本發(fā)明屬于細(xì)胞工程與病毒培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒,及可與豬圓環(huán)病毒共培養(yǎng)的PK15細(xì)胞株，大量培養(yǎng)制備PCV2病毒的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前國(guó)內(nèi)正在使用的豬圓環(huán)病毒疫苗主要有2種----亞單位苗和全病毒疫苗。亞單位苗雖安全性較好，但生產(chǎn)成本高昂，免疫期短。因此國(guó)內(nèi)絕大部分豬場(chǎng)仍以全病毒疫苗為主。但全病毒疫苗生產(chǎn)亦有其技術(shù)瓶頸：（現(xiàn)有的）圓環(huán)病毒體外培養(yǎng)的細(xì)胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同細(xì)胞個(gè)體中的復(fù)制速度差異極大，病毒培養(yǎng)效價(jià)很難在短時(shí)間內(nèi)上升到理想狀態(tài)，為解決該難題，所有生產(chǎn)者都在其培養(yǎng)工藝中增加一個(gè)用D-氨基葡萄糖處理，使細(xì)胞停留于細(xì)胞分裂的S期，以此保證病毒擴(kuò)增的程序（嚴(yán)偉東《豬病專題2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集》1184-1188）。但該程序不僅增加了原材料投入，而且增多了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和人力投入，增加了廢棄物排放量，使生產(chǎn)成本至少增加1倍以上，即便如此，國(guó)內(nèi)許多廠家用此方法生產(chǎn)的生產(chǎn)的圓環(huán)病毒疫苗，其病毒效價(jià)在10⁴以下，免疫效果較差。也有人采取篩選對(duì)圓環(huán)病毒高度敏感細(xì)胞系培養(yǎng)圓環(huán)病毒其病毒含量均在10⁶以上，免疫效果較好，但生產(chǎn)成本依然高昂。因此如何提高圓環(huán)病毒的培養(yǎng)效價(jià)是國(guó)內(nèi)廠家目前改良工藝的主攻方向。

此外，由于普通圓環(huán)病毒在培養(yǎng)過程中不能使細(xì)胞發(fā)生病變表現(xiàn)（嚴(yán)偉東《豬病專題2010年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集》1184-1188），病毒的收獲時(shí)間確定具有很大的盲目性，這也是造成目前疫苗質(zhì)量較差的原因之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的豬圓環(huán)病毒PCV2，該病毒在宿主細(xì)胞PK15可大量擴(kuò)增，且可使宿主細(xì)胞PK15發(fā)生可視輕微病變，但不致細(xì)胞凋亡。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與豬圓環(huán)病毒共培養(yǎng)的PK15細(xì)胞株，該細(xì)胞攜帶PCV2病毒，能穩(wěn)定培養(yǎng)并產(chǎn)生PCV2病毒，細(xì)胞株發(fā)生可視輕微病變，但能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)并產(chǎn)生PCV2病毒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種大量制備PCV病毒的方法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供新的細(xì)胞株在培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒中的應(yīng)用

本發(fā)明的再一個(gè)目的是豬圓環(huán)病毒PCV2在預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開了一株新的豬圓環(huán)病毒PCV2突變株，其特征在于：PCV2突變株至少有9個(gè)位點(diǎn)的堿基突變，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，該病毒是豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:V201660。

豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株是從表現(xiàn)豬圓環(huán)病毒病癥狀的病豬體內(nèi)分離的，分離方法包括下列步驟：

（1）無菌操作取下已有明顯臨床癥狀的為患豬圓環(huán)病毒病的病豬的腹股溝淋巴結(jié)，用含2萬單位/ml的青霉素和200ug/ml的鏈霉素混合液洗滌7次以上，并搗成均漿，離心，過慮除菌獲得病料液；

