本發(fā)明涉及以原核表達的MDR-1蛋白免疫小鼠獲得的分泌MDR-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株6C6，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)抗藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶位各異的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細胞產(chǎn)生MDR是化療失敗的重要原因，臨床上許多腫瘤患者因此對化療藥物不敏感，導致化療效果差和腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移。MDR受多因素、多機制調(diào)控，主要表現(xiàn)為降低化療藥物的內(nèi)流、減少細胞內(nèi)藥物的積聚、增加能量依賴性的藥物主動外排、增強DNA的修復活性、加強細胞解毒系統(tǒng)的作用和阻礙藥物引起的凋亡等因素。

目前對多耐藥（MDR）研究最多的基因是MDR-1基因。人類MDR-1基因位于7號染色體長臂上，包含28個內(nèi)含子，其中26個位于蛋白編碼序列區(qū)。MDR-1基因編碼分子量為17kDa的跨膜糖蛋白，P-糖蛋白（P-glyco-protein），簡稱P-gp。P-gp為ABC蛋白家族成員之一，由1280個氨基酸組成，包含2個同源單體，是MDR-1的主要抗原蛋白，含有在MDR-1間高度保守的抗原決定簇。腫瘤細胞出現(xiàn)MDR的一個主要機制是MDR-1基因及其調(diào)控的P-gp增多，P-gp具有將進入細胞內(nèi)的作用底物，包括化學物質(zhì)和藥物等主動泵出細胞外的功能，使細胞內(nèi)藥物濃度始終保持在非殺傷水平，由此形成耐藥。

結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、非小細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等實體瘤是容易產(chǎn)生MDR的惡性腫瘤，這些腫瘤的細胞常有P-gp的高度表達。急性淋巴性白血病、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤細胞常對化療藥物敏感，但是一段時間用藥后又會產(chǎn)生耐藥性，表現(xiàn)為P-gp表達上調(diào)。化療是大部分腫瘤的重要治療方法之一，而腫瘤細胞產(chǎn)生的多藥耐藥是臨床化療的一大障礙。幾乎所有腫瘤細胞均有不同程度上的MDR/P-gp的表達，但是其中對化療藥物不敏感或療效差的腫瘤往往會有較高的MDR-1基因表達。多數(shù)研究認為，MDR-1/P-gp的表達與腫瘤對化療的敏感性呈負相關(guān)，由此認為MDR-1基因表達與化療療效不佳有關(guān)，MDR-1基因表達水平也成為篩選腫瘤多耐藥逆轉(zhuǎn)劑的一個重要指標。MDR-1單克隆抗體應(yīng)用于檢測該基因表達水平對臨床化療具有指導意義。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種MDR-1的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的MDR-1的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測MDR-1表達的小鼠抗人MDR-1單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

（1）根據(jù)MDR-1的基因序列（NM_000927.4）的編碼框，設(shè)計一對特異引物，Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增MDR-1基因，構(gòu)建重組表達載體PET28a- MDR-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原。

（2）采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)制備MDR-1單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA 法測定純化抗體的滴度。

（3）通過免疫組織化學分析MDR-1單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。

（4）根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體MDR-1重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體MDR-1的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。

本發(fā)明提供的以原核表達的MDR-1蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌MDR-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，名稱為6C6，分類命名為小鼠抗人MDR-1雜交瘤細胞系，該細胞株已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏編號為CGMCC No. 6917。

本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株6C6，CGMCC No. 6917產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:10。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明應(yīng)用重組人的MDR-1蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠, 采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)，通過ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗MDR-1的雜交瘤細胞株，命名為6C6，亞型鑒定為IgG1，將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對MDR-1單抗進行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上；ELISA 滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蠟切片經(jīng)抗MDR-1抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到呈均勻著色的棕黃色顆粒，定位于胞漿，背景清晰，無非特異性著色。從實驗結(jié)果上來看，本發(fā)明制備了高效價，高特異性的MDR-1單克隆抗體，用該抗體檢測證實，其對細胞中的MDR-1蛋白具有高識別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測MDR-1表達。

