本發(fā)明屬于細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種永生化的牛精原干細(xì)胞系及其構(gòu)建的方法。
背景技術(shù)：
：雄性生殖干細(xì)胞，又稱作精原干細(xì)胞(spermatogonialstemcells，SSCs)，是位于睪丸曲細(xì)精管基膜上能通過自我更新維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定，同時在體內(nèi)定向分化并最終生成精子的一類成體干細(xì)胞。同時，它也能在特定條件下誘導(dǎo)去分化成為多能干細(xì)胞，這樣就能繞過胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESCs)治療的理論與技術(shù)難題。與其他成體干細(xì)胞不同的是，它是雄性成年哺乳動物體內(nèi)唯一能通過自然生殖過程將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞，因此，在生殖醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、物種保護等領(lǐng)域都將作其為重點來研究。西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省干細(xì)胞研究中心在精原干細(xì)胞的研究上已開展了一定的基礎(chǔ)工作。(Wu,Songetal.2013)(Zhu,Maetal.2014)等先后在奶山羊精原干細(xì)胞的分離純化，培養(yǎng)基的篩選，以及細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)鑒定方面做了大量的工作。并且發(fā)現(xiàn)了奶山羊雄性生殖干細(xì)胞表達(dá)多能性與生殖細(xì)胞的標(biāo)記，具有增殖能力和向三胚層細(xì)胞分化的潛能，同時也發(fā)掘出在雄性生殖干細(xì)胞自我更新及分化機制研究中起重要作用的多個關(guān)鍵因子。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種永生化的牛精原干細(xì)胞系及其構(gòu)建的方法，永生化后的牛精原干細(xì)胞沒有丟失精原干細(xì)胞的表型特征和生物學(xué)特性，且能夠向三胚層以及精子樣方向分化。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種永生化的牛精原干細(xì)胞系，是以牛精原干細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，通過用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達(dá)載體表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后的牛精原干細(xì)胞表達(dá)SV40大T抗原，成為具有多向分化潛能的轉(zhuǎn)化體。其細(xì)胞為成纖維樣，呈多角形和短梭狀，有兩個或兩個以上的核仁，細(xì)胞間存在接觸抑制。牛精原干細(xì)胞系在傳代培養(yǎng)35代以后SV40大T抗原還能夠被表達(dá)。一種永生化的牛精原干細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1)將預(yù)處理的睪丸組織剪碎，加入10倍體積的CDD溶液中消化處理；然后等體積中和液中和，室溫離心后棄上清，用DMEM+10％FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巰基乙醇的溶液重新懸浮細(xì)胞后接種于培養(yǎng)皿上，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，再采用免疫磁珠抗體CD90分選獲取純化的牛精原干細(xì)胞；所述的CDD溶液包含2mg/mL膠原酶、20μg/mLDNase和2mg/mLDispase；所述的中和液為DMEM/F12+10％胎牛血清；2)驗證好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝組成成分質(zhì)粒pVSVG、pAX共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝獲得假慢病毒感染顆粒，用來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并進一步檢測。操作如下：⑴多聚賴氨酸溶液包被處理細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸除多聚賴氨酸晾干培養(yǎng)皿后接種107個293T細(xì)胞。⑵待次日細(xì)胞生長至70-90％鋪滿培養(yǎng)皿時，換取新鮮溫?zé)崤囵B(yǎng)液。⑶按照轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染體系，將目的載體、慢病毒輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進293T細(xì)胞。取質(zhì)粒:pLOX-Ttag-iresTKT14μg；pVSVG7μg；pAX7μg，依次將轉(zhuǎn)染組分別加入一個無菌潔凈的玻璃離心管，混勻室溫靜置15min后逐滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。在換取新鮮培養(yǎng)液48h收取包含病毒顆粒的細(xì)胞上清液，0.45μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)后，將此病毒液-80℃凍存或者用PG8000濃縮，以備后繼試驗。