本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是涉及NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。

背景技術：

據(jù)推斷，最開始對于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應答反應可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細胞會釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關模式分子。這些損傷模式分子分別通過CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報。TAA本身通常被認為是上述“危險信號”的旁觀者，擔任抗腫瘤免疫應答反應起始階段的佐劑。根據(jù)這個例子可以說明，自發(fā)的免疫反應是由于存在于癌細胞中11000個基因突變而產(chǎn)生的新肽所引起的。然而，迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的人類的TAA通常是非突變的自身蛋白。我們因此推斷，來自于一些已知的TAA的內(nèi)在因子也可能在體內(nèi)最初階段的抗腫瘤免疫應答反應中發(fā)揮著作用。

在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應的內(nèi)在因子的過程中，我們將關注點放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細胞免疫反應能夠在患有NY-ESO-1表達的腫瘤病人身上常常檢測的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。此外，自發(fā)性NY-ESO-1抗原在黑色素瘤中的減少，表明了抗NY-ESO-1的免疫反應可能會影響腫瘤的自然史。與其他TAA相比，NY-ESO-1的免疫原性不是由于其更高的表達水平。事實上，至少在黑色素腫瘤中的NY-ESO-1的表達水平要顯著低于黑色素細胞分化抗原，如gp100，MART-1，TRP-1和TRP-2，，以及其他的腫瘤/睪丸抗原，如基于新鮮腫瘤樣本實時定量PCR分析的MAGE-1和MAGE-3。

我們最近研究了NY-ESO-1與在不成熟的樹突細胞，巨噬細胞，單核細胞表面上補體Cq1受體（在文獻中被視為等同于鈣網(wǎng)織蛋白）間特殊的聯(lián)系，從而說明了NY-ESO-1與先天性免疫系統(tǒng)之間的特異性相互作用。在這篇文章中，說明了NY-ESO-1的免疫原性，與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4有關。

技術實現(xiàn)要素：

據(jù)推斷，最開始對于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應答反應可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細胞會釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關模式分子。這些損傷模式分子分別通過CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報。TAA本身通常被認為是上述“危險信號”的旁觀者，擔任抗腫瘤免疫應答反應起始階段的佐劑。在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應的內(nèi)在因子的過程中，我們將關注點放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細胞免疫反應能夠在患有NY-ESO-1表達的腫瘤病人身上常常檢測的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。但NY-ESO-1的免疫原性與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4之間的聯(lián)系尚未清楚。

鑒于以上所述現(xiàn)有技術，本發(fā)明第一方面提供NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)。

相關數(shù)據(jù)顯示，從細菌及哺乳動物細胞中獲得的NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)（圖1A,B）。

本發(fā)明第二方面提供NY-ESO-1的聚合反應由其分子間的二硫鍵介導。

相關實驗顯示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。說明NY-ESO-1的聚合反應是由于其分子間的二硫鍵造成的。

本發(fā)明第三方面提供NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關。

相關數(shù)據(jù)顯示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。在癌細胞中存在的NY-ESO-1，同樣采用Western blot分析其在含有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中蛋白聚合情況，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1主要表現(xiàn)為三聚體及四聚體，很少發(fā)現(xiàn)存在二聚體及單體形式的現(xiàn)象（突變1C）。表明NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合是與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關的。

本發(fā)明第四方面提供TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合。

我們分別采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來的樹突細胞來進行NY-ESO-1的結(jié)合實驗，從而進行對比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒有顯著的影響（圖2A）。作為NY-ESO-1與TLR4之間直接聯(lián)系的證據(jù)，顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來（圖2C）。與全細胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動結(jié)合的。隨著聚合物的越來越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。這些實驗結(jié)果為NY-ESO-1能夠與人、鼠的樹突細胞結(jié)合是通過細胞表面的TLR4這一結(jié)論提供了依據(jù)。

本發(fā)明第五方面提供NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還可通過鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實驗采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來的樹突細胞來進行NY-ESO-1的結(jié)合實驗，從而進行對比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒有顯著的影響（圖2A）。因為NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還通過了鈣網(wǎng)蛋白的作用。

本發(fā)明第六方面提供聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

相關數(shù)據(jù)顯示，隨著聚合物的越來越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。實驗結(jié)果表明聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