（2）將病料液與含2%血清的DMEM維持培養(yǎng)基1:1混合；

（3）接種混合液至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞上進(jìn)行感染；

（4）感染并培養(yǎng)24小時(shí)后棄去接種液，加少許3mM的D-氨基葡萄糖鋪蓋細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，PBS洗滌5次，加入2%血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

（5）培養(yǎng)72小時(shí)后，取上清液，用PCV2專用PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，留下陽性表現(xiàn)最強(qiáng)的細(xì)胞繼續(xù)盲傳5代，收獲第5代上清液，4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，再次病毒測(cè)定確證為強(qiáng)陽性后收集，凍干保存或直接液氮凍存；

（6）將步驟（5）收獲的病毒液送商業(yè)化測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

測(cè)序結(jié)果顯示，該病毒基因組與所有現(xiàn)已報(bào)道的毒株基因組序列99%吻合，與最接近的基因組比對(duì)發(fā)生了至少9個(gè)堿基突變。證明其為PCV2的一個(gè)新突變株，命名為GY-PCV2。

（7）將步驟（5）收獲的病毒液進(jìn)行攻毒檢測(cè)

攻毒結(jié)果顯示：GY-PCV2能夠使被攻毒豬只發(fā)生典型的豬圓環(huán)病毒病的癥狀，從共度豬病料組織分離的病毒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，與GY-PCV2基因序列完全吻合。

（8）將步驟（5）收獲的病毒液進(jìn)行PCV2免疫熒光檢測(cè)

免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示：GY-PCV2顯示PCV2免疫熒光強(qiáng)陽性反應(yīng)，說明其具有PCV2抗原性。

（9）對(duì)已獲得的病毒連續(xù)培養(yǎng)20代，收獲第20代病毒液，送基因測(cè)序公司測(cè)定病毒的全基因組序列。測(cè)定結(jié)果與步驟（6）的全基因組序列100%吻合，說明該P(yáng)CV2突變株有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明將豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

本發(fā)明公開了一株攜帶PCV2病毒的PK15細(xì)胞株，其特征在于，該細(xì)胞是PK15細(xì)胞經(jīng)PCV2突變株感染篩選獲得，該細(xì)胞可穩(wěn)定培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)2-5天后細(xì)胞發(fā)生可視輕微病變，但不致細(xì)胞凋亡，該細(xì)胞是GY-PCV2-PK15細(xì)胞株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2016201。

GY-PCV2-PK15細(xì)胞株是將豬圓環(huán)病毒突變株P(guān)CV2與豬腎細(xì)胞PK15共培養(yǎng)篩選獲得，該細(xì)胞具有穩(wěn)定培養(yǎng)的生長(zhǎng)特征；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)2-5天后細(xì)胞發(fā)生可視輕微病變，但不致細(xì)胞凋亡；可連續(xù)產(chǎn)生病毒PCV2.

本發(fā)明公開了篩選獲得GY-PCV2-PK15細(xì)胞株的方法，該方法包括下列步驟：

（1）將從CCTCC購(gòu)買的GDC061豬腎細(xì)胞系PK15至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；

（2）接種PCV2突變株至豬腎細(xì)胞系PK15，培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去上清液，用3mmol的D-氨基葡萄糖PBS溶液處理細(xì)胞2小時(shí)，棄去D-氨基葡萄糖PBS溶液，用PBS洗滌細(xì)胞5次。換維持液培養(yǎng)染毒后的細(xì)胞72小時(shí)后，取上清，用PCV2特異性熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒測(cè)定其中PCV2，當(dāng)測(cè)定CT值低于或等于陽性對(duì)照的CT值時(shí)，證明此時(shí)的PK-15細(xì)胞已經(jīng)攜帶PCV2的PK-15混合細(xì)胞；

