細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì) 胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，它能夠定向誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。且間充質(zhì)細(xì)胞存在于人體多種組織中，尤其是臍帶、胎盤、骨髓、脂肪 組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來源廣泛、易于采集、無倫理問題等優(yōu)勢，可規(guī)?；T導(dǎo)分 化為軟骨細(xì)胞，為臨床治療關(guān)節(jié)軟骨損傷提供新的技術(shù)方案。但目前多采用間充質(zhì)干細(xì)胞 與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，這種共培養(yǎng)方法不僅需要一 定的軟骨細(xì)胞源，過程較繁瑣，花費(fèi)較大，而且所獲得的更多為散在軟骨細(xì)胞，數(shù)量較少，軟 骨細(xì)胞團(tuán)幾乎沒有，而且散在的軟骨細(xì)胞相對較小，細(xì)胞活性差，難以達(dá)到臨床移植要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中利用間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞共 培養(yǎng)方式誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞的方式存在成本高，間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低等 缺陷，提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)單獨(dú)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成軟骨細(xì)胞的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采用 該細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括 TGF-0、地塞米松、抗壞血酸、甘油磷酸鈉和ITS+Premix。
[0005] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述TGF-P的濃度為5-15ng/ml、地塞米松 的濃度為7 _10臟〇1/1、抗壞血酸的濃度為50-100ug/ml、甘油磷酸鈉的濃度為5_15mmol/l 和 ITS+Premix 的濃度為 50_150ng/ml〇
[0006] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，TGF-P的濃度為 10ng/ml，地塞米松的濃度為10mmol/l，抗壞血酸的濃度為70ug/ml，甘油磷酸鈉的濃度為 10mmol/l, ITS+Premix 的濃度為 100ng/ml〇
[0007] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋 白。
[0008] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述胰島素的濃度為5-10mg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的 濃度為 5-10mg/ml。
[0009] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，TGF-P的濃度為 10ng/ml，地塞米松的濃度為10mmol/l，抗壞血酸的濃度為70ug/ml，甘油磷酸鈉的濃度為 10mmol/l，ITS+Premix的濃度為100ng/ml，胰島素的濃度為6. 25mg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為 6. 25mg/ml〇
[0010] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括谷氨酰胺。
[0011] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述谷氨酰胺的濃度為l-10mm〇L/L。
[0012] 在本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，TGF-0的濃度為 15ng/ml，地塞米松的濃度為10mmol/l，抗壞血酸的濃度為100ug/ml，甘油磷酸鈉的濃度為 15mmol/l，ITS+Premix的濃度為150ng/ml，胰島素的濃度為10mg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為 10mg/ml，谷氨酰胺的濃度為10mmoL/L。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)一種誘導(dǎo)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0014] 獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，并用誘導(dǎo)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞；
[0015] 所述誘導(dǎo)液為上述細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0016] 實施本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可以達(dá)到以下有益效果：該細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基 不僅可實現(xiàn)單獨(dú)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，而且通過本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 基可提高間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率，所獲得的軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，活性較強(qiáng)；相較于現(xiàn)有 的共培養(yǎng)方式，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法，不僅可省去獲取軟骨細(xì)胞源的過 程，而且使用過程較簡便。
【附圖說明】
[0017] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0018] 圖1為本發(fā)明提供的檢測實驗中，根據(jù)Chs標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液的濃度及其0D值所制 作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0019] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中共培養(yǎng)方式所獲得軟骨細(xì)胞數(shù)量少、細(xì)胞較分散且需要軟骨細(xì) 胞源等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基可實現(xiàn)單 獨(dú)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的目的，且獲得的軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，活性較強(qiáng)。