牛精原干細(xì)胞按照1×105細(xì)胞/35mm皿，上將牛精原干細(xì)胞按照1×105細(xì)胞/35mm皿上，12h后將含有10μg/mlpolybrene的病毒液溶液加入含有低血清培養(yǎng)皿中。24h后換上新鮮的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)、傳代3個月以上，直到細(xì)胞永生化，永生化后使用含血清的完全培養(yǎng)基。所述的低血清培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素.20ng/mLGDNF,20ng/mLbFGF,10ng/mLLIF。永生化的細(xì)胞使用的含有血清的完全培養(yǎng)基為DMEM/F12加入10％FBS、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素。所述的睪丸組織的處理為：將3月齡以上的睪丸組織經(jīng)高濃度雙抗(300U/mL青霉素，300mg/mL鏈霉素)清洗后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)室，經(jīng)75％醫(yī)用酒精浸泡1-2min；剪開白膜及睪丸組織，取出部分組織浸泡于PBS中，反復(fù)清洗3-4次后用剪刀剪碎。所述精原干細(xì)胞的純化是原代差速貼壁法分離收集未貼壁的精原細(xì)胞，將收集的未貼壁精原細(xì)胞按如下步驟進行細(xì)胞分選：1)未貼壁精原細(xì)胞1200rpm室溫離心5min，棄去培養(yǎng)液；2)離心所得細(xì)胞用PBS重懸后計數(shù)，按1×107/管分裝，1200rpm室溫離心5min，棄去PBS；3)離心沉淀所得細(xì)胞用20μL的CD90磁珠抗體加80μL的MACSBuffe重懸，4度孵育15min；4)孵育細(xì)胞1200rpm室溫離心5min，收集上層一抗稀釋液；5)細(xì)胞沉淀再用500μLMACSBuffer重懸成細(xì)胞懸液，用500μLMACSBuffer潤洗MACS分選柱，待潤洗的MACSBuffer將要流完時，及時緩慢滴加細(xì)胞懸液；6)收集流過分選柱的細(xì)胞懸液，獲得CD90陰性精原細(xì)胞；待細(xì)胞懸液完全流過MACS分選柱后，再用500μLMACSBuffer緩慢潤洗分選柱，然后取下分選柱，再向分選柱中滴加500μLMACSBuffer，收集用助推活塞推出的MACSBuffer，其中含有CD90陽性精原細(xì)胞，收集分選的牛精原干細(xì)胞接種到鋪了Laminin的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/ml青霉素，100mg/mL鏈霉素.20ng/mLGDNF,20ng/mLbFGF,10ng/mLLIF。通過pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)致牛精原干細(xì)胞得到連續(xù)傳代3個月以上且能夠表達(dá)SV40大T抗原。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：1)本發(fā)明通過將pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛精原干細(xì)胞，使得重組后的牛精原干細(xì)胞表達(dá)SV40大T抗原，以解決分離出的牛精原干細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的提高活力差和難以存活的問題，得到具有多向分化潛能的永生化的牛精原干細(xì)胞系。2)本發(fā)明篩選獲得的永生化的牛精原干細(xì)胞系，其生長狀況良好，細(xì)胞的生命力較之以前的大大提高，便于規(guī)模化的應(yīng)用；在體外傳代35代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，不發(fā)生凋亡，是一種永生化的細(xì)胞系，目前已能夠傳至45代。3)本發(fā)明篩選獲得的永生化的牛精原干細(xì)胞系，其營養(yǎng)要求較低，原始分離得到的牛精原干細(xì)胞的培養(yǎng)需要10％的胎牛血清、GDNF、bFGF等各種生長因子，而現(xiàn)在只要求10％的胎牛血清，降低了培養(yǎng)的成本。4)將篩選獲得的永生化的牛精原干細(xì)胞系，經(jīng)過誘導(dǎo)后能夠分化形成三胚層細(xì)胞，及其精子樣細(xì)胞，將其移植到生精缺陷的受體小鼠睪丸中內(nèi)，能在受體老鼠的睪丸中增殖形成克隆，并遷移到曲細(xì)精管基底膜。附圖說明圖1為牛精原干細(xì)胞形成的克隆及其相關(guān)標(biāo)記基因和蛋白表達(dá)結(jié)果圖；圖2為永生化載體鑒定及永生化后細(xì)胞生長曲線結(jié)果圖；圖3為永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)系相關(guān)標(biāo)記基因和蛋白表達(dá)結(jié)果圖；圖4為永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)系體外誘導(dǎo)分化能力檢測結(jié)果圖；圖5為永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)系向精子細(xì)胞分化功能的檢測結(jié)果圖；圖6為移植檢測生殖干細(xì)胞功能檢測結(jié)果圖；圖7為熒光顯微鏡檢測結(jié)果圖。