本發(fā)明是關(guān)于一種后腎間充質(zhì)細(xì)胞系及其制備方法與應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明是關(guān)于一種使來自受孕動物胚胎或出生兩周齡以內(nèi)動物腎臟生腎區(qū)的后腎間充質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)Bmi1蛋白而得到的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系。

背景技術(shù)：

哺乳動物腎臟不僅是一個排泄器官，也是一個內(nèi)分泌器官，參與了機(jī)體代謝廢物的排出、水和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持等多種生理過程。一個具有正常功能的腎臟的形成依賴于腎臟內(nèi)多種類型細(xì)胞的協(xié)調(diào)發(fā)展。哺乳動物腎臟源自中胚層，依次形成前腎、中腎和后腎，后腎最終發(fā)育為成年腎臟。中胚層中osr+細(xì)胞是后腎的主要細(xì)胞成分，osr+細(xì)胞又分為Wolffian管和后腎間充質(zhì)(metanephric mesenchyme，MM)，Wolffian管向MM延伸形成輸尿管芽(ureteric bud，UB)標(biāo)志著后腎發(fā)育的開始。UB是上皮樣組織，其向MM的延伸導(dǎo)致圍繞在UB頂端的MM細(xì)胞聚集，形成帽狀間充質(zhì)(cap mesenchyme，CM)，二者之間的相互作用一方面引發(fā)了UB的進(jìn)一步分支和延伸，另一方面則誘導(dǎo)了CM細(xì)胞的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化，形成腎臟囊泡(renal vesicle，RV)。在機(jī)體多種機(jī)制的調(diào)控下，RV最終分化為腎小球、近端小管、髓襻和遠(yuǎn)端小管，遠(yuǎn)端小管與UB融合，UB則最終分化為集合管系統(tǒng)。MM中除了CM外還有血管前體細(xì)胞(可能分化為血管)和基質(zhì)前體細(xì)胞(分化為周細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎間質(zhì))。因此，在哺乳動物腎臟發(fā)育過程中MM細(xì)胞分化形成了成年腎臟的絕大部分結(jié)構(gòu)。而且，MM和UB之間的相互作用包含了多種發(fā)育生物學(xué)過程，包括上皮分支的形成、誘導(dǎo)組織之間的交叉對話、間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分化、細(xì)胞極性形成等。因此，腎臟已成為發(fā)育生物學(xué)研究過程中重要的模式器官。

腎臟發(fā)育過程及其機(jī)制的研究在小鼠等嚙齒類動物中已比較廣泛，小鼠后腎間充質(zhì)及其細(xì)胞的提取和培養(yǎng)也有報道。但是，不同物種腎臟的結(jié)構(gòu)和功能不完全一樣。與嚙齒類相比，豬的腎臟在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上與人更為相似。比如與大鼠、豚鼠等單乳頭腎臟動物相比，豬為多乳頭腎臟，且主要為短髓袢的腎單位，這一點(diǎn)與人類相似；豬的腎盂、輸尿管以及下尿道的尿動力學(xué)與人也極為相似。因此，研究豬等大動物的腎臟發(fā)育過程更具實(shí)際意義。研究發(fā)現(xiàn)，將豬的后腎移植到免疫缺陷大鼠體內(nèi)，可以形成具有完整功能的腎臟；另有研究表明，豬胚胎早期的腎臟前體細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)可分化為多種腎臟固有細(xì)胞，形成具有功能的腎單位，而且胚胎早期的細(xì)胞免疫原性低，移植排斥反應(yīng)小，在腎臟移植方面的應(yīng)用前景十分廣闊。即便如此，與小鼠等嚙齒類動物相比，關(guān)于豬的腎臟器官形成的研究仍然比較欠缺，其中很重要的限制因素就是研究材料的缺乏。因?yàn)樵诖祟愌芯恐行枰罅康呐吣I移植物和胚腎細(xì)胞，且需要在體外培養(yǎng)相當(dāng)一段時間，原代提取的胚腎和細(xì)胞在體外培養(yǎng)很容易衰老，壽命有限。因此，建立一種保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力的永生化的豬胚腎細(xì)胞系，將會成為研究腎臟發(fā)育和器官修復(fù)再生的有力工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力的永生化的胚腎細(xì)胞系，為研究腎臟發(fā)育和器官修復(fù)再生提供有力工具。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力的永生化的胚腎細(xì)胞系的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力的永生化的胚腎細(xì)胞系的應(yīng)用。

