本發(fā)明涉及一種編碼豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirus2，pcv-2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的、危害養(yǎng)豬業(yè)較嚴(yán)重的病毒之一，該病毒與豬的多種疾病綜合征密切相關(guān)，包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaningmulti-systemicwastingsyndrome，pmws)和母豬的繁殖障礙(sowabortionandmortalitysyndrome，sams)等。自1991年加拿大首次報道pmws以來，該病現(xiàn)已波及世界各地在2010年國際豬獸醫(yī)大會(ipvs)上，豬圓環(huán)病毒感染成為關(guān)注度最高的疾病，是全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一。近年來，國內(nèi)豬圓環(huán)病毒感染呈上升趨勢，在我國豬群中流行十分嚴(yán)重，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

pcv-2基因組全長1767bp或1768bp，共包含11個開放閱讀框(orf)，其中orf1、orf2是兩個最大的開放閱讀框，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(rep蛋白)和衣殼蛋白(cap蛋白)。cap蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，研究表明其n端含有一個由41個氨基酸殘基組成的核定位信號(nls)，且含有大量的大腸埃希菌稀有密碼子，這將嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)。相關(guān)研究證實，cap蛋白免疫動物可以產(chǎn)生病毒的中和抗體。orf2基因已經(jīng)作為研制基因工程疫苗的重點(diǎn)對象。但是，現(xiàn)有技術(shù)中cap蛋白采用真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低，分離純化困難；而orf2編碼蛋白的n端存在著大量串聯(lián)或單聯(lián)的大腸埃希氏菌稀有密碼子，嚴(yán)重影響在大腸桿菌中的表達(dá)，所以目前報道進(jìn)行原核表達(dá)的多為截短型cap蛋白，這樣雖然蛋白表達(dá)量較高，但不是完整的cap蛋白，不能形成完整的病毒樣顆粒，同時一些功能性信號區(qū)域和保守序列沒能表達(dá)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前完整cap蛋白難以使用大腸桿菌規(guī)模化生產(chǎn)等問題，本發(fā)明提供一種易于可溶性表達(dá)的編碼豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的基因。

本發(fā)明的另一目的是提供含有上述基因的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明的再一目的是提供一種目的蛋白的表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物易于純化的含有上述基因的重組菌。

本發(fā)明還有一目的是提供一種上述重組菌表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白在制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗方面的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種編碼豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的基因，含有seqidno.1所示的序列。

所述基因含有bamhi和xhoi限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。

所述編碼豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的基因序列如seqidno.2所示。

一種含有上述基因的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體是將所述基因插入原核表達(dá)載體pet30a的bamhi和xhoi酶切位點(diǎn)之間所得。

一種含有上述基因的重組菌，所述重組菌是將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21所得。

所述重組菌表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白為誘導(dǎo)型表達(dá)。

所述重組菌表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的序列如seqidno.3所示。

一種上述重組菌在制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的應(yīng)用。

一種所述重組菌在制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗的方法，采用如下步驟：

(1)將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，再將菌體破碎裂解收集的上清液，加入甲醛滅活，制成滅活蛋白液，滅活檢測合格的蛋白液即為疫苗抗原；

(2)將上述疫苗抗原與佐劑混合攪拌，即得豬圓環(huán)病毒2型疫苗。

所述甲醛的濃度為0.2％w.t；所述滅活時間為24小時。

所述上清液抗原效價不低于1:8；pcv2cap蛋白含量不低于150μg/ml。

所述蛋白滅活液抗原與佐劑的體積比為85:15。

所述佐劑為isa系列佐劑，優(yōu)選isa15avg。

所述疫苗為水包油型。

一種豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的制備方法，采用如下步驟：誘導(dǎo)培養(yǎng)所述重組菌，收集菌體，破碎后，獲得裂解液上清，純化后獲得豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白。

所述培養(yǎng)基為含卡納霉素的液體lb培養(yǎng)基。

所述重組菌的接種量為1-5％，優(yōu)選為2-3％。

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的誘導(dǎo)劑為異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，濃度為0.2-1.2mmol/l，誘導(dǎo)時間為1-8h，誘導(dǎo)起始量為菌液od600值為0.6-1.0。

作為優(yōu)選，iptg的濃度為0.4-0.8mmol/l，誘導(dǎo)時間為2-5h。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