具體實施方式本發(fā)明提供一種永生化的牛精原干細(xì)胞系，是以牛精原干細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，通過將pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛精原干細(xì)胞，該細(xì)胞系在體外傳代35代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，是一種永生化的細(xì)胞系。以下通過對永生化的牛精原干細(xì)胞系的構(gòu)建、細(xì)胞形態(tài)特征、標(biāo)志物的基因及免疫鑒定、誘導(dǎo)分化，以及移植到生精缺陷的受體小鼠睪丸中來做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1.牛精原干細(xì)胞(bSSCs)的分離及相關(guān)標(biāo)記基因的鑒定1.1將取到的3月齡以上的睪丸組織經(jīng)高濃度雙抗(300U/mL青霉素，300mg/mL鏈霉素)清洗后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)室；經(jīng)75％醫(yī)用酒精短暫浸泡1-2min。剪開白膜及睪丸組織，取出部分組織浸泡于PBS中，反復(fù)清洗3-4次后用剪刀剪碎；加入10倍體積的CDD(2mg/mL膠原酶+20μg/mLDNase+2mg/mLDispase)37℃消化30min；然后加入等體積的DMEM/F12+10％胎牛血清(FBS)中和，2000r/min室溫離心；5min后棄上清，用DMEM+10％FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巰基乙醇的溶液重新懸浮細(xì)胞后接種于90mm培養(yǎng)皿上，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，得到含有精原干細(xì)胞的細(xì)胞群；然后采用免疫磁珠抗體CD90分選純化精原干細(xì)胞；1.2CD90磁珠抗體分選富集精原干細(xì)胞原代差速貼壁法分離收集未貼壁的精原細(xì)胞(含有少量的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞)，將收集的未貼壁精原細(xì)胞按如下步驟進行細(xì)胞分選：1)未貼壁精原細(xì)胞1200rpm室溫離心5min，棄去培養(yǎng)液；2)離心細(xì)胞用PBS重懸后計數(shù)，按1×107/管分裝，1200rpm室溫離心5min，棄去PBS；3)離心沉淀細(xì)胞用20μL的CD90磁珠抗體加80μL的MACSBuffe重懸，4度孵育15min；4)孵育細(xì)胞1200rpm室溫離心5min，收集上層一抗稀釋液；5)細(xì)胞沉淀再用500μLMACSBuffer重懸成細(xì)胞懸液，用500μLMACSBuffer潤洗MACS分選柱，待潤洗的MACSBuffer將要流完時，及時緩慢滴加細(xì)胞懸液；6)收集流過分選柱的細(xì)胞懸液，即為CD90陰性精原細(xì)胞；待細(xì)胞懸液完全流過分選柱后，再用500μLMACSBuffer緩慢潤洗分選柱，然后從分選磁架上取下分選柱，再向分選柱中滴加500μLMACSBuffer，收集用助推活塞推出的MACSBuffer，其中即含有CD90陽性精原細(xì)胞，收集分選的牛精原干細(xì)胞接種到鋪了Laminin的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其中(圖1B)為培養(yǎng)兩周形成的克隆。1.2細(xì)胞免疫熒光檢測將牛精原干細(xì)胞用4％多聚甲醛固定后，細(xì)胞免疫熒光染色進行牛精原干細(xì)胞特征性標(biāo)志和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志的鑒定，同時以BSA為陰性對照進行染色。具體結(jié)果如圖1所示。牛精原干細(xì)胞(bSSCs)的生殖標(biāo)記基因(VASA)、干性標(biāo)記基因(PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP9.5)、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因(OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF4)分別如圖1A所示，結(jié)果表明:VASA、PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP9.5、OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF-4均為陽性。1.3RT-PCR檢測以PCR擴增的第一鏈cDNA為模板，各個標(biāo)志物相對應(yīng)的引物(如表1所示)進行PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1牛精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及其相應(yīng)的PCR擴增引物標(biāo)志物上游引物下游引物擴增TPLZF5'-CACCGCAACAGCCAGCACTAT-3'5'-CGGCATACAGCAGGTCATCCAA-3'127bp60β-actin5'-CGGCAATGAGCGGTTCC-3'5'-CGTGTTGGCGTAGAGGTCCT-3'142bp60SOX-25'-CCCGTGGTTACCTCTTCTTCC-3'5'-CGCTCTGGTAGTGCTGGGAC-3'145bp60Nanog5'-CCCGAAGCATCCAACTCTAGG-3'5'-GTCCGTGTCGAGGGTGTCA-3'93bp60LIN285'-CTGGAATCTATCCGAGTCACCG-3'5'GATGCTCTGGCAGAAATGGC-3'192bp60KLF-45'-TGCGGCAAAACCTACACG-3'5'-CCCACAACCATCCCAGTCA-3'96bp60OCT-45'-AAGGGCAAACGATCAAGCA-3'5'-AATGGGACCGAAGAGTACAGAGT-3”167bp60牛精原干細(xì)胞(bSSCs)標(biāo)記基因的表達(dá)情況如圖1C所示，各個標(biāo)志物基因均被表達(dá)，說明其具有精原干細(xì)胞的特征。