本發(fā)明第七方面提供免疫球抗體反應由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與。

相關數(shù)據(jù)顯示，ESOcs1的引起的抗體的效價有某些程度上的減弱，然而ESOcs2， ESOcs3所引起的抗體其效價幾乎檢測不到。在TLR4基因敲除的小鼠中（圖3B），由野生型質(zhì)粒所編碼誘導的NY-ESO-1抗體的效價也有明顯的減弱，而β-gal特異性抗體的效價始終與在野生型小鼠中保持一致。表明NY-ESO-1抗體反應的TLR4依賴性。在抗體效價測定中顯示，在野生型小鼠中NY-ESO-1聚合體結(jié)果突變（半胱氨酸-絲氨酸替換）與抗體效價有某些聯(lián)系，但是在TLR4基因敲除的小鼠中，這種聯(lián)系沒有體現(xiàn)出來，例如，ESOcs1 在野生型小鼠能夠誘導產(chǎn)生相當高的抗體反應，而在TLR4基因敲除的小鼠中卻沒有此現(xiàn)象，從而假設ESOcs1與野生型 NY-ESO-1與的免疫原性相同。與此相反，ESOcs2所誘導的抗體在TLR4基因敲除的小鼠中表現(xiàn)了高的抗體效價，而在野生型小鼠中沒有檢測到抗體，此現(xiàn)象與野生型的NY-ESO-1不同，但很像HMGB-1的免疫原性很像。ESOcs3在兩種小鼠中只展現(xiàn)出了很小的免疫原性。說明免疫球抗體反應的是由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4來參與的。

本發(fā)明第八方面提供Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達。

相關實驗顯示，當Art與NY-ESO-1融合表達時，能夠顯著提高wtArt的免疫原性，并且使免疫反應加快，注射完抗原后加快轉(zhuǎn)入到產(chǎn)生抗體的階段（圖4A）。另外，NY-ESO-1與人的CA9基因融合表達的質(zhì)粒，pcDNA-CA9-ESO，與單獨編碼CA9基因的質(zhì)粒pcDNA-CA9，通過肌肉注射使產(chǎn)生免疫反應，比較兩者的免疫程度。結(jié)果顯示，通過注射融合質(zhì)粒Balb/c所產(chǎn)生的免疫反應，產(chǎn)生了高效價的NY-ESO-1抗體，而CA9抗體的效價相對較弱，反過來，在同樣的情況下只編碼CA9基因的質(zhì)粒并沒有產(chǎn)生任何抗體反應。因為pcDNA-CA9, pcDNA-ESO這兩種質(zhì)粒在之間相同的條件下，也并沒有引起任何的免疫反應，從而說明了這種CA9基因免疫原性的提高是依賴于于NY-ESO-1基因進行了融合表達。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實了NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應由其分子間的二硫鍵介導； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還可通過鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達。表明NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。

附圖說明：

圖1：NY-ESO-1的DC-結(jié)合特性與它由二硫鍵支撐的聚合物結(jié)構(gòu)有關。

A：用質(zhì)粒編碼NY-ESO-1轉(zhuǎn)染的人293細胞（第1列），GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人293細胞（第2列和第4列），融合了N-末端FLAG標簽的NY-ESO-1 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人293細胞(FLAG-ESO,第3列)。將細胞裂解液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡與mab131（第1列和第2列）和M2單克隆抗體（第3列和第4列）分別對NY-ESO-1和FLAG抗原決定基發(fā)生特異反應。值得注意的是，NY-ESO-1單體（單箭頭注明）的分子量為18 kDa；而它的二聚體（雙箭頭注明）和四聚體分別在免疫印跡中出現(xiàn)36和72 kDa的條帶。

B：部分純化的野生型（第4列），esocs1 NY-ESO-1，esocs2，和esocs3蛋白（分別為1–3列），用免疫印跡（Western blot）分析。所有的蛋白質(zhì)樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-tuPAGE），然后使131抗體進行Western blot檢測。值得注意的是，他的標簽NY-ESO-1單體及其變體均出現(xiàn)20 kDa。

C：分別為NY-ESO-1在黑色素瘤株397，624，2984，HEK293，黑色素瘤株M202，f5.1，f5.4，和F5.6（從第1列到第8列）中的Western blot分析。單體和二聚體分別以單雙箭頭注明。經(jīng)過PCR后，HEK293，M202，和f5.1均檢測不到NY-ESO-1表達。GAPDH表示在每列蛋白總數(shù)數(shù)量相等的陽性對照。