用原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白抗原使抗原的生產(chǎn)變得容易，成本低廉而且產(chǎn)量高。如能高效表達(dá)，則具有很大的優(yōu)勢。但是由于原核生物和真核生物在密碼子使用上具有偏嗜性，且orf2編碼蛋白的n端存在著大量串聯(lián)或單聯(lián)的大腸埃希氏菌稀有密碼子，這些因素都將嚴(yán)重影響在大腸桿菌中的表達(dá)。本研究為了提高orf2基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量，在不改變基因編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的基礎(chǔ)上，對基因進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化密碼子后的orf2基因，能更高效的表達(dá)目的蛋白，表達(dá)率達(dá)90％以上。

orf2編碼蛋白翻譯后無需糖基化等修飾加工過程，它以肽鏈的形式存在，原核表達(dá)產(chǎn)物與天然的cap蛋白具有同樣的一級結(jié)構(gòu)和同樣的抗原決定簇。本發(fā)明對orf2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，改變了難以在大腸桿菌中表達(dá)的稀有密碼子，極大地提高了蛋白的表達(dá)量，同時表達(dá)的完整cap蛋白氨基酸序列和親本序列完全一致，沒有改變其免疫原性，為保證制備的基因工程疫苗免疫效果打下良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明實現(xiàn)了全長cap蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白編碼基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，所以重組豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白能夠高產(chǎn)、高效、可溶表達(dá)，解決了cap蛋白在原核細(xì)胞中表達(dá)量低的難題。由于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)比較成熟，所以操作簡單，成本低廉，易于規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明的重組豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白活性良好，含有該重組蛋白的復(fù)合物免疫仔豬后可產(chǎn)生高水平的豬圓環(huán)病毒2型特異性抗體。因此，在預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型方面有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為pcv2orf2基因pcr檢測結(jié)果；其中，m為dl2000dnamarker，1為陰性對照，2為陽性質(zhì)粒；

圖2為cap蛋白sds-page電泳檢測結(jié)果；其中，m為蛋白marker，1為誘導(dǎo)前菌液，2為誘導(dǎo)后裂解上清液；

圖3為cap蛋白western-blot電泳檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制。

實施例1重組表達(dá)載體pet30a-orf2的構(gòu)建與鑒定。

1.orf2基因的獲得與密碼子優(yōu)化

以pcv2sd株(cgmccno.5774，保存日期：2012年2月8日)接種無pcv2污染的pk-15細(xì)胞，72h后收獲病毒作為模板，pcr擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型全基因組，引物序列如下：

上游引物序列如下：

5’-gaaccgcgggctggctgaacttttgaaagt-3’(seqidno.4)；

下游引物序列如下：

5’-gcaccgcggaaatttctgacaaacgttaca-3’(seqidno.5)；

pcv2sd株基因組序列如seqidno.6所示(genbankno.dq346683)，對該病毒如seqidno.7所示的orf2基因進(jìn)行優(yōu)化，改造為大腸桿菌嗜好的密碼子，序列如seqidno.1所示。將優(yōu)化改造后的orf2基因5’端和3’端分別加入bamhi和xhoi限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，序列如seqidno.2所示，進(jìn)行人工合成。

2.重組表達(dá)載體pet30a-orf2的構(gòu)建與鑒定

2.1重組表達(dá)載體pet30a-orf2的構(gòu)建

將合成的重組orf2基因雙酶切后與pet30a原核表達(dá)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)連接，構(gòu)建pet30a-orf2表達(dá)載體。用熱應(yīng)激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞，涂布含卡那霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)。挑取單菌落，在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)pcr擴(kuò)增和bamhi、xhoi雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒獲得目的條帶，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果證明優(yōu)化后的orf2基因已經(jīng)成功插入到pet30a質(zhì)粒中，沒有點(diǎn)突變，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pet30a-orf2。

2.2重組表達(dá)載體pet30a-orf2的pcr

根據(jù)改造后的orf2基因序列，設(shè)計一對檢測引物，擴(kuò)增orf2基因，引物序列如下所示：上游引物序列如下：

5’-atggatccatgacctacccgcgtcgtc-3’(seqidno.8)；

下游引物序列如下：

5’-gtctcgagcttagggttgagcggcggg-3’(seqidno.9)。

以連接產(chǎn)物為模板，加入以下試劑，建立50μlpcr體系：

按以下擴(kuò)增條件：95℃5min；94℃30s，61℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

回收pcr產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定pcr產(chǎn)物，如圖1所示，其中m為標(biāo)準(zhǔn)dnamarker(dl2000)，1為陰性對照，2為陽性質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果，含有目的條帶，約為700bp。