附圖說明

圖1 SDS-PAGE 分析純化后的MDR-1單克隆抗體。

圖2 ELISA 法測定MDR-1單克隆抗體滴度。

圖3是免疫組織化學檢測分析MDR-1單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。

實施例1：雜交瘤細胞株6C6及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得

1、抗原制備

（1）獲得目的基因

在該實施例中，根據(jù)MDR-1的基因序列（NM_000927.4）的編碼框，設(shè)計1對特異引物：

引物1 ：5'-ATAGGATCC ATGGATCTTGAAGGGGAC-3' (SEQ ID NO:1)

引物2 ：5'-CTCGAG TCACTGFCGCTTTGTTCCAG-3'；(SEQ ID NO:2)

Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增MDR-1基因。

（2）構(gòu)建重組表達載體

將步驟（1）獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4 DNA連接酶作用下連接入表達載體PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-MDR-1。

（3）獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

將步驟（2）獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的

固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

（4）誘導表達和蛋白純化

將步驟（2）提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220rpm培養(yǎng)10h，取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入0.2mM IPTG誘導表達，16℃誘導過夜，收集菌液超聲，取上清用Ni-NTA瓊脂糖親和層析法純化MDR-1蛋白。

2、單抗的制備和純化

(1)、免疫動物

一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行三次免疫注射。

首次免疫。純化的重組蛋白MDR-1（用適量生理鹽水稀釋）+完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點注射；

二次免疫（間隔兩周）。純化的重組蛋白MDR-1（用適量生理鹽水稀釋）+不完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點注射；

三次免疫（間隔兩周）。純化的重組蛋白MDR-1（用適量生理鹽水稀釋），不完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點注射；

三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法檢測效價，選擇效價最高者用于細胞融合。

加強免疫（融合前3天），用純化的重組蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾臟融合。

(2)、細胞融合

采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進行雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。

用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清：以純化的MDR-1蛋白（10μg/ml）包被酶標板，每孔100μl，4℃包板過夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脫脂奶粉，37℃封閉1h后，洗滌3次，加雜交瘤細胞培養(yǎng)檢測上清100μl（陰性對照為PBS 100μl），37℃孵育1小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗MDR-1雜交瘤細胞株，命名為6C6，亞型鑒定為IgG1。

將選出的陽性雜交瘤細胞株6C6克隆化培養(yǎng)（有限稀釋法），獲得能產(chǎn)生高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人MDR-1雜交瘤細胞系6C6，該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6917。

(3)單克隆抗體的大量制備與純化

將步驟（2）獲得的細胞株6C6接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。

單克隆抗體MDR-1的純化：采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗MDR-1的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液（PH）洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。

(4) 直接ELISA 法測定純化抗體的滴度

以純化的MDR-1蛋白（10μg/ml）包被酶標板，每孔100μl，4℃包板過夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脫脂奶粉，37℃封閉1h后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800進行稀釋，以每孔100μl 加入酶標板中（陰性對照為PBS 100μl），37℃孵育1小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA 滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上（參見圖2）。

實施例2：單克隆抗體免疫組化應(yīng)用檢測

用MDR-1單抗，按常規(guī)法作病理切片，對人乳腺癌石蠟切片進行免疫組化染色。

具體方法為：

(1) 脫蠟

切片依次置于二甲苯I、II、III脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇I、II中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。

(2) 抗原修復

將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復液（pH6.0），高火加熱煮沸后調(diào)至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關(guān)掉電磁爐開關(guān)，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內(nèi)抗原修復液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。

(3) 阻斷

3%H₂O₂中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。

(4) 滴加一抗

甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實施例1步驟（3）制備并純化的MDR-1單克隆抗體，稀釋度為1 : 600。放置在孵育盒內(nèi)4℃冰箱中過夜孵育約12小時。

(5) 滴加二抗

將孵育盒從冰箱取出，恢復至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37℃恒溫箱中孵育30分鐘。

(6) 顯色、襯染、封片

取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3～5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強度。待強度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5-10分鐘，蘇木素染液復染1分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5-10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。

結(jié)果判定:按照國外學者對組織中MDR-1的判定標準，MDR-1蛋白陽性反應(yīng)為出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒，定位于胞漿。人乳腺癌組織（參見圖3）經(jīng)抗MDR-1抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到呈均勻著色的棕黃色顆粒，定位于胞漿，背景清晰，無非特異性著色，說明此MDR-1小鼠單克隆抗體可以特異性的應(yīng)用于免疫組織化學實驗。