D：相比較于野生型NY-ESO-1聚合蛋白，由半胱氨酸到絲氨酸的突變引起的NY-ESO-1低聚物變體能夠降低小鼠和人類樹突狀細胞結(jié)合。ESO(1–74)有可通過單克隆抗體mAb131識別的B細胞表位，用于檢測并作為陰性對照。用蛋白酶K處理的NY-ESO-1蛋白可作為另一個對照。等NY-ESO-1摩爾濃度的gp100蛋白也作為陰性對照（數(shù)據(jù)未顯示）。實驗重復使用從三個不同的捐助者獲得的樹突狀細胞。未成熟的DC與NY-ESO-1在體外的明顯結(jié)合的范圍通常從8到80%不等，很大程度上是由于供體差異和實驗之間的變化。因此，通常在樹突狀細胞結(jié)合分析中沒有標準差。

E: NY-ESO-1結(jié)合人類樹突狀細胞的點陣圖顯示在（E）圖中，包括散點圖。MW，分子量。

圖2: 鼠及人的TLR4 參與到NY-ESO-1與未成熟樹突細胞結(jié)合的過程中

A：從野生型，TLR2基因敲除和 TLR4基因敲除的骨髓中獲得的未成熟的樹突細胞用來研究與NY-ESO-1的結(jié)合，按照之前所介紹的濃度。用FITC標記的抗體mAb131，來能夠穩(wěn)定的檢測到細胞。實驗結(jié)果要是三個平行的帶有方差的平均值，并進行t檢驗。當p值<0.05時，視為差異顯著，當p值<0.01時，視為差異極顯著。這個實驗要從三只不同的老鼠身上至少重復出兩次以上的同樣的結(jié)果。然而，實驗中存在一定的實驗差異，盡管實驗結(jié)果顯示的是樹突細胞與NY-ESO-1的相對比率。

B：抑制NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合是通過使用人的TLR4及CRT多克隆抗體來進行的，但是并沒有控制對照β-actin進行處理。樹突細胞結(jié)合實驗標準是在3u g/ml的NY-ESO-1蛋白條件下進行的，單獨的使用抗體或結(jié)合。實驗至少得到一次同樣得重復實驗結(jié)果。

C：聚合物NY-ESO-1與鼠得TLR4和CRT形成復雜得大分子結(jié)構(gòu)。Myc-Cap細胞的裂解產(chǎn)物與Myc標記的NY-ESO-1結(jié)合,用來做免疫共沉淀反應，用c-Myc的多克隆抗體進行檢測，結(jié)果為每組的第一列。然而總的細胞裂解液在每組的第二行。利用非變性的聚丙烯酰胺凝膠點用來進行wb，左邊的組用了抗－NY-ESO-1抗體，中間組是用了兔的抗TLR4抗體，右邊組用了兔的抗CRT抗體。請觀察NY-ESO-1，TLR4，CRT在沉淀復合物及細胞裂解液中的位置。

D：共同沉淀下來的NY-ESO-1和鼠的TLR4與多聚物NY-ESO-1聯(lián)系。在每一組，1-4到包含了Myc-Cap細胞的裂解產(chǎn)物與編碼NY-ESO-1，ESOcs1，ESOcs2，ESOcs3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合。沉淀產(chǎn)物也難怪抗c-Myc抗體來分離出NY-ESO-1及它的突變體，之后用兔的TLR4抗體（左上方），NY-ESO-1及它的突變體的mAb131抗體（左下方），TLR4在全細胞裂解液中在底部的圖中

圖3：NY-ESO-1和它的野生型變體以及TLR4基因敲除小鼠的免疫原性。

從C57BL / 10（A）和TLR4和C57BL／10scnj（B）免疫小鼠產(chǎn)生的分級轉(zhuǎn)化IgG抗體，是通過基因槍引入無內(nèi)毒素質(zhì)粒產(chǎn)生的。繪制每組三只小鼠平均OD值是基于用ELISA對特異性抗體的目標的檢測，即NY-ESO-1，HMGB-1，GAL蛋白。將前、后免疫血清都用ELISA稀釋五倍。如果在免疫之后對特定的抗原目標OD值增加超過2倍，，表明血清為陽性。整個實驗重復一次，獲得了類似的結(jié)果，而關鍵免疫做了第三次重復。

