本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基及體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，主要分布在外周血中。NK細(xì)胞作為機(jī)體防御體系的第一道防線，不僅可以在天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮其主要?dú)⒘鲂?yīng)，而且在免疫反應(yīng)的早期可以分泌不同的細(xì)胞因子和各種趨化因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答，是機(jī)體發(fā)揮免疫效應(yīng)不可或缺的效應(yīng)細(xì)胞。

NK細(xì)胞在外周血中的含量遠(yuǎn)不能滿足臨床需要，目前主要利用細(xì)胞因子的刺激來(lái)擴(kuò)增NK細(xì)胞，但上述方法擴(kuò)增的NK細(xì)胞與臨床需求仍存在一定的差距。如何提供一種可擴(kuò)增出大量且高活性的NK細(xì)胞的培養(yǎng)基，是NK細(xì)胞體外擴(kuò)增領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基及體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，可擴(kuò)增出數(shù)量大、活性高、殺傷性強(qiáng)的NK細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種NK細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來(lái)那度胺、8-16mmol/L HEPES。

其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基。

其中，添加物各組分及濃度為：9-11g/L人血清白蛋白、3.5-6.5mmol/L尼克酰胺、0.8-1.5μmol/L來(lái)那度胺、9-15mmol/L HEPES。

其中，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來(lái)那度胺、10mmol/L HEPES。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，包括以下步驟：將制備的NK細(xì)胞懸于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中，并將懸有NK細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，NK細(xì)胞的密度為4.5×10⁶-5.5×10⁶個(gè)/20ml；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入體積比為15%-25%的自體血漿及5-15μg/ml抗Her-2單克隆抗體、950-1050U/ml重組人IL-2、25-35ng/ml重組人IL-15、5-15ng/ml重組人IL-21，并將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；間隔預(yù)定時(shí)間補(bǔ)加NK細(xì)胞培養(yǎng)基及950-1050U/ml重組人IL-2、25-35ng/ml重組人IL-15、5-15ng/ml重組人IL-21，當(dāng)培養(yǎng)體系為90-110ml時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)；培養(yǎng)預(yù)定天數(shù)后，獲得擴(kuò)增的NK細(xì)胞；其中，NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來(lái)那度胺、8-16mmol/L HEPES。

其中，初始懸于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中的NK細(xì)胞的密度為5×10⁶個(gè)/20ml。

其中，自體血漿的濃度為體積比20%，抗Her-2單克隆抗體的濃度為10μg/ml，重組人IL-2的濃度為1000U/ml，重組人IL-15的濃度為30ng/ml，重組人IL-21的濃度為10ng/ml。

其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基。

其中，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來(lái)那度胺、10mmol/L HEPES。

其中，細(xì)胞培養(yǎng)袋為透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋。

本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基，添加物各組分及濃度為：8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺、0.5-2.0μmol/L來(lái)那度胺、8-16mmol/L HEPES。通過(guò)上述培養(yǎng)基體外擴(kuò)增NK細(xì)胞，可擴(kuò)增出數(shù)量大、活性高、殺傷性強(qiáng)的NK細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞流式結(jié)果圖一；

圖2是本發(fā)明體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞流式結(jié)果圖二。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法如下：將制備的NK細(xì)胞懸于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中，NK細(xì)胞的密度為5×10⁶個(gè)/20ml，然后將懸有NK細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入體積比為20%的自體血漿及10μg/ml抗Her-2單克隆抗體、1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔3天補(bǔ)加NK細(xì)胞培養(yǎng)基及1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，當(dāng)培養(yǎng)體系為100ml時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.9L細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)14天后，從培養(yǎng)袋中取出細(xì)胞，獲得擴(kuò)增的NK細(xì)胞。其中，細(xì)胞培養(yǎng)袋為透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋。

在本實(shí)施例中，NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、1.0μmol/L來(lái)那度胺、10mmol/L HEPES。

在本實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶為T75培養(yǎng)瓶。

請(qǐng)參閱圖1，圖1是本實(shí)施例體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞流式結(jié)果圖，如圖1所示，由于制備的NK細(xì)胞純度沒(méi)有100%，因此還存在其他細(xì)胞的擴(kuò)增。圖1分為4個(gè)象限：左上，CD（16+56）陽(yáng)性、CD3陰性，此細(xì)胞即為NK細(xì)胞，占84.7%；右上，CD3陽(yáng)性、CD（16+56）陽(yáng)性，此細(xì)胞即為NKT細(xì)胞（既有T細(xì)胞表型，又有NK細(xì)胞表型），占10.8%；右下，CD3陽(yáng)性、CD（16+56）陰性，此細(xì)胞即為T細(xì)胞，占4.27%；左下，雜細(xì)胞，占0.161%。由圖1可以看出，本實(shí)施例的擴(kuò)增效果非常可觀。

