本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng)方法，特別涉及一種裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

雪旺細(xì)胞(Schwann cell)是脊髓的成髓鞘細(xì)胞，其包繞神經(jīng)元軸突形成的髓鞘結(jié)構(gòu)對神經(jīng)元有營養(yǎng)、支持及保護作用，并且髓鞘的存在能夠保證神經(jīng)元之間信息傳遞的速率。未成熟的雪旺細(xì)胞可以受到微環(huán)境的刺激而再次啟動分化。在脊髓橫斷損傷、肌肉萎縮性側(cè)面硬化病等疾病中一般會伴隨有髓鞘的損傷(Billiards SS,Haynes RL,Folkerth RD,Borenstein NS,Trachtenberg FL,Rowitch DH,Ligon KL,Volpe JJ,Kinney HC.2008.Myelin abnormalities without oligodendrocyte loss in periventricular leukomalacia.Brain Pathol 18:153–163.)。

裸鼴鼠是一種變溫哺乳動物，在氧氣濃度僅有6％左右的不通風(fēng)洞穴中能夠保持腦結(jié)構(gòu)和功能的完整無損并進行正常的生命活動，尤其是耗氧量較高的已經(jīng)形成髓鞘的雪旺細(xì)胞。因此，研究裸鼴鼠脊髓中雪旺細(xì)胞特殊的低氧耐受能力對于脊髓損傷性疾病中雪旺細(xì)胞損傷的治療具有重要的指導(dǎo)意義。由于在體微環(huán)境非常復(fù)雜，無法在體直接觀察雪旺細(xì)胞在低氧環(huán)境中的功能改變情況及其適應(yīng)機制，并且在體的結(jié)果可能容易受到微環(huán)境中其他細(xì)胞組分和結(jié)構(gòu)的影響。因此需要建立離體的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞模型以彌補在體觀察的缺陷。

未成熟的脊髓來源雪旺細(xì)胞具有較強的分裂增殖能力，易于體外培養(yǎng)，并通過誘導(dǎo)其分化的方法得到具有成髓鞘能力的成熟細(xì)胞。目前，研究人員已經(jīng)摸索出誘導(dǎo)大鼠坐骨神經(jīng)組織來源的雪旺細(xì)胞，以及大鼠脊髓DRG神經(jīng)節(jié)來源的雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法(Wang Y,Zhou S,Xu H,Yan S,Xu D,Zhang Y.Up-regulation of NF45correlates with Schwann cell proliferation after sciatic nerve crush.J Mol Neurosci.2015May；56(1):216-27.)。

但是現(xiàn)有技術(shù)中無論小鼠還是大鼠的雪旺細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)方法均不適用于裸鼴鼠，目前國內(nèi)外文獻尚無有關(guān)裸鼴鼠雪旺細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)方法的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)方法，以方便、高效的獲得純度高、狀態(tài)好的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞，為體外建立裸鼴鼠雪旺細(xì)胞提供技術(shù)支持，同時為體外研究裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的分化、遷移以及低氧耐受能力、以及裸鼴鼠雪旺細(xì)胞低氧耐受機制的闡述和相應(yīng)治療藥物或靶分子的篩選提供強大的保障。

我們試用了目前小鼠、大鼠的雪旺細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均無法培養(yǎng)獲得純度高、狀態(tài)好的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞，而且裸鼴鼠雪旺體細(xì)胞增殖的數(shù)量也較少。

關(guān)于裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)尚沒有建立出可行的實驗方法，我們分析其原因，主要是：1)裸鼴鼠是一種變溫動物，其體細(xì)胞離體培養(yǎng)的溫度有待摸索，并且其不恒定的機體代謝速率導(dǎo)致其體細(xì)胞體外培養(yǎng)基區(qū)別于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼴鼠生存在較為陰暗潮濕的環(huán)境中，其體細(xì)胞的培養(yǎng)對濕度有較高的要求；3)裸鼴鼠已經(jīng)適應(yīng)了外界低氧的環(huán)境，所以其體細(xì)胞離體培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度區(qū)別于常氧環(huán)境中生活的動物，并且需要摸索。

因此，裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)中最重要的是摸索到合適的溫度、濕度和氧氣濃度，以及摸索到適合的培養(yǎng)基。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

A、收集裸鼴鼠DRG混合神經(jīng)細(xì)胞：

分離胚胎期58-65天的裸鼴鼠脊髓DRG神經(jīng)節(jié)，將DRG神經(jīng)節(jié)剪碎，加入組織消化液I混勻之后消化，再用組織消化液II消化；然后用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中將沉淀重懸并吹打成單細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液種于無菌且預(yù)先包被有基質(zhì)層的培養(yǎng)板中(較優(yōu)的選擇24孔板)；