圖4：NY-ESO-1的體內(nèi)免疫佐劑作用

A：基因槍注射質(zhì)粒，造成免疫反應，產(chǎn)生艾蒿花粉主要過敏原Art 1抗體之后的兩周，將收集到的血清稀釋1-50倍。在第二次免疫之后餓兩周，將血清稀釋1-1250倍。編碼wtArt， wtArt –ESO融合，及密碼子替換的Art（重組）Art質(zhì)粒用來造成每組3只小鼠的免疫，同樣實驗結(jié)果要重復兩次。

B：CA9特定的抗體是由pcDNA-CA9-ESO編碼產(chǎn)生的CA9-ESO融合蛋白所產(chǎn)生的，并不是是由pcDNA-CA9所編碼的產(chǎn)生的單獨的CA9基因所產(chǎn)生的。免疫小鼠所產(chǎn)生的血清與帶有gfp質(zhì)粒（第1列），CA9基因的質(zhì)粒（第2，4列），NY-ESO-1基因的質(zhì)粒（第3，5列）的293細胞裂解液進行wb。全CA9以及NY-ESO-1蛋白都在圖中展示出來，在第2列的顏色稍微淡一些的陽性條帶可能是CA9的轉(zhuǎn)錄變體。每組3只老鼠，從采用三組老鼠血清池獲得結(jié)果。

C：從3只老鼠／每組獲得的抗CA9抗體通過ELISA來分析重組的人CA9。一種以pcDNA-CA9為基礎的質(zhì)粒編碼，在相對于在鹽離子存在下pcDNA-CA9或是在pcDNA-CA9與pcDNA-ESO共同存在的情況下，CA9-ESO融合基因能夠顯著提高抗體的效價。所有的無內(nèi)毒素的質(zhì)粒都是經(jīng)過肌肉注射到Balb/c小鼠體內(nèi)。此實驗結(jié)果重復1次。

圖5. 一種假定的機制在癌癥患者中NY-ESO-1蛋白的免疫原性

在癌癥環(huán)境中，從壞死的癌細胞中產(chǎn)生的NY-ESO-1與鈣網(wǎng)蛋白－Toll樣受體4（CRT-TLR4 ）復合物在樹突細胞表面發(fā)生聯(lián)系。由于CRT沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，與TLR4進行復合。NY-ESO-1與CRT-TLR4復合物連接，從而引起了吞噬反應及產(chǎn)生危險信號。樹突細胞產(chǎn)生了NY-ESO-1短肽以及分泌出促炎癥因子和趨化因子。NY-ESO-1不會在健康人的身上引起免疫反應，因為它的表達最開始室受到睪丸免疫特權(quán)區(qū)域的限制。

具體實施方式：

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規(guī)的相關融合質(zhì)粒構(gòu)建法，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，Western blotting，免疫共沉淀，ELISA，樹突狀細胞結(jié)合法，數(shù)據(jù)分析及相關領域的常規(guī)技術。

據(jù)推斷，最開始對于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應答反應可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細胞會釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關模式分子。這些損傷模式分子分別通過CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報。TAA本身通常被認為是上述“危險信號”的旁觀者，擔任抗腫瘤免疫應答反應起始階段的佐劑。在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應的內(nèi)在因子的過程中，我們將關注點放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細胞免疫反應能夠在患有NY-ESO-1表達的腫瘤病人身上常常檢測的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。但NY-ESO-1的免疫原性與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4之間的聯(lián)系尚未清楚。

NY-ESO-1與在不成熟的樹突細胞，巨噬細胞，單核細胞表面上補體Cq1受體間存在特殊的聯(lián)系，NY-ESO-1與先天性免疫系統(tǒng)之間的特異性相互作用。通過相關實驗，我們發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應由其分子間的二硫鍵介導； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還可通過鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達。證實了NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。