2.3重組表達(dá)載體pet30a-orf2的雙酶切鑒定

用bamhi和xhoi將純化后的pet30a-orf2原核表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，取酶切產(chǎn)物5μl在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，5v/cm，40min。酶切體系如下：

雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒重新測序，結(jié)果表明，orf2基因中無點(diǎn)突變。

實施例2重組表達(dá)菌株bl21/pet30a-orf2的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)。

1.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌bl21

實施例1中測序正確的pet30a-orf2原核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(neb)，得到重組表達(dá)菌株bl21/pet30a-orf2。

2.重組表達(dá)菌株bl21/pet30a-orf2的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組菌單個菌落，接種至10ml含卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6-1.0，加iptg至終濃度為1mmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，棄上清，pbs(0.015mol/l,ph7.2)洗滌后，加入3ml裂解液，超聲裂解3min，離心后收集上清，取適量加入5×sds上樣緩沖液，用12％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行sds-page檢測，剩余樣品-20℃凍存?zhèn)溆?，同時設(shè)立不加iptg誘導(dǎo)的培養(yǎng)物作為對照。

3.重組表達(dá)菌株bl21/pet30a-orf2表達(dá)產(chǎn)物鑒定

收集bl21/pet30a-orf2菌體，進(jìn)行sds-page電泳，電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色顯示，結(jié)果如圖2所示：重組表達(dá)質(zhì)粒分別產(chǎn)生了大約37kda蛋白條帶，大小與預(yù)期融合蛋白分子量基本一致，表達(dá)率達(dá)90％以上，而對照無此條帶。應(yīng)用pcv2單克隆抗體對誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行western-blot檢測，結(jié)果顯示在37kda處呈現(xiàn)特異性目的條帶，如圖3所示。

實施例3重組表達(dá)菌株bl21/pet30a-orf2的可溶性表達(dá)

將2％菌種分別按照含卡納霉素的液體lb培養(yǎng)基體積的將的重組菌種接種至含卡納霉素的液體lb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至2小時至od600為0.82時加入終濃度為0.8mmol/l的iptg誘導(dǎo)3小時，4℃5000rpm離心10min后以pbs(0.015mol/l,ph7.2)洗滌沉淀，然后加入10ml裂解液，超聲裂解20min，4℃10000rpm離心15min后收集上清；純化濃縮后獲得豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白。

實施例4豬圓環(huán)病毒2型疫苗的制備。

按照以下方法制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗：

(1)將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌菌體破碎裂解收集的上清液純化濃縮后采用瓊脂擴(kuò)散法測定抗原效價為1:16；用bca方法進(jìn)行總蛋白含量測定，同時進(jìn)行sds-pega電泳后經(jīng)過凝膠成像儀掃描，計算pcv2cap蛋白含量為155μg/ml。將上述上清液加入0.2％甲醛37℃震蕩，滅活24小時，制成蛋白滅活液，檢測合格后即為疫苗抗原；

(2)將抗原與油相佐劑isa15avg按照85:15的比例混合攪拌，乳化制成水包油型(o/w)苗。

實施例5豬圓環(huán)病毒2型疫苗的效力與生物學(xué)檢驗。

1.抗體檢測

用14-21日齡pcv2抗原陰性健康易感仔豬10頭，分成2組，每組5頭，第1組分別肌肉注射制備的基因工程疫苗2.0ml，第2組不接種，作為空白對照，隔離飼養(yǎng)觀察。免疫后28日采血，采用elisa方法測定pcv2抗體效價，免疫組應(yīng)pcv2血清elisa抗體效價不低于1：1600，對照組豬的pcv2血清elisa抗體效價不高于1：400。具體結(jié)果如下：