（3）用胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)基中和，離心，用培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度在1-10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul細(xì)胞懸液，培養(yǎng)3日后，在顯微鏡下觀察，留下只有單個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）將培養(yǎng)基更換成維持液，以單個(gè)細(xì)胞克隆培養(yǎng)過程中是否出現(xiàn)“拉網(wǎng)式”病變作為病毒是否出現(xiàn)感染的選擇指標(biāo)進(jìn)行目標(biāo)克隆篩選。單個(gè)細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，按照1：2比例傳代細(xì)胞，新傳代的細(xì)胞分別接種于2塊不同的新培養(yǎng)板中，做好對(duì)應(yīng)編號(hào)標(biāo)記，當(dāng)2塊培養(yǎng)板中的細(xì)胞均已長(zhǎng)滿細(xì)胞孔，其中1塊板的細(xì)胞繼續(xù)傳代，另1塊板，將其細(xì)胞培養(yǎng)基更換成維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)拉網(wǎng)式病變，將那些出現(xiàn)病變的細(xì)胞連同上清液凍融3次，反復(fù)吹吸均勻后取樣，用病毒DNA提取專用試劑盒提取DNA，以PCV2熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒作PCV2的定量PCR檢測(cè)，留下CT值最小的對(duì)應(yīng)編號(hào)的細(xì)胞繼續(xù)傳代，直至選擇到CT值最小而細(xì)胞又能穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆，其中一株細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代，且可大量產(chǎn)生PCV2病毒，此細(xì)胞株命名為GY-PCV2-PK15細(xì)胞株。本發(fā)明將GY-PCV2-PK15細(xì)胞株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2016201。保藏日是2016年12月5日。

本發(fā)明還公開了大量制備豬圓環(huán)病毒的方法。該方法包括下列步驟：

1)用常規(guī)方法接種培養(yǎng)GY-PCV2-PK15細(xì)胞株至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層

2)用維持液更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2-5天；

3)在顯微鏡下或逆光下觀察，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)式病變；

4)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為PCV2病毒液；

5)對(duì)貼壁細(xì)胞消化傳代，重復(fù)1-4，再次獲得PCV2病毒液。

本發(fā)明還公開了新的豬圓環(huán)病毒和細(xì)胞株在培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明也公開了豬圓環(huán)病毒PCV2在預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：于現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、病毒效價(jià)的大幅度提高：現(xiàn)有報(bào)道的培養(yǎng)PCV2技術(shù)較高水平，在使用D-氨基葡萄糖處理的情況下，其病毒效價(jià)也只達(dá)到10^-5.5-10^-6，本發(fā)明只需直接培養(yǎng)GY-PCV2-PK-15細(xì)胞，即可獲得效價(jià)為10^-6.5-10^-7的病毒效價(jià)。

2、產(chǎn)毒細(xì)胞有明顯可視的病變特征，這是我們判斷培養(yǎng)物中是否已經(jīng)開始產(chǎn)生病毒提供了極大的方便，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法由于產(chǎn)毒狀態(tài)和不產(chǎn)毒狀態(tài)細(xì)胞外型無區(qū)別，只有依靠反復(fù)取樣檢測(cè)才能確定收毒時(shí)間，這將大大增加成本，也增加污染風(fēng)險(xiǎn)。

3、培養(yǎng)工藝的大幅度簡(jiǎn)化。本發(fā)明只需直接培養(yǎng)細(xì)胞就可獲得高效價(jià)病毒，而現(xiàn)行技術(shù)，每批次培養(yǎng)病毒必須經(jīng)歷接種病毒、D-氨基葡萄糖的產(chǎn)毒誘導(dǎo)劑處理等一系列繁瑣的程序，每個(gè)程序，都需要將培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)液體更換掉。因此本發(fā)明不僅減少了操作環(huán)節(jié)，而且大幅度降低原料投入和廢棄物的產(chǎn)生量，具有極顯著的降低生產(chǎn)培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。