相關融合質(zhì)粒構(gòu)建法

在之前的文章中介紹過的只有1-74位氨基酸殘基的NY-ESO-1，被稱為ESO（1-74）。為了在NY-ESO-1 cDNA中引入定點突變，利用PCR擴增來將75，76,78位的半胱氨酸換成絲氨酸。使用下列的一對磷酸化的引物：正向引物， 5-TCCTCCAGATCCGGGGCCAGGGGGCCGGAGAG（下劃線表示突變）和反向引物，5-TCCATTCAGCCCTGAAGCCGCGCCGCCAT。PCR的模板為之前介紹過的表達載體PET-28-NY-ESO-1，用高保真PCR擴增系統(tǒng)（Invitrogen）進行擴增。PCR產(chǎn)物連接在載體上使其形成一個能夠編碼ESOcs1的新的質(zhì)粒。用同樣的方法引入在氨基酸152和165號位上從半胱氨酸到絲氨酸的突變，被稱為ESOcs2，使用下列一對引物：正向引物，5-TTGATGTGGATCACGCAGTCCTTTCTGCCCGTG，反向引物，5-CAGGGAAAGCTGCTGGAGAGAGGAGCTGATG（下劃線部分表示突變的核苷酸）。同樣，能夠產(chǎn)生以上5種75,76,78,152及165位半胱氨酸-絲氨酸替換突變的質(zhì)粒（命名為ESOcs3），也用上述方法進行構(gòu)建。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法

HEK293及黑色素瘤細胞系397,624,2984從美國國家癌癥研究所獲得，均保存在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。黑色素瘤細胞系M202，F(xiàn)5.1，F(xiàn)5.4及F5.6原發(fā)腫瘤細胞的早期培養(yǎng)物，由Ali Jazirehi (UCLA)贈與。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）系統(tǒng)轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到293細胞中。Western blotting實驗利用ECL發(fā)光系統(tǒng)（R&D公司，Minneapolis, MN）

免疫印跡法（Western blotting）

免疫印跡法（Western blotting）實驗利用ECL發(fā)光系統(tǒng)（R&D公司，Minneapolis, MN）。

免疫共沉淀法

免疫共沉淀是小鼠的Myc-CaP細胞系進行的，即能夠表達小鼠的TLR4及CRT，此細胞是Charles Sawyers(Memorial Sloan Kettering Cancer Institute, New York, NY)贈與。Myc-Cap是通過導入了逆轉(zhuǎn)錄病毒來編碼NY-ESO-1基因，并且這個逆轉(zhuǎn)錄病毒融合了c-Myc標簽。從10cm的培養(yǎng)皿中獲得細胞，并用含有蛋白酶抑制劑的50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2/CaCl2來裂解細胞。細胞裂解液與抗體過夜孵育，采用特異性結(jié)合有c-Myc標簽磁珠將特異性蛋白分離了出來，通過非變性凝膠或是還原型SDS-PAGE來分析全蛋白。

細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法

Verikine TM鼠干擾素α酶聯(lián)免疫試劑盒從PBL InterferonSource公司（皮斯卡塔韋，新澤西州）購買。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，利用該試劑盒測定細胞因子水平。

樹突狀細胞結(jié)合法

人的樹突狀細胞是從孤立的CD14(Miltenyi Biotech)得到的，即在1000單位/毫升人的GM-CSF (Amgen,Thousand Oaks, CA)和1000單位/毫升人的IL-4(Schering-Plough, San Francisco, CA)中保存6天的陽性單核細胞。在Iscove’s medium (Invitrogen)培養(yǎng)液中加入10%人類雄性血清(BioCheMed, Winchester, VA)用于樹突狀細胞的培養(yǎng)。按照之前的實驗計劃，小鼠的樹突狀細胞是從C57BL／10小鼠和相應的TLR2和TLR4基因敲除小鼠的骨髓細胞產(chǎn)生的(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)。

按照之前的描述，所有的樹突狀細胞結(jié)合實驗都在冰上進行，以防止由不成熟的樹突狀細胞導致的目標蛋白的內(nèi)部活化。如果沒有特別注明，我們使用的蛋白濃度分別為3, 10, 和1μg/ml，目的是維持NY-ESO-1以及它的突變體,gp100, ESO(1–74)這些蛋白所使用的摩爾濃度保持一致。大約105從鼠和人中獲得的預先預冷的，不成熟的樹突細胞與上述蛋白在50ul的含有5%的胎牛血清的PBS緩沖液中混合，來消除非特異性反應。在冰上孵育20min后，將樣品洗兩次，然后加入FITC標記的二次抗體，此單克隆抗體要么是針對NY-ESO-1的抗體要么是針對多組氨酸標簽(Sigma/Aldrich)的抗體。細胞孵育20min,清洗2遍，并進行流式細胞分析。

相關數(shù)據(jù)分析方法

實施例1

NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)。

實驗發(fā)現(xiàn)從細菌及哺乳動物細胞中獲得的NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)（圖1A,B）。

