本發(fā)明涉及一種單克隆細胞株及其抗體，具體的說是一種單克隆細胞株YH3及其產生的單克隆抗體和應用。

背景技術：

戊唑醇（Tebuconazole）又稱富力庫、立克秀，屬于高效、廣譜、內吸性的三唑類殺菌劑，具有保護、治療和鏟除3大功能，由于戊唑醇的優(yōu)良性能和獨特的作用機制，已被廣泛地用于果樹和蔬菜等大田作物上銹病、白粉病、網斑病、根腐病、赤霉病、黑穗病、紋枯病菌及種傳輪斑病等病害的防治。然而，戊唑醇殺菌劑的性質穩(wěn)定、半衰期長，具有內吸性，易殘留在農產品和環(huán)境中。同時研究認為，戊唑醇對肝臟與血液系統(tǒng)有一定的蓄積毒性，對水生生物有一定的潛在毒性，還是一種非遺傳毒性的動物致癌物，故長期攝入或接觸戊唑醇會對人類健康產生威脅。因此，戊唑醇的殘留檢測越來越受到廣泛關注。

現(xiàn)已用于戊唑醇殘留檢測的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用法和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法。這些儀器分析方法的靈敏度高，準確性和重現(xiàn)性好，但這些儀器價格昂貴、檢測費用高、樣品前處理復雜、耗時長和需要專業(yè)人員操作等缺點，無法滿足大批量樣品快速篩查的需求，尤其是現(xiàn)場快速檢測的任務，迫切需要開發(fā)出一種高效快速的檢測新技術。近年來，免疫分析方法在農藥殘留分析中得到了廣泛應用，其中酶聯(lián)免疫分析法具有操作簡單、靈敏、低成本和高通量的優(yōu)點。膠體金免疫層析試紙法具有快速、簡便、廉價和現(xiàn)場快速篩選的優(yōu)勢。

目前，國外已有測定谷物中戊唑醇殘留的酶聯(lián)免疫分析法。2001年 C.Danks，M. Q. Chaudhry , L. Parker , I. Barker andJ. N. Banks 等在《Food and Agricultural Immunology》發(fā)表了“Development and Validation of an Immunoassay for the Determination of Tebuconazole Residues in Creal Crops”（2001, 13, 151-159）, 該研究基于多克隆抗體建立了谷物中戊唑醇殘留檢測的競爭酶聯(lián)免疫分析法。該方法的檢測范圍0.02-20 mg/mL。目前，國內外都沒有關于戊唑醇單克隆抗體的制備報道。和多克隆抗體相比，單克隆抗體的制備技術復雜，費時費工，價格高；但是產生單克隆抗體的單克隆細胞株可以在體外“永久”地存活并傳代，可以“無限量”地生產高特異性、高均一性的抗體；單克隆抗體的靈敏度高、特異性強。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一株單克隆細胞株YH3，分類命名為單克隆細胞株，保藏編號為CGMCC No.12031，可用于制備抗戊唑醇單克隆抗體，分泌的戊唑醇單克隆抗體的特征在于靈敏度高，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為0.21±0.03 ng/mL；特異性強，與其結構類似物的交叉反應率低于3%。

所述的單克隆細胞株YH3所制備的抗戊唑醇單克隆抗體。

采用單克隆細胞株YH3制備的抗戊唑醇單克隆抗體的方法，包括以下步驟：

選擇健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌液體石蠟油0.6 mL。提前5天，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單克隆細胞株YH3。小鼠注射石蠟油10天后，向每只小鼠腹腔注射1×10⁶個單克隆細胞株YH3。當小鼠的腹部明顯增大，并用手觸摸時有緊繃感，同時小鼠還表現(xiàn)出不愿活動時，收集腹水，離心（6000 rpm，12 min），吸上清，分裝，-20°C凍存。

所述的單克隆細胞株YH3所制備的抗戊唑醇單克隆抗體，半數(shù)抑制濃度為0.21±0.03 ng/mL。

所述單克隆細胞株YH3所制備抗戊唑醇單克隆抗體在檢測果蔬中戊唑醇殘留中的應用。

將所述抗戊唑醇單克隆抗體應用于制備檢測果蔬中戊唑醇殘留的膠體金免疫層析試紙條。

將所述抗戊唑醇單克隆抗體應用于制備檢測果蔬中戊唑醇殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。

有益效果是：

本發(fā)明提供了一種新的單克隆細胞株YH3，所產生的單克隆抗體能夠用于建立戊唑醇殘留的酶聯(lián)免疫分析法和膠體金免疫層析試紙法，為保障我國農產品的質量安全提供了有力的保障。本發(fā)明的優(yōu)點在于由單克隆細胞株YH3分泌的戊唑醇單克隆抗體的特征在于靈敏度高，半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為0.21±0.03 ng/mL；特異性強，與其結構類似物的交叉反應率低于3%?？梢杂糜谘兄莆爝虼細埩魴z測的酶聯(lián)免疫試劑盒和膠體金免疫層析試紙條。