附圖說明

圖1是GY-PCV2-PK15細(xì)胞株形態(tài)圖

圖2 是正常豬腎細(xì)胞PK15形態(tài)圖

圖3是GY-PCV2-PK15細(xì)胞株免疫熒光顯示圖

圖4是GY-PCV2-PK15 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖5是GY-PCV2-PK15培養(yǎng)時(shí)病毒PCV2生產(chǎn)曲線

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1 生物材料來源，保藏及培養(yǎng)基

豬腎細(xì)胞系PK15 來源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC GDC061，研究者可從CCTCC購(gòu)買

PCV2病毒來源于自主分離，篩選的豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

GY-PCV2-PK15保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)是CCTCC NO：C2016201，保藏日期是2016年12月5日。

培養(yǎng)基MEM+10%FBS+1%雙抗, 維持液MEM+2%FBS+1%雙抗

實(shí)施例2：豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株的分離和測(cè)序

（1）無菌操作取下已有明顯臨床癥狀的為患豬圓環(huán)病毒病的病豬的腹股溝淋巴結(jié)，用含2萬單位/ml的青霉素和200ug/ml的鏈霉素混合液洗滌7次以上，并搗成均漿，離心，過慮除菌獲得病料液；

（2）將病料液與含2%血清的DMEM維持培養(yǎng)基1:1混合；

（3）接種混合液至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞上進(jìn)行感染；

（4）感染并培養(yǎng)24小時(shí)后棄去接種液，加少許3mM的D-氨基葡萄糖鋪蓋細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，PBS洗滌5次，加入2%血清的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)。

（5）培養(yǎng)72小時(shí)后，取上清液，用PCV2專用PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，留下陽性表現(xiàn)最強(qiáng)的細(xì)胞繼續(xù)盲傳5代，收獲第5代上清液，4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，再次病毒測(cè)定確證為強(qiáng)陽性后收集，凍干保存或直接液氮凍存；

（6）將上述收獲的病毒液送商業(yè)化測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，所用引物是

SEQ NO：2 AGGCCTACGTGGTCTACATTTC（pcv2-F1）

SEQ NO：3 GACTCAGTAATTTATTTCATAT（pcv2-R1）

SEQ NO：4 CTACTCCTCCCGCCATACAA（pcv2-F）

SEQ NO：5 TACTCCTCAACTGCTGTCCC（pcv2-F）

測(cè)序結(jié)果見SEQ ID NO:1所示，從SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列與現(xiàn)有PCV2基因序列相比以現(xiàn)，該病毒基因組與所有現(xiàn)已報(bào)道的毒株基因組序列99%吻合，與最接近的基因組比對(duì)發(fā)生了至少9個(gè)堿基突變。9個(gè)堿基突變點(diǎn)位分別是08C>G，365T>C ， 465T>C，1132T>C，1192G>A，1457A>G，1547C>T，1588T>G，1720C>T

證明其為PCV2的一個(gè)新突變株，命名為GY-PCV2。

GY-PCV2株基因序列與經(jīng)典株比對(duì)的突變位點(diǎn)

89A>T 110G>T 152G>T 155C>T 161C>A 167G>A 224T>C

254A>G 308C>G 317T>A 338T>C 365T>C 368A>G 381C>A

389A>G 551C>T 716G>C 725C>T 872C>T 1018T>G 1035T>A

1106G>T 1157C>T 1165T>C 1168A>C 1169G>A 1178C>T 1187A>C

1195C>T 1196C>T 1205A>G 1232G>A 1235A>T 1238A>G 1241G>A

1250T>G 1253G>A 1259A>G 1280T>C 1285G>T 1286G>T 1289T>G

1316T>G 1328T>G 1329T>A 1334A>T 1335T>G 1338A>G 1345G>T

1374G>C 1391A>G 1406G>C 1436T>C 1458A>G 1463T>C 1465T>C

1470A>C 1471T>G 1472T>G 1473T>G 1474T>G 1478G>T 1480T>A

1481C>G 1490C>T 1498C>G 1505G>A 1507C>T 1510G>T 1514A>G

1548C>T 1549C>T 1558A>T 1559G>C 1560C>G 1567C>T 1625A>G

1631G>A 1709T>C 1721C>T 1737G>T

（7）GY-PCV2突變株攻毒檢測(cè)