實施例2

NY-ESO-1的聚合反應由其分子間的二硫鍵介導。

將75,76,78,152及165位的氨基酸殘基中的半胱氨酸替換成絲氨酸。三種帶有氨基酸替換的NY-ESO-1分別為：在75,76,78位半胱氨酸-絲氨酸替換的ESOcs1，在152,165位替換的ESOcs2以及以上五個位點都替換突變的ESOcs3。將這些蛋白進行純化并用Western blot來比較它們之間的齊聚反應狀態(tài)(圖1B)。結(jié)果顯示出，野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。這個實驗說明了NY-ESO-1的聚合反應是由于其分子間的二硫鍵造成的。

實施例3

NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關。

將這些蛋白進行純化并用Western blot來比較它們之間的齊聚反應狀態(tài)(圖1B)。結(jié)果顯示出，野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。這個實驗說明了NY-ESO-1的聚合反應是由于其分子間的二硫鍵造成的。在癌細胞中存在的NY-ESO-1，同樣采用Western blot分析其在含有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中蛋白聚合情況，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1主要表現(xiàn)為三聚體及四聚體，很少發(fā)現(xiàn)存在二聚體及單體形式的現(xiàn)象（突變1C）。實驗表明NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合是與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關的。

實施例4

TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合。

我們分別采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來的樹突細胞來進行NY-ESO-1的結(jié)合實驗，從而進行對比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒有顯著的影響（圖2A）。因為NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還通過了鈣網(wǎng)蛋白的作用，它能夠使TLR4基因敲除的小鼠依然保持著與樹突細胞結(jié)合的作用。采用抗-TLR4抗體處理能夠阻止NY-ESO-1與人，鼠的樹突細胞結(jié)合，此現(xiàn)象也可以通過采用抗-CRT抗體處理（圖2B）；同時，采用β-actin的抗體作為陰性對照，此抗體對NY-ESO-1與樹突細胞的結(jié)合沒有影響。在與上述相同的實驗條件下，用兩種抗體同時對TLR4及CRT進行處理，并沒有顯示出明顯對NY-ESO-1/DC細胞之間聯(lián)系的協(xié)同抑制作用。作為NY-ESO-1與TLR4之間直接聯(lián)系的證據(jù)，顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來（圖2C）。與全細胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動結(jié)合的。這一結(jié)果與研究不同突變的NY-ESO-1（圖1D）與未成熟的DC細胞結(jié)合的結(jié)果一致，隨著聚合物的越來越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。這些實驗結(jié)果為NY-ESO-1能夠與人、鼠的樹突細胞結(jié)合是通過細胞表面的TLR4這一結(jié)論提供了依據(jù)。

實施例5

NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還可通過鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實驗采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來的樹突細胞來進行NY-ESO-1的結(jié)合實驗，從而進行對比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒有顯著的影響（圖2A）。因為NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還通過了鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實施例6

聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

相關數(shù)據(jù)顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來（圖2C）。與全細胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動結(jié)合的。這一結(jié)果與研究不同突變的NY-ESO-1（圖1D）與未成熟的DC細胞結(jié)合的結(jié)果一致，隨著聚合物的越來越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。實驗結(jié)果表明聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

