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一種裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法與流程

文檔序號:12411466閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,包括以下步驟:

A、收集裸鼴鼠DRG混合神經(jīng)細(xì)胞:

分離胚胎期58-65天的裸鼴鼠脊髓DRG神經(jīng)節(jié),將DRG神經(jīng)節(jié)剪碎,加入組織消化液I混勻之后消化,再用組織消化液II消化;然后用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化,離心去除上清之后,在混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中將沉淀重懸并吹打成單細(xì)胞懸液;將單細(xì)胞懸液種于無菌且預(yù)先包被有基質(zhì)層的培養(yǎng)板中;

所述的組織消化液I為含有0.15%膠原酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液;

所述的組織消化液II為含有0.25%胰酶和0.03mg/ml DNA酶I的混合液;

所述的基質(zhì)層為左旋多聚賴氨酸的基質(zhì)層;

B、裸鼴鼠DRG混合神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng):

將步驟A得到的DRG混合神經(jīng)細(xì)胞,用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后更換新鮮的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基,之后每3天換一次培養(yǎng)基;培養(yǎng)25天后換為雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每三天更新一次培養(yǎng)基;

所述的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基為含有體積百分?jǐn)?shù)為15%進(jìn)口胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基;

所述的雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)為2%B27的Neurobasal并添加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.01mg/ml的PDGFa;

所述的三氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為:溫度控制在35±2℃,氧濃度為6%,二氧化碳濃度為5±2%,濕度為96±2%。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟A中,用顯微剪將神經(jīng)節(jié)組織剪碎至1mm3,加入組織消化液I混勻之后,于37℃消化30min,再用組織消化液II于37℃消化30min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟A中,用2ml混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟B中,用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),待其完全貼壁之后,更換新鮮的混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基,之后每3天更換一次培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟B中所述的三氣培養(yǎng)箱的參數(shù)設(shè)置為:溫度控制在35℃,氧濃度為6%,二氧化碳濃度為5%,濕度為96%。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟A中所述的左旋多聚賴氨酸濃度為0.01mg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟A中所述的離心參數(shù)設(shè)置為室溫下,1000rpm,5分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裸鼴鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟B中,用混合神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)于三氣培養(yǎng)箱中31天。

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