選取6頭體重約為20kg的杜長(zhǎng)大仔豬，分為2組，攻毒組每注射5mlGY-PCv2病毒液，對(duì)照組每頭注射5ml的生理鹽水，在本所凈化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房分欄飼養(yǎng)觀察2個(gè)月，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有參試豬均取腹股溝淋巴結(jié)，按照步驟（5）進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，并分別將培養(yǎng)收獲物送基因測(cè)序公司進(jìn)行PCV2的全基因組測(cè)序

結(jié)果：觀察28天后，攻毒組3頭豬只相繼出現(xiàn)典型的豬圓環(huán)病毒病癥狀，其腹股溝淋巴結(jié)分離培養(yǎng)物經(jīng)PCV2測(cè)序，其全基因組序列與GY-PCV2完全吻合。而對(duì)照組3頭豬只既無疫病癥狀，其培養(yǎng)物測(cè)序也未測(cè)出PCV2的存在。

具體結(jié)果見表1

（8）GY-PCV2突變株免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)

將步驟（5）收獲的GY-PCV2病毒液按照同步接種方法接種于PK-15細(xì)胞，鋪板于96孔培養(yǎng)板中，未接種的PK-15細(xì)胞做對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)后用D-氨基葡萄糖處理2小時(shí)，洗滌后用維持液培養(yǎng)72小時(shí)，固定細(xì)胞，用豬抗PCV2抗體做為一抗、羊抗豬熒光標(biāo)記抗體作為二抗，進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)

結(jié)果：接種GY-PCV2突變株的細(xì)胞孔呈強(qiáng)免疫熒光反應(yīng)，具體結(jié)果見圖3，而對(duì)照細(xì)胞無免疫熒光反應(yīng)，說明GY-PCV2具有PCV2免疫源性。

（9）對(duì)已獲得的病毒連續(xù)培養(yǎng)20代，收獲第20代病毒液，送基因測(cè)序公司測(cè)定病毒的全基因組序列。測(cè)定結(jié)果與步驟（6）的全基因組序列100%吻合，說明該P(yáng)CV2突變株有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。

本發(fā)明將豬圓環(huán)病毒GY-PCV2株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:V201660。保藏日是2016年12月5日。

實(shí)施例3.產(chǎn)PCV2病毒的PK15細(xì)胞篩選與獲得

（1）將從CCTCC購(gòu)買的GDC061豬腎細(xì)胞系PK15至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；

（2）接種PCV2突變株至豬腎細(xì)胞系PK15，培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去上清液，用3mmol的D-氨基葡萄糖PBS溶液處理細(xì)胞2小時(shí)，棄去D-氨基葡萄糖PBS溶液，用PBS洗滌細(xì)胞5次。換維持液培養(yǎng)染毒后的細(xì)胞72小時(shí)后，取上清，用PCV2特異性熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒測(cè)定其中PCV2，當(dāng)測(cè)定CT值低于或等于陽性對(duì)照的CT值時(shí)，證明此時(shí)的PK-15細(xì)胞已經(jīng)攜帶PCV2的PK-15混合細(xì)胞；