生物材料的保藏

一株單克隆細胞株YH3，保藏日期為2016年1月20日，保藏單位及其簡稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No.12031。

附圖說明

圖1是 戊唑醇單克隆抗體親和常數(shù)的測定結果圖；

圖2 是戊唑醇單克隆抗體靈敏度的測定結果圖；

圖3是膠體金免疫層析試紙條靈敏度的測定實例圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一株單克隆細胞株YH3及其分泌的抗戊唑醇單克隆抗體。實驗動物BALB/c小鼠購自河南科技大學醫(yī)學部動物中心。

（一）單克隆細胞株YH3的制備

1 、抗血清的制備

選擇8周齡的BALB/c小鼠為試驗動物，將免疫原和快免佐劑按照1:1比例通過注射器混合后，采用肌肉注射的方式進行免疫。免疫劑量為每只小鼠60 mg（以蛋白含量計），免疫間隔為2周，四免后8天，采用間接競爭酶聯(lián)免疫分析法測定抗血清的效價和抑制，選出效價高且抑制好的BALB/c小鼠進行融合。

2、 細胞融合前的準備

融合前7天，采用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基對SP2/0骨髓瘤細胞進行復蘇，換液時，改為用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。

融合前3天，戊唑醇免疫原通過腹腔注射的方式對融合小鼠進行沖免，要求免疫劑量減半且不含快免佐劑。

3、收集SP2/0骨髓瘤細胞

用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基在6孔板（或細胞培養(yǎng)瓶）中培養(yǎng)SP2/0骨髓瘤細胞，期間需要不斷擴大培養(yǎng)。在融合前1天，必須對SP2/0骨髓瘤細胞換液，以保證大部分SP2/0骨髓瘤細胞在融合時處于對數(shù)生長期，這一點對整個融合過程的成敗至關重要。同時要求SP2/0骨髓瘤細胞的總數(shù)要達到1.0-5.0×10⁷。否則，瘤細胞過少，將會降低融合率。融合前，將SP2/0骨髓瘤細胞收集到50 mL無菌離心管中，離心（1200 rpm，6 min），棄上清，取沉淀，再用RPMI 1640培養(yǎng)基進行重懸，計數(shù)，備用。

4、收集脾細胞

對融合使用的各種器械先采用濕熱滅菌法滅菌，然后在60°C下烘干，備用。事先在超凈工作臺上準備好融合器具，再處死融合小鼠，迅速放入裝有75% 酒精的燒杯中消毒，再小心放到超凈工作臺上，嚴格采用無菌操作技術取出BALB/c小鼠的脾臟，研磨，得到小鼠脾細胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌脾細胞3次，最后一次離心后，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸脾細胞，體積約10 mL，計數(shù)，備用。

5 、融合

按照常規(guī)融合方法將脾細胞和SP2/0 骨髓瘤細胞按照8:1比例混合，離心（1200 rpm，6 min），棄上清。用聚乙二醇1500（PEG1500）對小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。采用預熱的HAT培養(yǎng)基稀釋融合后的細胞，按照200 mL/孔注入到96孔細胞板。置于37°C，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6、 單克隆細胞的亞克隆和篩選

融合后5天采用HAT培養(yǎng)基進行半換液，融合后第8天采用HAT培養(yǎng)基全換液，第12天取細胞上清，采用間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選分泌戊唑醇抗體的單克隆細胞株，對所有陽性孔均采用有限稀釋法進行亞克隆，每個陽性孔亞克1塊96孔板。

重復4次亞克隆過程和間接競爭酶聯(lián)免疫分析法，得到一株能穩(wěn)定分泌戊唑醇單克隆抗體的單克隆細胞株YH3。

7 、單克隆細胞株YH3的凍存。

用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在6孔細胞板中培養(yǎng)單克隆細胞株YH3，隔天換液，估計細胞密度達到0.5-1.0×10⁵個/mL時，收集細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌1次，向離心管中加入凍存液重懸，再將其轉移到凍存管，放入凍存盒，置于超低溫冰箱（-80°C）中，1天后，將凍存管轉到液氮罐中長期保存。

