRP系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域、fd外被蛋白質(zhì)控制區(qū)域和它們的組合體。
40.如權(quán)利要求27所述的合成DNA，其特征在于進(jìn)一步包括把所述的基因與編碼多肽區(qū)域的DNA順序融合，此多肽區(qū)域與在所選的靶細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體特殊地結(jié)合。
41.如權(quán)利要求26所述的生產(chǎn)合成DNA順序的方法，其特征在于包括下列步驟a.設(shè)計(jì)含與初級(jí)氨基酸順序相應(yīng)的三聯(lián)密碼子順序的雙鏈DNA片段，此最初氨基酸順序是由純化白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白蛋白確定的，這樣就使所述的DNA順序具有有利于基因的合成、克隆、表達(dá)、功能或生物化學(xué)操作的特點(diǎn);b.設(shè)計(jì)、合成、純化、5′-磷酸化一系列能連接在一起形成合成基因的低聚核苷酸;c.將低聚核苷酸退火和連接在一起，組成合成基因。
42.一種生產(chǎn)權(quán)利要求27所述順序編號(hào)1的合成DNA順序和片段及其衍生物的方法，其特征在于包括a.設(shè)計(jì)與由純化白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白蛋白質(zhì)確定的初級(jí)氨基酸順序相對(duì)應(yīng)的含三聯(lián)密碼子順序的雙鏈DNA片段，使所述的DNA順序具有有利于基因的合成、克隆、表達(dá)、功能或生物化學(xué)操作的特點(diǎn);b.設(shè)計(jì)、合成、凈化、5′-磷酸化一系列能連接在一起組成基因的合成低聚核苷酸;c.低聚核苷酸退火和組成合成基因。
43.一種免疫毒素，其特征在于包括(a)權(quán)利要求42所述方法的產(chǎn)品和(b)與所述產(chǎn)品結(jié)合的抗體。
44.一種編碼白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的合成基因的生產(chǎn)、克隆并表達(dá)方法，其特征在于，包括下列步驟a.設(shè)計(jì)與由純化白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白蛋白質(zhì)確定的最初氨基酸順序?qū)?yīng)的含三聯(lián)密碼子順序的雙鏈DNA片段，使所述的DNA順序具有有利于基因的合成、克隆、表達(dá)、官能或生物化學(xué)操作的特點(diǎn);b.設(shè)計(jì)、合成、凈化、5′-磷酸化一系列能連接在一起組成合成基因的合成低聚核苷酸;c.將低聚核苷酸退火并連接在一起以組成合成基因;d.使合成基因與適當(dāng)?shù)目寺≥d體連接在一起;e.確定克隆基因的核苷酸順序以證實(shí)基因的正確性;f.進(jìn)行定點(diǎn)誘變以校正克隆基因中任何不希望的突變;g.把基因亞克隆入一適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中;h.把含合成白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白基因的表達(dá)載體引入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主;i.在適于生產(chǎn)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白產(chǎn)品的條件下，培養(yǎng)帶有白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白表達(dá)載體的表達(dá)宿主;j.從表達(dá)基因的細(xì)胞分離和純化白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白。
45.一種免疫毒素，其特征在于包含a.權(quán)利要求44方法的產(chǎn)品;和b.與所述產(chǎn)品結(jié)合的抗體。
46.一種驗(yàn)證權(quán)利要求1的組合和克隆基因精確性的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括下列步驟(a)分離含有權(quán)利要求1基因的載體DNA;(b)對(duì)含基因的載體DNA測(cè)序;并(c)用大量克隆重復(fù)步驟a和b直到鑒定出含所希望的DNA順序的克隆。
47.一種校正在權(quán)利要求1的克隆基因中出現(xiàn)的用定點(diǎn)誘變校正突變的方法，其特征在于進(jìn)一步包括下列步驟(a)酶切所述突變基因的DNA;(b)將含突變的DNA鏈與合成的校正后的低聚核苷酸的引物退火連接，該引物所述的突變位點(diǎn)并含有正確的DNA順序。(c)用DNA聚合酶延伸通過(guò)退火連接于所述含突變的模板鏈上的校正低聚核苷酸引物。(d)通過(guò)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化把步驟C的DNA產(chǎn)品引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中;(e)分離載體DNA;并且(f)把校正后的基因亞克隆入表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了植物毒素白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白的合成基因的核苷酸順序和生產(chǎn)，克隆和表達(dá)此合成基因的方法。白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白合成基因的DNA順序在順序編號(hào)1中示出。本發(fā)明也提供了含白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白DNA順序的表達(dá)載體和用這些載體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。另外，一種含有抗體的免疫毒素也被結(jié)合入蛋白質(zhì)白樹(shù)種子儲(chǔ)藏蛋白。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1070227SQ9211010
公開(kāi)日1993年3月24日 申請(qǐng)日期1992年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1991年9月6日
發(fā)明者邁克爾G·羅森布拉姆, 肯尼思L·貝蒂 申請(qǐng)人:研究發(fā)展基金會(huì)