（3）用胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)基中和，離心，用培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度在1-10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200ul細(xì)胞懸液，培養(yǎng)3日后，在顯微鏡下觀察，留下只有單個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔，繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）將培養(yǎng)基更換成維持液，以單個(gè)細(xì)胞克隆培養(yǎng)過程中是否出現(xiàn)“拉網(wǎng)式”病變作為病毒是否出現(xiàn)感染的選擇指標(biāo)進(jìn)行目標(biāo)克隆篩選。單個(gè)細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，按照1：2比例傳代細(xì)胞，新傳代的細(xì)胞分別接種于2塊不同的新培養(yǎng)板中，做好對(duì)應(yīng)編號(hào)標(biāo)記，當(dāng)2塊培養(yǎng)板中的細(xì)胞均已長(zhǎng)滿細(xì)胞孔，其中1塊板的細(xì)胞繼續(xù)傳代，另1塊板，將其細(xì)胞培養(yǎng)基更換成維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)拉網(wǎng)式病變，將那些出現(xiàn)病變的細(xì)胞連同上清液凍融3次，反復(fù)吹吸均勻后取樣，用病毒DNA提取專用試劑盒提取DNA，以PCV2熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒作PCV2的定量PCR檢測(cè)，留下CT值最小的對(duì)應(yīng)編號(hào)的細(xì)胞繼續(xù)傳代，直至選擇到CT值最小而細(xì)胞又能穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆，其中一株細(xì)胞株可穩(wěn)定傳代，且可大量產(chǎn)生PCV2病毒，此細(xì)胞株命名為GY-PCV2-PK15細(xì)胞株。本發(fā)明將GY-PCV2-PK15細(xì)胞株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2016201。保藏日是2016年12月5日。

實(shí)施例4 GY-PCV2-PK15細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)毒性能測(cè)試：

（1）常規(guī)方法解凍GY-PCV2-PK15細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至所需數(shù)量，取其中部分細(xì)胞用于細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)試，部分細(xì)胞用于產(chǎn)毒性能測(cè)試。

（2）對(duì)照組細(xì)胞處理：常規(guī)方法解凍PK-15細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至所需數(shù)量，取其中部分細(xì)胞用于細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)試，部分細(xì)胞用于產(chǎn)毒性能測(cè)試。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)試：GY-PCV2-PK15和對(duì)照PK15細(xì)胞均按常規(guī)方法進(jìn)行。

產(chǎn)毒能力測(cè)試：

GY-PCV2-PK15細(xì)胞組：隨機(jī)抽取步驟（1）培養(yǎng)的GY-PCV2-PK15細(xì)胞3批次，取用維持液培養(yǎng)72小時(shí)的上清液進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。

普通PK細(xì)胞D-氨基葡萄糖處理組：隨機(jī)抽取步驟（2）培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞3批次，常規(guī)方法接種病毒24小時(shí)后，用3mM的D-氨基葡萄糖PBS溶液處理細(xì)胞2小時(shí)，用PBS洗滌5次，維持液培養(yǎng)72小時(shí)，取上清液，進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。

普通PK細(xì)胞無D-氨基葡萄糖處理組：隨機(jī)抽取步驟（2）培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞3批次，常規(guī)方法接種病毒24小時(shí)后，更換維持液培養(yǎng)72小時(shí)，取上清液，進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。

產(chǎn)毒曲線測(cè)試：取步驟（1）培養(yǎng)的GY-PCV2-PK15細(xì)胞3瓶，將其培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在第12、24、36、48、60、72、84、96、108小時(shí)取200ul上清，提取病毒DNA，熒光定量PCR試劑盒測(cè)定個(gè)時(shí)間段病毒DNA的相對(duì)含量，并以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)、定量PCR測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)制作產(chǎn)毒曲線。

免疫熒光測(cè)試：以豬抗PCV2高免血清為一抗，以兔抗豬免疫球蛋白熒光標(biāo)記抗體為為二抗，按常規(guī)方法對(duì)固定于96孔培養(yǎng)板中的GY-PCV2-PK15細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測(cè)試