（二）由單克隆細胞株YH3分泌的抗戊唑醇單克隆抗體的制備和亞型鑒定

1. 戊唑醇單克隆抗體的制備

選擇健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌液體石蠟油0.6 mL。提前5天，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單克隆細胞株YH3。小鼠注射石蠟油10天后，向每只小鼠腹腔注射1×10⁶個單克隆細胞株YH3。當小鼠的腹部明顯增大，并用手觸摸時有緊繃感，同時小鼠還表現(xiàn)出不愿活動時，收集腹水，離心（6000 rpm，12 min），吸上清，分裝，-20°C凍存。

2.單克隆抗體的純化

采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水。

3.亞型鑒定

采用洛陽佰奧通公司的單抗亞型鑒定試劑盒測定戊唑醇單克隆抗體的亞型，測定結果表明戊唑醇單克隆抗體的亞型為IgG。

實施例1單克隆細胞株YH3的制備

（一） 單克隆細胞株YH3的制備

1、 抗血清的制備

選擇8周齡的BALB/c小鼠為試驗動物，將免疫原和快免佐劑按照1:1比例通過注射器混合后，采用肌肉注射的方式進行免疫。免疫劑量為每只小鼠60 mg（以蛋白含量計），免疫間隔為2周，四免后8天，采用間接競爭酶聯(lián)免疫分析法測定抗血清的效價和抑制，選出效價高且抑制好的BALB/c小鼠進行融合。

2 、細胞融合前的準備

融合前7天，采用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基對SP2/0骨髓瘤細胞進行復蘇，換液時，改為用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。

融合前3天，戊唑醇免疫原通過腹腔注射的方式對融合小鼠進行沖免，要求免疫劑量減半且不含快免佐劑。

3、收集SP2/0骨髓瘤細胞 用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基在6孔板（或細胞培養(yǎng)瓶）中培養(yǎng)瘤細胞，期間需要不斷地擴大培養(yǎng)。在融合前1天，必須對SP2/0骨髓瘤細胞進行換液，以保證大部分SP2/0骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，這一點對整個融合過程的成敗至關重要。同時要求SP2/0骨髓瘤細胞的總數(shù)要達到1.0-5.0×10⁷。否則，瘤細胞過少，會降低融合率。融合前，將SP2/0骨髓瘤細胞收集到的50 mL無菌離心管中，離心（1200 rpm，6 min），棄上清，取沉淀，再用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，備用。

4、收集脾細胞 對融合使用的各種器械先采用濕熱滅菌法滅菌，然后在60°C下烘干，備用。事先在超凈工作臺上準備好融合器具，然后處死融合小鼠，迅速放入裝有75% 酒精的燒杯中消毒，再小心放到超凈工作臺上，嚴格采用無菌操作技術取出BALB/c小鼠的脾臟，研磨，得到小鼠脾細胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌脾細胞三次，最后一次離心后，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸脾細胞，體積約10 mL，計數(shù)，備用。

5 、融合 按照常規(guī)方法將脾細胞和SP2/0 骨髓瘤細胞按照8:1比例混合，離心（1200 rpm，6 min），棄上清；用聚乙二醇1500（PEG 1500）對脾細胞和SP2/0 瘤細胞進行融合。采用預熱的HAT培養(yǎng)基稀釋融合后的細胞，按照200 mL/孔注入到96孔細胞板。置于37°C，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6 、單克隆細胞的亞克隆和篩選

融合后5天采用HAT培養(yǎng)基進行半換液，第8天第二次采用HAT培養(yǎng)基全換液，第12天取細胞上清，采用間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選分泌戊唑醇抗體的單克隆細胞株。對所有陽性孔均采用有限稀釋法進行亞克隆。每個陽性孔亞克1塊96孔板。

重復4次亞克隆過程和間接競爭酶聯(lián)免疫法，得到一株能穩(wěn)定分泌戊唑醇單克隆抗體的單克隆細胞株YH3。

7 、單克隆細胞株YH3的凍存。

采用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在6孔板中培養(yǎng)單克隆細胞YH3，隔天換液，估計細胞密度達到0.5-1.0×10⁵個/mL時，收集細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌1次，向離心管中加入凍存液重懸，再將其轉移到凍存管，放入凍存盒，置于超低溫冰箱（-80°C）中，1天后，將凍存管轉到液氮罐中長期保存。