實(shí)施例2

體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法如下：將制備的NK細(xì)胞懸于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中，NK細(xì)胞的密度為5×10⁶個(gè)/20ml，然后將懸有NK細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入體積比為20%的自體血漿及10μg/ml抗Her-2單克隆抗體、1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔3天補(bǔ)加NK細(xì)胞培養(yǎng)基及1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21，當(dāng)培養(yǎng)體系為100ml時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.9L細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)14天后，從培養(yǎng)袋中取出細(xì)胞，獲得擴(kuò)增的NK細(xì)胞。其中，細(xì)胞培養(yǎng)袋為透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋。

在本實(shí)施例中，NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基，添加物各組分及濃度為：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、1.2μmol/L來(lái)那度胺、12mmol/L HEPES。

在本實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶為T75培養(yǎng)瓶。

請(qǐng)參閱圖2，圖2是本實(shí)施例體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞流式結(jié)果圖，如圖2所示，由于制備的NK細(xì)胞純度沒(méi)有100%，因此還存在其他細(xì)胞的擴(kuò)增。圖2分為4個(gè)象限：左上，CD（16+56）陽(yáng)性、CD3陰性，此細(xì)胞即為NK細(xì)胞，占84.9%；右上，CD3陽(yáng)性、CD（16+56）陽(yáng)性，此細(xì)胞即為NKT細(xì)胞（既有T細(xì)胞表型，又有NK細(xì)胞表型），占10.9%；右下，CD3陽(yáng)性、CD（16+56）陰性，此細(xì)胞即為T細(xì)胞，占4.05%；左下，雜細(xì)胞，占0.159%。由圖2可以看出，本實(shí)施例的擴(kuò)增效果非?？捎^。

對(duì)比例1

體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法如下：將制備的NK細(xì)胞懸于NK細(xì)胞培養(yǎng)基中，NK細(xì)胞的密度為5×10⁶個(gè)/20ml，然后將懸有NK細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔3天補(bǔ)加NK細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)體系為100ml時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.9L細(xì)胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)14天后，從培養(yǎng)袋中取出細(xì)胞，獲得擴(kuò)增的NK細(xì)胞。

其中，NK細(xì)胞培養(yǎng)基包括1000U/ml重組人IL-2、30ng/ml重組人IL-15、10ng/ml重組人IL-21。

對(duì)比例2

擴(kuò)增方法與實(shí)施例1相同，擴(kuò)增所使用的NK細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基，添加物各組分及濃度為：10g/L人血清白蛋白、5mmol/L尼克酰胺、10mmol/L HEPES。

對(duì)比例3

擴(kuò)增方法與實(shí)施例2相同，擴(kuò)增所使用的NK細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MEM-alpha培養(yǎng)基，添加物各組分及濃度為：11g/L人血清白蛋白、6mmol/L尼克酰胺、12mmol/L HEPES。

實(shí)驗(yàn)例1

分別在0、7、14天取實(shí)施例1、實(shí)施例2、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3培養(yǎng)的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以第0天的細(xì)胞數(shù)，得到擴(kuò)增倍數(shù)。

表1 NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)

根據(jù)表1所示，實(shí)施例1、實(shí)施例2擴(kuò)增的NK細(xì)胞數(shù)量明顯大于對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3擴(kuò)增的NK細(xì)胞數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)例2

以處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人白血病細(xì)胞K562為靶細(xì)胞，將實(shí)施例1、實(shí)施例2、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3擴(kuò)增的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，采用LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷活性。具體為：按1:1、10:1、20:1的效靶比將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合，同時(shí)設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞孔、靶細(xì)胞孔，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm時(shí)的OD值。其中，殺傷率計(jì)算公式為：殺傷率=[1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞孔OD值/靶細(xì)胞孔OD值）]×100%，實(shí)驗(yàn)孔為含有效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的孔。

表2 NK細(xì)胞殺傷率

根據(jù)表2所示，在不同效靶比的情況下，實(shí)施例1、實(shí)施例2擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷活性均高于對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3擴(kuò)增的NK細(xì)胞的殺傷活性。

綜上所述，利用本發(fā)明的NK細(xì)胞培養(yǎng)基及體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，可擴(kuò)增出數(shù)量大、活性高、殺傷性強(qiáng)的NK細(xì)胞。需要指出的是，本發(fā)明的NK細(xì)胞培養(yǎng)基為用于體外擴(kuò)增NK細(xì)胞的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。