2、pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達(dá)載體的鑒定pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達(dá)載體購買于Addgene公司，pLOX-Ttag-iresTKT質(zhì)粒全長12290bp(圖2A)，用NotI酶單酶切，用NotI酶和NotI和BamHI酶雙酶切后進行電泳，及PCR鑒定所得片段長度和預(yù)期一致(圖2B)，電泳結(jié)果表明質(zhì)粒完好，可以使用。3、永生化的牛精原干細(xì)胞(bSSCs)系的構(gòu)建3.1牛精原干細(xì)胞(bSSCs)的永生化1)慢病毒的包裝及病毒感染。驗證好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝組成成分質(zhì)粒pVSVG、pAX共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝獲得假慢病毒感染顆粒，用來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并進一步檢測。操作如下：1)多聚賴氨酸溶液包被處理細(xì)胞培養(yǎng)皿，吸除多聚賴氨酸晾干培養(yǎng)皿后接種107個293T細(xì)胞。2)待次日細(xì)胞生長至70-90％鋪滿培養(yǎng)皿時，換取新鮮溫?zé)崤囵B(yǎng)液。3)按照轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染體系，將目的載體、慢病毒輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進293T細(xì)胞。取質(zhì)粒:pLOX-Ttag-iresTKT14μg；pVSVG7μg；pAX7μg，依次將轉(zhuǎn)染組分別加入一個無菌潔凈的玻璃離心管，混勻室溫靜置15min后逐滴加到293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。在換取新鮮培養(yǎng)液后48h收取包含病毒顆粒的細(xì)胞上清液，0.45μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)后，將此病毒液-80℃凍存或者用PG8000濃縮，以備后繼試驗。牛精原干細(xì)胞按照1×105細(xì)胞/35mm皿，上將牛精原干細(xì)胞按照1×105細(xì)胞/35mm皿上，12h后將含有10μg/mlpolybrene的病毒液溶液加入含有低血清培養(yǎng)皿中。24h后換上新鮮的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)、傳代3個月以上，直到細(xì)胞永生化，永生化后使用含血清的完全培養(yǎng)基。所述的低血清培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mMβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素.20ng/mlGDNF,20ng/mlbFGF,10ng/mlLIF。永生化的細(xì)胞使用的含有血清的完全培養(yǎng)基為DMEM/F12加入10％FBS、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100mg/mL青霉素/鏈霉素。2)細(xì)胞群體倍增時間分析(Populationdoublingtime,PDT)牛精原干細(xì)胞連續(xù)傳代，統(tǒng)計起始細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)48h后的細(xì)胞數(shù)。PDT的計算參考PDT＝[log2/(logNt0-logN0)]×t，Nt＝培養(yǎng)后的細(xì)胞數(shù)，N0＝接種細(xì)胞數(shù)，t為培養(yǎng)時間。對細(xì)胞的群體倍增時間分析發(fā)現(xiàn)永生化的牛精原干細(xì)胞的群體倍增時間由50.9h縮短到了27.24h(圖2C、D)說明其增殖能力顯著地增強。3.2永生化牛精原干細(xì)胞系(bSSCs-Ttag)相關(guān)標(biāo)記基因的鑒定3.2.1westernblotting鑒定牛精原干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)將第6代、第8代、第10代的牛精原干細(xì)胞bSSCs-Ttag用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白做Westernblotting。結(jié)果說明永生化后的牛精原干細(xì)胞bSSCs-Ttag能夠成功的表達(dá)永生化基因(SV40)及精原干細(xì)胞標(biāo)記基因(PGP9.5、OCT4)(如圖3A所示)。