實施例2 由單克隆細胞株YH3分泌的戊唑醇單克隆抗體的制備和亞型鑒定。

1、戊唑醇單克隆抗體的制備

選擇健康的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無菌石蠟油0.6 mL。提前5天，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)單克隆細胞株YH3。小鼠注射石蠟油10天后，每只小鼠腹腔注射1′10⁶個單克隆細胞。每天觀察每只小鼠的活動狀態(tài)，當小鼠的腹部明顯增大時，并用手觸摸有緊繃感，同時小鼠還表現(xiàn)出不愿活動時，收集腹水，離心（6000 rpm，12 min），吸上清，分裝，-20°C凍存。

2、單克隆抗體的純化

采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水。

3、亞型鑒定

采用洛陽佰奧通公司的單抗亞型鑒定試劑盒測定戊唑醇單克隆抗體的亞型，測定結果表明戊唑醇單克隆抗體的亞型為IgG。

4、親和常數(shù)的測定

采用倍比稀釋法稀釋戊唑醇的包被原和多克隆抗體，包被原稀釋4個濃度，抗體稀釋8個濃度，每個濃度做5個平行，采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定單克隆抗體（mAb）的效價。然后以單克隆抗體濃度（mAb濃度，μg/mL）對數(shù)值為橫坐標，以吸光值（450nm）為縱坐標用origin 8.5軟件繪制出4條曲線，然后兩兩一組，根據(jù)下式計算單克隆抗體的親和常數(shù)（Ka）：

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)

其中，n為2個包被原濃度的比值（大于1）；[Ab’]t 和[Ab]t分別為對應最大吸光值（450nm）抑制一半時所對應的抗體濃度（mol/L）。

根據(jù)圖1的測定結果，計算出抗體的親和常數(shù)為4.25×10⁸ L/mol。

5、戊唑醇單克隆抗體靈敏度的測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫法（ic-ELISA）測定單克隆抗體對戊唑醇殺菌劑的抑制效果，選擇包被原-BSA濃度為0.5mg/mL，抗體的蛋白濃度為0.125mg/mL，測定結果用origin 8.5軟件進行四參數(shù)回歸擬合，結果見圖2。根據(jù)擬合的回歸方程，計算抗體的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）為0.21±0.03 ng/mL；標準曲線的線性范圍在1-10 ng/mL之間；檢測限達到了0.004 ng/mL。

實施例3 膠體金免疫層析試紙條檢測果蔬中戊唑醇殘留的應用

1、膠體金免疫層析試紙條靈敏度的測定

先用甲醇溶劑配制戊唑醇的標準品母液 1mg/mL，通過稀釋獲得一系列戊唑醇標準溶液：0 ng/mL, 1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，5 ng/mL，10 ng/ mL。測定戊唑醇膠體金免疫層析試紙條的消線值。試紙條插入樣液中10分鐘后，裸眼觀察膠體金免疫層析試紙條的測定結果，見圖3。該試紙條檢測戊唑醇的裸眼消線值（靈敏度）達到了2 ng/mL；由此可見，單克隆細胞株YH3分泌單克隆抗體可以用于農產品中戊唑醇殘留的篩選。

2、樣品預處理

稱取蘋果小塊樣品20.0 g，放入100 mL的離心管中，加入50 mL的乙腈，用勻漿機高速勻漿2分鐘，震蕩3分鐘，離心（4000 rpm, 5 min），取上清液，將其分成兩份，分別減壓旋蒸至干，一份用于氣相色譜-質譜聯(lián)用法的測定，用乙酸乙酯定容至5 mL。另一份用于膠體金免疫層析試紙條的測定，測定前用甲醇定容后，再用10%甲醇-磷酸鹽緩沖溶液稀釋后進行測定。

3、樣品的測定

采用膠體金免疫層析試紙條對20份蘋果樣品中戊唑醇含量進行測定。將試紙條插入樣液中，10-15分鐘后，肉眼觀察結果，30分鐘內的觀察結果有效。試紙條的測定結果如下：測定5號樣品的試紙條出現(xiàn)了測試線（T線）和控制線（C 線）2條紅色，且T線比C線的顏色淺，說明5號樣品中戊唑醇的含量低于2 ng/mL。測定其他蘋果樣品的試紙條僅在C線出現(xiàn)了一條紅線，說明這些樣品中的戊唑醇含量均超過了2 ng/mL。同時用氣相色譜-質譜聯(lián)用法對這20份蘋果樣品進行測定，測定結果如下：5號樣品中戊唑醇濃度為1.05 ng/mL；其他19份樣品中戊唑醇含量均遠高于2 ng/mL。由此可見，膠體金免疫層析試紙條和氣相色譜-質譜聯(lián)用法的測定結果相吻合。