所述的組織消化液I，可以為常規(guī)的蛋白水解酶類消化液，例如I型、II型膠原酶等，輔以DNA酶I以解除DNA片段粘連引起的細(xì)胞聚集。優(yōu)選的組織消化液I為含有0.15％膠原酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液。

所述的組織消化液II，可以為常規(guī)的蛋白水解酶類消化液，例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，輔以DNA酶I以解除DNA片段粘連所致的細(xì)胞聚集。優(yōu)選的組織消化液II為含有0.25％胰酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液。

所述的基質(zhì)層，可以為常規(guī)的左旋多聚賴氨酸、右旋多聚賴氨酸、膠原蛋白、laminin等。優(yōu)選的基質(zhì)層為左旋多聚賴氨酸的基質(zhì)層。

B、裸鼴鼠DRG混合神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)：

將步驟A得到的DRG混合神經(jīng)細(xì)胞，用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后更換新鮮的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每3天換一次培養(yǎng)基；培養(yǎng)25天后換為雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每三天更新一次培養(yǎng)基。

所述的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基可以為常規(guī)的含血清混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液，例如低糖DMEM等。優(yōu)選為含有體積百分?jǐn)?shù)為15％進口胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。

所述的雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為2％B27的Neurobasal并添加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.01mg/ml的PDGFa。

所述的三氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為：溫度控制在35±2℃，氧濃度為6％，二氧化碳濃度為5±2％，濕度為96±2％。

優(yōu)選的，步驟A中，分離胚胎期58-65天的裸鼴鼠脊神經(jīng)節(jié)中DGR組織的方法如下：取懷孕58-65天的雌性裸鼴鼠，將其在CO₂中作窒息處理后立即將其浸泡于75％的乙醇中進行消毒，然后將其置于無菌玻璃平皿中，小心剖腹并將其含有胎鼠的子宮完整取出，剪開子宮膜并小心取出胎鼠。沿胎鼠背部脊柱走向?qū)⑵浼糸_，于體式顯微鏡下暴露椎管和椎間孔，用顯微鑷逐個摘除兩側(cè)椎體的外側(cè)隱窩中圓形透亮的脊神經(jīng)節(jié)，盡量剝除神經(jīng)節(jié)表面的筋膜。

優(yōu)選的，步驟A中，用顯微剪將神經(jīng)節(jié)組織剪碎至1mm³，加入組織消化液I混勻之后，于37℃消化30min，再用組織消化液II于37℃消化30min。然后用2ml混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。隨后細(xì)胞進行離心并收集細(xì)胞沉淀用于重懸為單細(xì)胞懸液。

優(yōu)選的，步驟B中，用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，待其完全貼壁之后，更換新鮮的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基，之后每3天更換一次培養(yǎng)基。

優(yōu)選的，所述三氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為：溫度控制在35℃，氧濃度為6％，二氧化碳濃度為5％，濕度為96％。

優(yōu)選的，步驟A中，所述左旋多聚賴氨酸濃度為0.01mg/ml。

優(yōu)選的，步驟B中，所述離心參數(shù)設(shè)置為室溫下，1000rpm，5分鐘。

優(yōu)選的，步驟B中，用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱中31天。

本發(fā)明的有益效果在于：A、從裸鼴鼠胎鼠脊神經(jīng)節(jié)中分離并純化培雪旺細(xì)胞，摸索出了適于變溫的嚙齒類哺乳動物裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的合理培養(yǎng)方法。我們發(fā)現(xiàn)6％氧濃度條件下，細(xì)胞狀態(tài)能夠得到較好的保持，并能夠保持增長；B、操作方法簡單，具有較高的可重復(fù)性，細(xì)胞純度可達98％以上。在15％濃度胎牛血清的培養(yǎng)基中，脊神經(jīng)節(jié)中雪旺細(xì)胞能保持較高的增殖速率，由于這種增殖優(yōu)勢以及缺乏神經(jīng)元營養(yǎng)因子的存在，脊神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元的生長會受到影響從而導(dǎo)致神經(jīng)元比例逐漸降低，而雪旺細(xì)胞的比例逐漸升高并達到最高純度。

中國專利文獻CN105695409A公開了一種裸鼴鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞培養(yǎng)方法，但是裸鼴鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞取材自不含結(jié)締組織的腦組織，而雪旺細(xì)胞取自兩側(cè)椎體的外側(cè)隱窩的DRG神經(jīng)節(jié)，每個DRG神經(jīng)節(jié)直徑不超過1mm，并由一層結(jié)締組織膜包裹，這層結(jié)締組織膜無法利用機械的方法剝除，在分離消化方法上有別于腦組織來源的神經(jīng)元。因此，在對DRG神經(jīng)節(jié)進行消化時，需要首先利用含有0.1％膠原酶和0.06mg/ml DNA酶I的混合液，即消化液I對DRG神經(jīng)節(jié)表面的結(jié)締組織進行消化。然后，在利用消化液II對DRG神經(jīng)節(jié)內(nèi)部進行消化，這樣能夠?qū)RG神經(jīng)節(jié)進行有效的消化從而提高所獲細(xì)胞的量。另外，利用CCK8檢測細(xì)胞增殖速率發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠雪旺細(xì)胞生長最適的氧濃度不同于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，前者在6％氧濃度時能夠保持較高的增殖速率(如表1所示)。