一方面，本發(fā)明提供了一種后腎間充質(zhì)細(xì)胞系，其中Bmi1基因或蛋白過表達(dá)。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系，其是來自受孕動物(例如中國實(shí)驗(yàn)用小型豬)胚胎或出生兩周齡以內(nèi)動物腎臟生腎區(qū)的原代胚腎細(xì)胞經(jīng)過表達(dá)Bmi1基因或蛋白而得到的。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系為永生化細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系為six2、pax2、gdnf、vimentin陽性，E-cadherin陰性的后腎間充質(zhì)細(xì)胞。同時，該細(xì)胞系表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105；此外，幾乎不表達(dá)CD11b、CD19、CD34和CD45。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力，具有向成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分化的能力。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系的制備方法，該方法包括：

使來自受孕動物胚胎或出生兩周齡以內(nèi)動物腎臟生腎區(qū)的原代胚腎細(xì)胞(后腎間充質(zhì)細(xì)胞，MMC)過表達(dá)Bmi1基因或蛋白，制得過表達(dá)Bmi1的所述后腎間充質(zhì)細(xì)胞系。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系的制備方法中，是通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式使原代胚腎細(xì)胞過表達(dá)Bmi1。

在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明是在中國實(shí)驗(yàn)用小型豬母豬懷孕第28天或豬仔出生兩周以內(nèi)的時間段，從胚胎或豬仔腎臟生腎區(qū)提取原代豬胚腎細(xì)胞，通過慢病毒轉(zhuǎn)染使Bmi1蛋白過表達(dá)，從而制備得到本發(fā)明的永生化后腎間充質(zhì)細(xì)胞系。

更具體地，本發(fā)明的方法中，通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式使原代豬胚腎細(xì)胞過表達(dá)Bmi1的方法包括：pMSCV-Bmi1質(zhì)粒和plk質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集含病毒上清；后腎間充質(zhì)細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，次日更換新鮮培養(yǎng)基，同時加含病毒上清和聚凝胺，6h后更換新鮮培養(yǎng)基，2天后更換含嘌呤霉素培養(yǎng)基，隔兩天換液，共7天，即得Bmi1過表達(dá)后腎間充質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明中將過表達(dá)Bmi1的后腎間充質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞命名為MMC-Bmi1。

另一方面，本發(fā)明還提供了過表達(dá)Bmi1的所述后腎間充質(zhì)細(xì)胞系的相關(guān)應(yīng)用。

本發(fā)明的過表達(dá)Bmi1的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系中，Bmi1基因表達(dá)水平較MMC升高(qPCR檢測)，有明顯的Bmi1蛋白表達(dá)(蛋白印跡檢測)，而MMC中幾乎無表達(dá)。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所述過表達(dá)Bmi1的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系為永生化細(xì)胞，可穩(wěn)定傳代，衰老速度顯著減慢，具有原代胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物和部分間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，并具有向成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞分化的能力，能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。本發(fā)明的細(xì)胞系是保留了原代細(xì)胞增殖和分化能力的永生化的胚腎細(xì)胞系，對于研究腎臟發(fā)育和器官修復(fù)再生具有重要意義。

從而，本發(fā)明提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在體外研究腎臟發(fā)育和器官修復(fù)再生中的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在制備用于研究腎臟發(fā)育和器官修復(fù)的材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在體外提高人牙周膜干細(xì)胞堿性磷酸酶活性、增加人牙周膜干細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平、和/或促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成中的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在制備用于提高人牙周膜干細(xì)胞堿性磷酸酶活性、增加人牙周膜干細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平、和/或促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在體外促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明提供了所述的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系在制備用于促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的材料中的應(yīng)用。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種來自受孕動物胚胎或出生兩周齡以內(nèi)動物腎臟生腎區(qū)的原代胚腎細(xì)胞經(jīng)過表達(dá)Bmi1基因或蛋白而得到的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系，其可永生化并穩(wěn)定傳代，具有原代胚胎后腎間充質(zhì)細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物和部分間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，并具有向成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞分化的能力，能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。本發(fā)明為人類和動物腎臟發(fā)育和器官修復(fù)的研究提供了實(shí)驗(yàn)工具。