3.2.2RT-PCR鑒定相關(guān)基因的表達(dá)牛精原干細(xì)胞(bSSCs)標(biāo)記基因的表達(dá)情況如圖3B所示，永生化基因(SV40)、干性標(biāo)記基因(PLZF、LIN28、)、胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因(OCT4、NANOG、KLF4)、增殖標(biāo)記(PCNA)、分化標(biāo)記基因(C-KIT)均被表達(dá)，說明永生化基因SV40成功的整合到細(xì)胞的基因組上，且建立的永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)沒有丟失其生物學(xué)特性。3.2.3細(xì)胞免疫熒光鑒定相關(guān)基因的表達(dá)將牛精原干細(xì)胞用4％多聚甲醛固定后，細(xì)胞免疫熒光染色進行永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)相關(guān)標(biāo)志基因的鑒定，同時以BSA為陰性對照進行染色。結(jié)果顯示(如圖3B)永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Tag)的生殖標(biāo)記基因(VASA)、干性標(biāo)記基因(PLZF、ETV-5、CD49f、PGP9.5)均能夠表達(dá)。3.2.4永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)的體外分化能力檢測將第13代的永生化的牛精原干細(xì)胞解離成單細(xì)胞懸液，用DMEMF/12+10％FBS+2mmol/LGlu+1％NEAA+100U/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的溶液按照800–1000細(xì)胞/25μL懸浮培養(yǎng)以形成EB(如圖4A)。進一步分化時將EB接種在0.1％明膠處理的培養(yǎng)板上，用DMEM/F12+10％FBS+0.1mmol/Lβ-ME+2mmol/LGlu+1mmol/L丙酮酸鈉+0.1mmol/LNEAA培養(yǎng)3–14天以探究其自發(fā)分化能力。細(xì)胞分化后免疫熒光染色檢測NESTIN(外胚層)、ASM(中、內(nèi)胚層)、PDX1(內(nèi)胚層)均有出現(xiàn)部分陽性細(xì)胞，同時PCR檢測結(jié)果顯示NESTIN(外胚層)、ASM(中、內(nèi)胚層)、PDX1(內(nèi)胚層)均能夠表達(dá)(如圖4B、C所示)。3.2.5永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)向精子細(xì)胞分化功能的檢測永生化牛精原干細(xì)胞形成EB后用RA誘導(dǎo)，誘導(dǎo)7d后出現(xiàn)精子樣細(xì)胞(圖5A)。細(xì)胞免疫熒光染色檢測減數(shù)分裂各期細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果證實減數(shù)分裂前標(biāo)記(STRA8)、減數(shù)分裂標(biāo)記(DAZL)及減數(shù)分裂后標(biāo)記(EXCO-2、ACR)都有表達(dá)(圖5B),同時q-PCR結(jié)果顯示經(jīng)過RA誘導(dǎo)后的細(xì)胞其減數(shù)分裂前標(biāo)記(STRA8)、減數(shù)分裂標(biāo)記(SCP-3、DAZL)及減數(shù)分裂后標(biāo)記(EXCO-2)均上調(diào)(圖5C)，這些結(jié)果證實了永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)具有分化為精子細(xì)胞的能力。3.2.6永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)移植檢測生殖干細(xì)胞功能收集培養(yǎng)到第15代轉(zhuǎn)導(dǎo)了GFP的永生化的牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)，用DMEM/F12+10％FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照105細(xì)胞/睪丸的量將細(xì)胞注入生精缺陷的受體小鼠睪丸曲細(xì)精管中。2個月后收集移植后的小鼠睪丸，將曲細(xì)精管和固定、切片后的樣品在熒光顯微鏡下鏡檢，照相記錄結(jié)果。兩個月后通過受體小鼠睪丸的切片檢測，發(fā)現(xiàn)2個月后依然能夠檢測到永生化牛精原干細(xì)胞(bSSCs-Ttag)存在(如圖6A,B、圖7A,B所示)。證明永生化牛精原干細(xì)胞具有雄性生殖干細(xì)胞的功能。雄性生殖干細(xì)胞在機體內(nèi)擔(dān)負(fù)傳遞遺傳信息的重?fù)?dān)，在生殖醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、畜牧生產(chǎn)等領(lǐng)域具有重要的理論價值和廣闊的應(yīng)用前景。在睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，雄性生殖干細(xì)胞在維持自我更新的基礎(chǔ)上，不斷分化，經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生源源不斷的精子以維持雄性個體的生育能力。本發(fā)明將牛精原干細(xì)胞進行永生化，并且對永生化后的牛精原干細(xì)胞系bSSCs-Ttag進行相關(guān)基因的檢測以及誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示永生化后的牛精原干細(xì)胞系bSSCs-Ttag仍然具備雄性生殖干細(xì)胞的生物學(xué)特性。當(dāng)前第1頁1 2 3