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括TGF-P、地塞米松、抗壞血酸、甘油磷酸鈉和 ITS+Premix〇
[0022] 其中，TGF-0 (transforming growth factor-0，TGF-0 轉(zhuǎn)化生長因子)是 一族廣泛存在、結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能相似的多功能活性肽，具有多種功能的多肽生長因子，可以 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)膠原產(chǎn)生，刺激軟骨細(xì)胞的 合成與分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖。TGF-P有三種異構(gòu)體，分別為TGF-P1、 0 2和0 3, TGF-P 2、0 3較0 1可更快速有效地促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，但 TGF-P 2、0 3之間誘導(dǎo)干細(xì)胞的水平基本相同。由于TGF-P在骨生長中的生物學(xué)功能呈雙 向調(diào)節(jié)作用，既能刺激細(xì)胞的增殖分化作用，也能進(jìn)行抑制作用，一般來說，低濃度TGF-0 起刺激作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化；高濃度起抑制作用，因此，優(yōu)選地，TGF-P的濃度為 5-15ng/ml〇
[0023] 地塞米松，購于Sigma公司，能夠刺激堿性磷酸酶、骨鈣素和I型膠原等的表達(dá)， 顯著地增加堿性磷酸酶的活性，堿性磷酸酶是骨形成過程中必須的酶，堿性磷酸酶的表達(dá) 情況代表著骨形成的狀況，可以激活位于間充質(zhì)干細(xì)胞表面的糖皮質(zhì)激素受體，促進(jìn)間充 質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，同時，提高間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化率；優(yōu)選地，地塞米 松的濃度為7-10mmol/ml。
[0024] 抗壞血酸又稱維生素c，是水溶性維生素的一種，參與氧化還原過程，在生物的氧 化和還原過程以及細(xì)胞呼吸作用中扮演重要角色，同時，抗壞血酸是膠原合成所必需的，還 可調(diào)節(jié)ATP酶與ALP活性及非膠原基質(zhì)蛋白質(zhì)的合成；抗壞血酸對軟骨細(xì)胞分化的促進(jìn) 作用，主要是通過增加膠原的累積，然后增加堿性磷酸酶在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)；此外，作為 一種抗氧化劑還可抑制或減少誘導(dǎo)過程中細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。優(yōu)選地，抗壞血酸的濃度為 50-100ug/ml〇
[0025]甘油磷酸鈉可以為軟骨細(xì)胞提供磷酸離子，同時促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積和鈣 化，是骨髓基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的必要條件；優(yōu)選地，甘油磷酸鈉的濃度為 5-15mmol/ml〇
[0026] ITS+Premix為一種生長因子，購于BD公司，其成份包含有牛血清白蛋白和亞油酸 等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖生長；優(yōu)選地，ITS+Premix的濃度為50-150ng/ml。
[0027]由以上細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份作用可知，通過本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠促 進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞，提高間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，并能夠增強(qiáng)細(xì)胞的活性。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白；胰島素可降 低蛋白質(zhì)降解，增加氨基酸和葡萄糖的攝入，為細(xì)胞生長和分化提供能量，促使間充質(zhì)干細(xì) 胞處于低糖環(huán)境，保持細(xì)胞活性，有利于間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化，優(yōu)選地，胰島素 的濃度范圍為5-10mg/ml ;而轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠干預(yù)軟骨細(xì)胞內(nèi)離子代謝，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生 成，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度范圍為5-10mg/ml。
[0029] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包括谷氨酰胺，谷氨酰胺參與蛋白 質(zhì)的合成和核酸代謝，可作為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的能量來源，另外，谷氨酰胺通過細(xì)胞增容 作用，也可促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化；優(yōu)選地，谷氨酰胺的濃度范圍為1-10_〇1/1。
[0030] 綜上所述，本發(fā)明提供的細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不僅能夠保持細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞的 增殖分化，并且能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成。
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0032]實施例1
[0033] 本發(fā)明進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0034] 1、獲取間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0035] 2、對步驟1獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0036] 3、采用細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基對步驟2中傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0037]步驟1中，獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的過程為：
[0038] 將空氣注入新西蘭大白兔耳緣靜脈，使其死亡。用75%的酒精涂抹大白兔的四肢， 消毒并減少兔毛的污染。剪下兔四肢的股骨和腔骨，除去皮膚組織保留關(guān)節(jié)處的肌肉結(jié)締 組織，其余部位的肌肉組織剪去。將處理過的組織浸泡在75%的酒精，30min之后取出，用 無菌PBS溶液清洗，放置在超凈臺中。用無菌手術(shù)刀切掉關(guān)節(jié)處的肌肉，使關(guān)節(jié)暴露。用骨