附圖說明

圖1顯示原代豬后腎間充質(zhì)細(xì)胞(MMC)的提取流程。正常孕70天中國實(shí)驗(yàn)用小型豬，頸部放血處死，剖宮取出胚胎；迅速分離胚腎，在4℃無菌生理鹽水中沖洗并去除包膜，取腎皮質(zhì)并剪碎；將孔徑150μm和53μm無菌篩網(wǎng)上下疊放，腎皮質(zhì)置于上層研磨；收集截留在下層篩網(wǎng)的組織于體外培養(yǎng)；將形成的細(xì)胞集落分離培養(yǎng)；慢病毒轉(zhuǎn)染Bmi1基因使其永生化；有限稀釋法挑取單克隆；鑒定胚腎標(biāo)志物以及間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)情況。

圖2顯示細(xì)胞中Bmi1過表達(dá)鑒定結(jié)果。其中，圖片A顯示qPCR檢測Bmi1基因表達(dá)情況的結(jié)果。圖片B顯示細(xì)胞蛋白印跡檢測Bmi1蛋白表達(dá)情況的結(jié)果。圖中*表示與MMC相比p<0.05。

圖3顯示MMC-Bmi1永生化鑒定結(jié)果。其中，圖片A顯示qPCR鑒定結(jié)果。圖片B-圖片D分別為第5代MMC、第10代和第50代的MMC-Bmi1光鏡結(jié)果，100x。圖片E顯示第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1連續(xù)培養(yǎng)14d的蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白p16INK4a和p27的水平的結(jié)果。圖片F(xiàn)和圖片G顯示第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1連續(xù)培養(yǎng)14d的SA-βGel染色結(jié)果，200x。圖中*表示與MMC相比p<0.05。

圖4顯示MMC-Bmi1的單克隆挑取以及胚腎、間充質(zhì)和上皮標(biāo)志物的鑒定結(jié)果。其中，圖片A-圖片D顯示有限稀釋法挑取單克隆后第1、3、6天細(xì)胞生長狀況(100x)及單克隆純化的MMC-Bmi1細(xì)胞形態(tài)光鏡結(jié)果(200x)。圖片E-圖片I每列分別顯示Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的免疫熒光染色及其對應(yīng)的細(xì)胞核和融合后的情況，400x。

圖5顯示MMC-Bmi1間充質(zhì)干細(xì)胞特性鑒定結(jié)果。其中，圖片A顯示RT-PCR檢測MMC-Bmi1表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD44、CD73、CD90、CD105、單核/巨噬細(xì)胞表面分子CD11b、B細(xì)胞表面分子CD19和造血干細(xì)胞表面分子CD34、CD45的檢測結(jié)果。圖片B和圖片C顯示MMC-Bmi1結(jié)晶紫染色結(jié)果，10x與100x。圖片D-圖片G顯示MMC-Bmi1茜素紅染色結(jié)果，400x。

圖6顯示MMC-Bmi1上皮分化能力鑒定結(jié)果。其中，圖片A的左圖顯示基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下細(xì)胞形態(tài)光鏡結(jié)果(200x)；圖片A的右圖顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10天的細(xì)胞形態(tài)光鏡結(jié)果(200x)。圖片B-圖片D的左圖顯示細(xì)胞免疫熒光檢測基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下細(xì)胞表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin的結(jié)果(400x)；右圖顯示細(xì)胞免疫熒光檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10天細(xì)胞表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin的結(jié)果(400x)。

圖7顯示MMC-Bmi1促進(jìn)PDLSCs成骨分化檢測結(jié)果。其中，圖片A顯示與后腎間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)7天PDLSCs的ALP水平檢測結(jié)果。圖片B顯示qPCR檢測與后腎間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)14天PDLSCs細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果。圖片C-圖片E顯示與后腎間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)21天PDLSCs鈣結(jié)節(jié)形成的數(shù)量的茜素紅染色結(jié)果，200x。圖中：*表示與對照-0d組比較p<0.05，#表示與對照-7d組比較p<0.05，$表示與對照-14d組比較p<0.05。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