表1.不同氧濃度對裸鼴鼠雪旺細(xì)胞增殖速率的影響(OD450)

注：**，P＜0.01，與5％O₂濃度相比。

綜上所述，本發(fā)明方法能夠簡便、高效、經(jīng)濟的獲得大量功能活性正常的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞，低氧條件下的培養(yǎng)能夠保證這種細(xì)胞在離體環(huán)境中依然能夠保持在體狀態(tài)下的生物學(xué)特性，從而便于直接在純凈的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中進一步研究裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的特殊生理功能，從而為探索其中的生物學(xué)機制并應(yīng)用于臨床相關(guān)領(lǐng)域提供重要的理論依據(jù)。

附圖說明

圖1為體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，為200倍放大，其中標(biāo)尺為20μm。

圖2為體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定，細(xì)胞用S100染色標(biāo)記，其中標(biāo)尺為20μm。

圖3為體外純化培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，細(xì)胞用S100染色標(biāo)記，標(biāo)尺為20μm。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

實施例1：裸鼴鼠雪旺細(xì)胞分離純化及培養(yǎng)

1、實驗材料

胚胎期58-65天的裸鼴鼠由中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。DNA酶I購自Solarbio生物科技有限公司，胰蛋白酶、左旋多聚賴氨酸、PDGFa、青鏈霉素混合液等購自Sigma公司，DMEM、低糖DMEM、澳洲來源胎牛血清等購自Thermo Fisher Scientific公司，培養(yǎng)皿、T25和T75培養(yǎng)瓶購自Corning公司。

混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基為含有體積百分?jǐn)?shù)為15％進口胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基。

雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為2％B27的Neurobasal并添加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.01mg/ml的PDGFa。

2、裸鼴鼠雪旺細(xì)胞分離純化及培養(yǎng)方法

A、收集裸鼴鼠雪旺細(xì)胞：取胚胎期58-65天的裸鼴鼠脊髓DRG神經(jīng)節(jié)，將DRG神經(jīng)節(jié)剪碎，加入組織消化液I(0.25％胰酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液)混勻之后于37℃消化30分鐘，再用組織消化液II(含有0.15％膠原酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液)于37℃消化30min；然后用2ml混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中將沉淀重懸并吹打成單細(xì)胞懸液；按照1×10⁶密度種于包被有左旋多聚賴氨酸的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶培養(yǎng)液體積為4ml；

B、裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)：將A中得到的細(xì)胞，用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天。自細(xì)胞接種之后，每3天采取半量換液法更換新鮮的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基。20天后，更換為雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基(Neurobasal：B27＝50:1，同時添加最終質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.01mg/ml的PDGFa)，即可得到純化的雪旺細(xì)胞，培養(yǎng)于35℃，氧濃度為6％，二氧化碳濃度為5％，濕度為96％的三氣培養(yǎng)箱中

實施例2：裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的鑒定

采用實施例1所得的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞的鑒定：利用4％多聚甲醛對處于增殖培養(yǎng)基中的雪旺細(xì)胞進行固定，并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、免疫細(xì)化化學(xué)等方法進行鑒定。

1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：

鑒定方法參考文獻中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestration of Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。

結(jié)果如圖2所示，光鏡下，雪旺細(xì)胞胞體呈圓形或橢圓形，胞體折光度較強，胞體周圍有一圈明顯的光暈，從胞體向周圍伸出二或三極突起。在雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，細(xì)胞依然能夠保持二或三極突起。

2、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：

鑒定方法參考文獻中所述(Wenjing Yang,Lin Xiao,Cui Li,Xiuyun Liu,Mingdong Liu,Qi Shao,Dan Wang,Aijun Huang and Cheng He.TIP30inhibits oligodendrocyte precursor cell differentiation via cytoplasmic sequestration of Olig1.Glia.2015；63(4):684-98.)。

結(jié)果如圖3所示，將差速貼壁純化的雪旺細(xì)胞進行爬片實驗，在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，利用4％多聚甲醛將細(xì)胞固定，然后利用抗雪旺細(xì)胞表面特異抗原S100的抗體進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果顯示，在雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基中，細(xì)胞能夠保持S100陽性的狀態(tài)。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，本發(fā)明分離純化的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞具備典型的雪旺細(xì)胞形態(tài)，呈S100陽性，并且具有典型的雙極或三極突起，并在純化培養(yǎng)基中能夠保持良好的增殖狀態(tài)。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。