結(jié)果：

①GY-PCV2-PK15細(xì)胞拉網(wǎng)式病變顯微照片見圖1，正常生長(zhǎng)的PK細(xì)胞顯微照片見圖2

②免疫熒光測(cè)定效果見圖3

③GY-PCV2-PK15生長(zhǎng)曲線見圖4，

④三組細(xì)胞的產(chǎn)毒能力比較，見表2

⑤GY-PCV2-PK15細(xì)胞的產(chǎn)毒曲線見圖5

實(shí)施例5：GY-PCV2-PK-15細(xì)胞批量培養(yǎng)PCV2的應(yīng)用

（1）按常規(guī)方法分三批次解凍GY-PCV2-PK15細(xì)胞，傳代培養(yǎng)至所需數(shù)量

（2）所有細(xì)胞最后一次傳代后培養(yǎng)24小時(shí)，更換培養(yǎng)基為含2%血清的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)

（3）顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)式病變時(shí)，收集上清液，4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清液，此上清液即為GY-PCV2病毒液。

（4）測(cè)定病毒效價(jià)，作好記錄，留存病毒液備用。

結(jié)果

三批次培養(yǎng)的病毒液，其病毒效價(jià)見表3

實(shí)施例6：GY-PCV2-PK15細(xì)胞培養(yǎng)PCV2制備疫苗的應(yīng)用

（1）將實(shí)施例4中培養(yǎng)的PCV2病毒液，按照常規(guī)方法滅活并配制成三批次PCV2滅活疫苗。

（2）選取市售公認(rèn)品質(zhì)較好的某品牌PCV2滅活疫苗三個(gè)批次樣作為對(duì)照疫苗。

（3）另以注射用水作為空白組

（4）上述實(shí)驗(yàn)組合對(duì)照組個(gè)批次疫苗分別免疫3頭PCV2陰性豬，空白組也同步注射3頭豬，共21頭參試豬。

（5）免疫21天后，前腔靜脈采血，分離血清，用市售PCV2抗體E-Lisa檢測(cè)試劑盒測(cè)定各血清樣品PCV2抗體效價(jià)

結(jié)果

各組免疫豬21天，血清抗體水平見表4

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢市工程科學(xué)技術(shù)研究院

武漢市工程科學(xué)技術(shù)研究院

武漢市工程科學(xué)技術(shù)研究院

<120> 新的豬圓環(huán)病毒及其共培養(yǎng)細(xì)胞株

<130> 新的豬圓環(huán)病毒及其共培養(yǎng)細(xì)胞株

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> 豬圓環(huán)病毒PCV2

<400> 1

accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60

agaagaatgg aagaagcgga ccccaacccc ataaaaggtg ggtgttcact ctgaataatc 120

cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg atcttccaat atccctattt gattatttta 180

ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240

ttgtgaagaa gcagactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300

agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggcaacttac 360

tgatcgagtg tggagctcct agatctcagg gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420

gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480

tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540

attggaagac taatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600

ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660

atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccctggg 720

atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780

tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840

cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tttatcggag gattacttcc ttggtatttt 900

ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960

catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020

ttttattatt cattaagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080

atacatggtt acacggatat tgtattcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc 1140

gaggcctacg tggtctacat ttccagcagt ttgtagtctc agccacagct gatttctttt 1200

gttgtttggt tggaagtaat caatagtgga atctaggaca ggtttggggg taaagtagcg 1260

ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320

ataggtgagg gctgtggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cactggagcc 1380

cactcccctg tcaccctggg tgatcgggga gcagggccag aattcaacct taacctttct 1440

tattctgtag tattcagagg gcacagagcg ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500

gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag ggcgttttga ctgtggttcg 1560

cttgatagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620

ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag 1680

atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctt cttggatacg tcatatctga 1740

aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 豬圓環(huán)病毒PCV2

<400> 2

aggcctacgt ggtctacatt tc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 豬圓環(huán)病毒PCV2

<400> 3

gactcagtaa tttatttcat at 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 豬圓環(huán)病毒PCV2

<400> 4

ctactcctcc cgccatacaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 豬圓環(huán)病毒PCV2

<400> 5

tactcctcaa ctgctgtccc 20