在進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)用動物均通過實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

實(shí)施例

1、原代豬胚腎細(xì)胞(MMC)的提取、分離和培養(yǎng)

本實(shí)施例中，原代豬后腎間充質(zhì)細(xì)胞(MMC)的提取流程參見圖1所示。具體操作如下：

1)正常孕70天中國實(shí)驗(yàn)用小型豬，頸部放血處死，迅速剖宮產(chǎn)取出胚胎；

2)迅速分離胚腎，在4℃無菌生理鹽水中沖洗并去除包膜，剪碎腎皮質(zhì)；

3)孔徑150μm和53μm無菌篩網(wǎng)上下疊放，腎皮質(zhì)置于上層研磨；

4)收集截留在下層篩網(wǎng)的組織，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管，1300rpm，離心5min；

5)倒掉上清，用α-MEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)重懸細(xì)胞，接種至75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％二氧化碳、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6)隔兩天換液，5天后細(xì)胞形成集落，即原代豬后腎間充質(zhì)細(xì)胞(MMC)，可轉(zhuǎn)移至6孔板繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

2、原代豬胚腎細(xì)胞的永生化及鑒定

通過慢病毒轉(zhuǎn)染方式使原代豬胚腎細(xì)胞過表達(dá)Bmi1，即HEK-293T細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD，USA)接種至直徑100mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合至80％時取pMSCV-Bmi1質(zhì)粒和plk質(zhì)粒(質(zhì)粒均可購自和元生物技術(shù)股份有限公司，上海，中國)各5μg共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6h后換液，24h后收集含病毒上清；MMC以1×10⁵接種至25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，次日更換新鮮培養(yǎng)基3ml，同時加含病毒上清3ml和48μg polybrene(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)終濃度8μg/ml，6h后更換新鮮培養(yǎng)基6ml；48h后更換含嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)500μg/ml培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，隔兩天換液，共7天，即得Bmi1過表達(dá)細(xì)胞(MMC-Bmi1)。

對細(xì)胞中Bmi1過表達(dá)情況進(jìn)行qPCR檢測和蛋白印跡檢測鑒定，鑒定結(jié)果參見圖2。其中，圖片A顯示qPCR檢測Bmi1基因表達(dá)情況，MMC-Bmi1中Bmi1基因表達(dá)水平較MMC顯著升高。圖片B顯示細(xì)胞蛋白印跡檢測Bmi1蛋白表達(dá)情況，MMC-Bmi1中有明顯的Bmi1蛋白表達(dá)，而MMC中幾乎無表達(dá)。

MMC-Bmi1永生化鑒定分析結(jié)果參見圖3。其中，圖片A為qPCR檢測tert基因表達(dá)水平結(jié)果，結(jié)果顯示MMC-Bmi1端粒酶催化組分tert的基因表達(dá)水平較MMC顯著增高。圖片B、圖品C、圖片D分別為第5代MMC、第10代和第50代的MMC-Bmi1光鏡結(jié)果(100x)，顯示不同時期的細(xì)胞形態(tài)無顯著改變。第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1連續(xù)培養(yǎng)14d，蛋白印跡檢測其中細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p16^INK4a和p27的水平，結(jié)果參見圖片E，顯示MMC衰老相關(guān)蛋白p16^INK4a和p27的水平顯著較高；SA-βGel染色檢測βGel水平，結(jié)果參見圖片F(xiàn)和圖片G(200x)，顯示MMC中βGel水平顯著高于MMC-Bmi1。

綜合以上結(jié)果，MMC-Bmi1為永生化細(xì)胞，可穩(wěn)定傳代，衰老速度顯著減慢。

3、MMC-Bmi1胚腎標(biāo)志物鑒定

有限稀釋法挑取MMC-Bmi1單克隆，進(jìn)行胚腎標(biāo)志物鑒定。圖4中的圖片A-圖片D顯示有限稀釋法挑取單克隆后第1、3、6天細(xì)胞生長狀況(100x)及單克隆純化的MMC-Bmi1細(xì)胞形態(tài)，光鏡結(jié)果顯示細(xì)胞呈現(xiàn)均一的長梭形(200x)。