實施例3：單克隆抗體可變區(qū)測序

根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物：

zh09 5'-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3'　 　(SEQ ID NO:3)

zhr11 5'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' 　 　(SEQ ID NO:4)

zl01 　5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' 　 　(SEQ lD NO:5)

zlr05　5'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQ ID NO:6)

Trizol Reagent試劑分別提取5×10⁶雜交瘤細胞6C6的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用zh08和zhr11為引物進行PCR擴增單克隆抗體MDR-1重鏈可變區(qū)，用zl01和zlr05為引物進行PCR擴增單克隆抗體MDR-1輕鏈可變區(qū)，PCR反應(yīng)均采用熱啟動，反應(yīng)條件:94℃ 5分鐘；94℃ 45 秒，60℃ 45 秒，72℃ 1分10 秒，30個循環(huán)；72℃ 7 分鐘。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段（輕鏈長度391 bp，重鏈長度420 bp）?？寺〉絧GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后在 IPTGIX-gal平板上進行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中擴增。篩選陽性克隆，用 QIAGEN 的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進行測序，確定了單克隆抗體MDR-1的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。

單克隆抗體MDR-1可變區(qū)的 DNA 序列和氨基酸序列：

單克隆抗體MDR-1重鏈可變區(qū)DNA序列(5'→3'，409bp) (SEQ ID NO:7)；

單克隆抗體MDR-1的輕鏈可變區(qū)DNA序列(5'→3'，390bp) (SEQ 1D NO:8)；

單克隆抗體MDR-1重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列 (136氨基酸) (SEQ ID NO:9)；

單克隆抗體MDR-1輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(129 氨基酸) (SEQ 10 ID NO:10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津三箭生物技術(shù)股份有限公司

<120> 小鼠抗人MDR-1單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株

<130> DNA

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

ataggatcca tggatcttga aggggac 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ctcgagtcac tggcgctttg ttccag 26

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gachgatggg gstgtygtgc tagctgnrga gacdgtga 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctat 38

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

ggatacagtt ggtgcagtcg acttacgttt katttccarc tt 42

<210> 7

<211> 409

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

aggtaaattg atacaactac tctgttctga gaggctcatc acacagacgt aatacatggc 60

cgtgtcctca gacctcagac tgctcattag caggtacagg atgttcctgg cattatctct 120

ggagatggtg aatcggccct tcacactgtc tggatagtag gtactaccac caccaccact 180

actaatagat gcgacccact ccagcctctt ctctggagtc tggcgaaccc aagacatggc 240

atagttactg aaagtgaatc cagaggctgc acaggagagt ttcagggacc ctccaggctt 300

cactaagcct cccccagact ccaccagctt cacttcacac tggacacctt ttaaaacaag 360

gacaaggaaa acccagctca acccgaagtt catggtggat atccccaag 409

<210> 8

<211> 390

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

gggcgttccc ccctccgacg tgtaagctcc ctaatgtgct gacagtaata ggttgcagca 60

tcctcctcct ccacaggatg gatgttgagg gtgaagtctg tcccagaccc actgccactg 120

aacctggcag ggaccccaga ttctaggttg gatacaagat agatgaggag tctgggtggc 180

tgtcctggtt tctgttggtt ccagtgcata taactatagc cagatgtact gacacttttg 240

ctggccctgt atgagatggt ggccctctgc cccagagata cagctaagga agcaggagac 300

tgtgtcagca caatgtcacc agtggaacct ggaacccaga gcagcagtac ccatagcagg 360

agtgtgtctg tctccatggt ggatatcccc 390

<210> 9

<211> 136

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Leu Gly Ile Ser Thr Met Asn Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val

1 5 10 15

Leu Val Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala

35 40 45

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Leu Met Ser Ser Leu Arg

100 105 110

Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Val Cys Val Met Ser Leu Ser Glu

115 120 125

Gln Ser Ser Cys Ile Asn Leu Pro

130 135

<210> 10

<211> 129

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Gly Ile Ser Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu

1 5 10 15

Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg

35 40 45

Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Arg Arg Gly Glu

115 120 125

Arg