從表1可以看出，基因工程疫苗免疫組豬的pcv2血清elisa抗體效價不低于1：1600，空白對照組豬的pcv2血清elisa抗體效價不高于1：400。

表1疫苗免疫試驗豬的血清抗體效價檢測結(jié)果。

2.免疫攻毒法

用14-21日齡pcv2抗原抗體陰性健康易感仔豬15頭，分成3組，每組5頭，第1組為免疫攻毒組，分別肌肉注射疫苗2.0ml，第2組為非免疫攻毒組，第3組為空白對照組(非免疫、非攻毒)，3組分別隔離飼養(yǎng)。免疫后28日進(jìn)行攻毒，攻毒前3日，第1、2組仔豬各肌肉注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(klh/icfa,0.5mg/ml)5.0ml，腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。攻毒時，第1、2組仔豬分別接種sd株病毒培養(yǎng)液(≥10^5.5tcid50/ml)，每頭滴鼻2.0ml，肌肉注射3.0ml，攻毒后第3、6日，第1、2組仔豬各肌肉注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(klh/icfa,0.5mg/ml)5.0ml，腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。感染當(dāng)日和攻毒后第28日稱量所有仔豬體重，攻毒后前7日每日測量各組仔豬體溫，攻毒后28日結(jié)束，剖檢，取仔豬腹股溝淋巴結(jié)進(jìn)行免疫組化檢測，根據(jù)體溫、相對日增重和免疫組化檢測進(jìn)行判定，試驗結(jié)果詳見表2-表5。非免疫攻毒組應(yīng)至少4頭發(fā)病，免疫攻毒組至少4頭保護(hù)。

表2攻毒后試驗豬的體溫變化表

由表2可以看出，在基因工程疫苗免疫后用豬圓環(huán)病毒2型sd株病毒液(10^5.5tcid50/ml)攻毒，試驗豬的體溫未發(fā)生明顯的變化；非免疫攻毒組中的5頭試驗豬體溫升高(≥40℃)且持續(xù)3日以上。

表3攻毒后體重變化情況

由表3可以看出，免疫攻毒組和非免疫攻毒組試驗豬使用豬圓環(huán)病毒2型sd株病毒液(10^5.5tcid50/ml)攻毒后，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件spss20.0進(jìn)行顯著性分析，免疫攻毒組平均相對日增重與空白對照組平均相對日增重相比，p＞0.05，差異不顯著，該組所有豬沒有豬圓環(huán)病毒2型引起的臨床癥狀。非免疫攻毒組平均相對日增重與空白對照組平均相對日增重相比，p＜0.01，差異極顯著，該組所有豬有豬圓環(huán)病毒2型引起的臨床癥狀。

表4攻毒后試驗豬的免疫組化檢測結(jié)果

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

由表4可以看出，非免疫攻毒組試驗豬攻毒后28天時通過免疫組化能檢出抗原，試驗豬使用疫苗免疫后使用豬圓環(huán)病毒2型sd株病毒液(10^5.5tcid50/ml)攻毒28天時免疫組化不能檢出抗原。

表5疫苗免疫保護(hù)效力試驗結(jié)果

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

綜合上述，免疫攻毒后，免疫組可以達(dá)到5/5保護(hù)，非免疫攻毒組5/5發(fā)病，表明此疫苗免疫效果好。

<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一種編碼豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白的基因及其應(yīng)用

<130>20170614

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>705

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgacctacccgcgtcgtcgttaccgtcgtcgtcgtcaccgtccgcgttctcacctgggt60

caaatcctgcgtcgtcgtccgtggctggttcacccgcgtctgcgttaccgttggcgtcgt120

aaaaacggcatcttcaacacccgtctgtctcgtaccatcggttacaccgttaaagcgacc180

accgttcgcactccaagctgggcggtcgatatgatgcgctttaacatcaacgacttcctg240

ccgccaggtggcggctctaacccgctgaccgttccgttcgaatactaccgtatccgtaaa300

gtgaaagttgaattctggccgtgcagcccgatcacccagggcgatcgcggcgtcggttcc360

accgcagtgatcctggatgataacttcgtgaccaaagcgaacgcgctgacctacgatccg420

tacgttaactattctagccgccacaccatcccgcagccattctcctaccacagccgttat480

ttcaccccgaagccggtgctggatcgtaccatcgactacttccagccgaacaacaaacgt540

aaccagctgtggctgcgtctgcagaccaccggtaacgtggatcacgttggcctgggtact600

gcgttcgaaaactctaaatacgaccaggactacaacattcgtatcaccatgtacgttcag660

ttccgtgagttcaacctgaaagacccgccgctcaaccctaagtaa705

<210>2

<211>717

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggatccatgacctacccgcgtcgtcgttaccgtcgtcgtcgtcaccgtccgcgttctcac60

ctgggtcagatcctgcgtcgtcgtccgtggctggttcacccgcgtctgcgttaccgttgg120

cgtcgtaaaaacggcatcttcaacacccgtctgtctcgtaccatcggttacaccgttaaa180

gcgaccaccgttcgcactccaagctgggcggtcgatatgatgcgctttaacatcaacgac240

ttcctgccgccaggtggcggctctaacccgctgaccgttccgttcgaatactaccgtatc300

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gttcagttccgtgagttcaacctgaaagacccgccgctcaaccctaagtaactcgag717

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<400>3

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151015

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505560

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