細(xì)胞免疫熒光檢測MMC-Bmi1中后腎間充質(zhì)標(biāo)志物Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的表達(dá)，結(jié)果參見圖4中的圖片E-圖片I(400x)，這些圖片每列分別為Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的免疫熒光染色，及其對應(yīng)的細(xì)胞核和融合后的情況，結(jié)果顯示，MMC-Bmi1表達(dá)后腎間充質(zhì)標(biāo)志物six2、pax2和gdnf，表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin，不表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin。

以上結(jié)果提示，MMC-Bmi1保留了后腎間充質(zhì)細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物，即MMC-Bmi1為永生化的后腎間充質(zhì)細(xì)胞。

4、MMC-Bmi1間充質(zhì)干細(xì)胞特性鑒定

對MMC-Bmi1間充質(zhì)干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果參見圖5。其中，圖片A為RT-PCR檢測結(jié)果，顯示MMC-Bmi1表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子CD44、CD73、CD90和CD105，幾乎不表達(dá)單核/巨噬細(xì)胞表面分子CD11b、B細(xì)胞表面分子CD19和造血干細(xì)胞表面分子CD34、CD45。圖片B(10x)和圖片C(100x)結(jié)晶紫染色顯示MMC-Bmi1具有顯著的集落形成能力。圖片D-圖片G茜素紅染色結(jié)果顯示MMC-Bmi1具有成骨分化的潛能，圖片D和圖片F(xiàn)示在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)18d無鈣結(jié)節(jié)形成，圖片E和圖片G示在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(α-MEM含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、100μg/ml L-抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和10nmol/L地塞米松)中培養(yǎng)18d可見明顯的礦化鈣結(jié)節(jié)形成，400x。

以上結(jié)果提示，MMC-Bmi1具有部分間充質(zhì)干細(xì)胞特性，可能為后腎間充質(zhì)干細(xì)胞。

5、MMC-Bmi1-4上皮分化能力鑒定

MMC-Bmi1接種至直徑12mm的塑料蓋玻片上，用含50ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor)和10ng/ml TGF-α(transforming growth factor-α)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基組作為對照，期間每隔兩天更換培養(yǎng)基。細(xì)胞免疫熒光染色檢測上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)。

圖6顯示MMC-Bmi1上皮分化能力鑒定結(jié)果。其中，圖片A的左圖光鏡結(jié)果顯示，基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)纖維樣(200x)；圖片A的右圖光鏡結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10天，部分細(xì)胞形態(tài)有纖維樣變?yōu)殇伮肥瘶?200x)。圖片B-圖片D的左圖細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，細(xì)胞不表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin(400x)；圖片B-圖片D的右圖細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10天，部分細(xì)胞開始表達(dá)上皮標(biāo)志物E-cadherin(400x)。

以上結(jié)果顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)10d可見部分細(xì)胞有纖維樣變?yōu)殇伮肥瘶樱议_始表達(dá)E-cadherin，提示MMC-Bmi1保持原代細(xì)胞的上皮分化潛能。

6、MMC-Bmi的應(yīng)用

利用transwell共培養(yǎng)體系將MMC-Bmi1與人牙周膜干細(xì)胞(PDLSC)共培養(yǎng)，檢測PDLSC細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性及成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平。

檢測結(jié)果參見圖7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)7天后，PDLSC細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性顯著增高(圖7中的圖片A)。圖7中的圖片B顯示qPCR檢測PDLSCs細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平結(jié)果，顯示與后腎間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)14d，PDLSCs細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因表達(dá)水平顯著增加。圖7中的圖片C-圖片E為茜素紅染色檢測結(jié)果(200x)，顯示與后腎間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)21d，PDLSCs鈣結(jié)節(jié)形成的數(shù)量顯著增加。

以上結(jié)果提示永生化的后腎間充質(zhì)細(xì)胞系MMC-Bmi1可以促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化。

最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。