實施例7

免疫球抗體反應由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與。

我們采用標準的基因槍程序方法將無內(nèi)毒素的編碼野生型NY-ESO-1基因以及其不同突變基因的質(zhì)粒（包括自然存在的變種LAGE-1b）轉(zhuǎn)入到C57BL/10及C57BL/10ScNJ(TLR4-/-)中，來使動物產(chǎn)生免疫。質(zhì)粒所編碼的β-gal及膜錨定蛋白HMGB-1作為對照。每間隔兩個星期做一次免疫反應，共兩次。在第二次免疫反應后的兩周，將小鼠處死，取其血清來分析其抗體效價。野生型小鼠的抗原特異性，抗體分類可通過質(zhì)粒編碼的NY-ESO-1序列及陽性對照質(zhì)粒pSport-β-gal快速而有效的區(qū)分開來（圖3A）。注意到了ESO(1-74)蛋白中，其包含了被NY-ESO-1及其變體共享的占主導地位的B細胞表位，用來測定抗體，并通過由低聚變體誘導的抗體來使與野生型NY-ESO-1相結(jié)合的潛在差異降到最低。ESOcs1的引起的抗體的效價有某些程度上的減弱，然而ESOcs2， ESOcs3所引起的抗體其效價幾乎檢測不到。在TLR4基因敲除的小鼠中（圖3B），由野生型質(zhì)粒所編碼誘導的NY-ESO-1抗體的效價也有明顯的減弱，而β-gal特異性抗體的效價始終與在野生型小鼠中保持一致。表明NY-ESO-1抗體反應的TLR4依賴性，而免疫的過程（皮膚）和原理（基因槍將質(zhì)粒注入體內(nèi)）不受TLR4支配。奇怪的是，一種早前報道過的與TLR4有某些聯(lián)系的蛋白HMGB－1，由編碼HMGB-1基因的質(zhì)粒做引起的免疫反應只引起了TLR4基因缺失小鼠體內(nèi)的少量的抗體（從圖3B中可以看出，HMGB-1的抗體ELISA結(jié)果比NY-ESO-1, β-gal的背景小很多），但是在能夠與TLR4反應的野生型小鼠體內(nèi)沒有檢測到抗體。在抗體效價測定中顯示，在野生型小鼠中NY-ESO-1聚合體結(jié)果突變（半胱氨酸-絲氨酸替換）與抗體效價有某些聯(lián)系，但是在TLR4基因敲除的小鼠中，這種聯(lián)系沒有體現(xiàn)出來，例如，ESOcs1 在野生型小鼠能夠誘導產(chǎn)生相當高的抗體反應，而在TLR4基因敲除的小鼠中卻沒有此現(xiàn)象，從而假設ESOcs1與野生型 NY-ESO-1與的免疫原性相同。與此相反，ESOcs2所誘導的抗體在TLR4基因敲除的小鼠中表現(xiàn)了高的抗體效價，而在野生型小鼠中沒有檢測到抗體，此現(xiàn)象與野生型的NY-ESO-1不同，但很像HMGB-1的免疫原性很像。ESOcs3在兩種小鼠中只展現(xiàn)出了很小的免疫原性。這個實驗說明了免疫球抗體反應的是由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4來參與的。

實施例8

Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達。

我們利用小鼠研究了NY-ESO-1對于過敏原免疫反應的分子佐劑的作用。一個NY-ESO-1基因與艾蒿花粉主要過敏原基因融合表達的質(zhì)粒通過基因槍轉(zhuǎn)入到了Balb/c小鼠內(nèi)。眾所周知，Art v1(wtArt)在體內(nèi)小鼠有著很低的免疫原性，例如，將野生型的Art基因疫苗注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，并沒有展示出其免疫原性，但是可以通過改變某些密碼子來變?yōu)椴溉閯游锬軌蚓幋a的密碼子及可得到克服（重組Art）。當Art與NY-ESO-1融合表達時，能夠顯著提高wtArt的免疫原性，并且使免疫反應加快，注射完抗原后加快轉(zhuǎn)入到產(chǎn)生抗體的階段（圖4A）。并且，通過這個一次免疫反應產(chǎn)生的抗體比通過重組Art產(chǎn)生抗體更具有深遠的意義，因為兩者產(chǎn)生的抗體都達到了同樣的水平，但后者是通過兩次免疫才產(chǎn)生抗體。

另一個例子，NY-ESO-1與人的CA9基因融合表達的質(zhì)粒，pcDNA-CA9-ESO，與單獨編碼CA9基因的質(zhì)粒pcDNA-CA9，通過肌肉注射使產(chǎn)生免疫反應，比較兩者的免疫程度。結(jié)果顯示，通過注射融合質(zhì)粒Balb/c所產(chǎn)生的免疫反應，產(chǎn)生了高效價的NY-ESO-1抗體，而CA9抗體的效價相對較弱，反過來，在同樣的情況下只編碼CA9基因的質(zhì)粒并沒有產(chǎn)生任何抗體反應。因為pcDNA-CA9, pcDNA-ESO這兩種質(zhì)粒在之間相同的條件下，也并沒有引起任何的免疫反應，從而說明了這種CA9基因免疫原性的提高是依賴于于NY-ESO-1基因進行了融合表達。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實了NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應由其分子間的二硫鍵介導； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹突細胞結(jié)合還可通過鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達。表明NY-ESO-1通過聚合結(jié)構(gòu)域介導自身未成熟的樹突細胞的體外結(jié)合。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。