本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，涉及DC-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)，具體涉及miRNA-155及其抑制劑在DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物免疫療法是通過從體外補(bǔ)充、誘導(dǎo)或活化機(jī)體內(nèi)本來固有的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)系統(tǒng)，活化和調(diào)動(dòng)具有細(xì)胞毒活性的生物活性細(xì)胞和細(xì)胞因子，以調(diào)整各種免疫殺傷性的生物反應(yīng)。目前在免疫治療方面研究應(yīng)用較多的有淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、共培養(yǎng)免疫(DC-CIK)細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞型的淋巴細(xì)胞，其中DC和CIK細(xì)胞是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，它們之間的相互作用所誘發(fā)的免疫應(yīng)答是免疫抑瘤效應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[王志華等，CIK細(xì)胞治療癌癥：國(guó)際臨床試驗(yàn)的現(xiàn)狀及展望，中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2013，20(2):129-137]。

DC首先在小鼠脾臟中發(fā)現(xiàn)，因其成熟時(shí)細(xì)胞表面伸出膜狀或刺狀突起而得名。DC的前體細(xì)胞為CD34+或CD14+細(xì)胞，存在于人骨髓、臍血中的CD34+或CD14+細(xì)胞，體外添加粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α的培養(yǎng)條件下可發(fā)育成DC，DC主要分為髓系DC和淋巴系DC，髓系DC包括CD34+干細(xì)胞來源的DC、單核細(xì)胞衍生的DC等。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，表面具有豐富的有助于抗原呈遞的分子，如主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ，共刺激分子B7-1、B7-2，細(xì)胞黏附分子1、3以及淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1、3等，能有效激活初始T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體長(zhǎng)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。

CIK是將人外周血單核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群對(duì)腫瘤細(xì)胞有高度殺傷能力且具有不同細(xì)胞表型的異質(zhì)細(xì)胞。其中CD3+CD56+細(xì)胞是CIK細(xì)胞群體中的主要效應(yīng)細(xì)胞，被稱為自然殺傷細(xì)胞型淋巴細(xì)胞，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。因此，CIK細(xì)胞對(duì)多種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，患者自身來源的CIK抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于自體淋巴細(xì)胞激活的殺傷細(xì)胞，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明CIK對(duì)BALB/c裸鼠負(fù)荷的BEL-7402肝癌生長(zhǎng)的平均抑制率明顯高于殺傷細(xì)胞。

雖然目前大量研究顯示DC、DC瘤苗、CIK細(xì)胞有顯著的抗腫瘤作用，但是臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用DC、CIK細(xì)胞治療腫瘤效果并不是很理想，腫瘤細(xì)胞對(duì)這些免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生抵抗導(dǎo)致過繼免疫療效不佳。DC和CIK是腫瘤免疫治療的兩部分，DC識(shí)別病原，激活獲得性免疫系統(tǒng)，而CIK通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性與分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，設(shè)想可將CIK細(xì)胞和DC聯(lián)合起來治療惡性腫瘤，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。實(shí)驗(yàn)研究還證實(shí)，DC-CIK共培養(yǎng)后其抗腫瘤活性明顯高于單純CIK。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供miRNA-155作為藥物靶標(biāo)在提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力中的應(yīng)用；其次提供miRNA-155抑制劑或含有該抑制劑的試劑或試劑盒在提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力中的應(yīng)用，并提供太子參環(huán)肽B和太子參環(huán)肽C作為有效miRNA-155抑制劑。

本發(fā)明通過如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

miRNA-155作為藥物靶標(biāo)在提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力中的應(yīng)用。

所述的應(yīng)用指利用miRNA-155表達(dá)下調(diào)的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)提高CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

進(jìn)一步地，所述腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞。

miRNA-155抑制劑在提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述miRNA-155抑制劑為太子參環(huán)肽B。

進(jìn)一步地，所述miRNA-155抑制劑為太子參環(huán)肽C。

一種含有miRNA-155抑制劑的試劑或試劑盒在提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述miRNA-155抑制劑為太子參環(huán)肽B。

進(jìn)一步地，所述miRNA-155抑制劑為太子參環(huán)肽C。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC-CIK細(xì)胞比miRNA-155正常表達(dá)的DC-CIK細(xì)胞具有更高的殺傷力，而miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC細(xì)胞與miRNA-155正常表達(dá)的DC細(xì)胞的殺傷力基本一致，無顯著性差異。這表明，miRNA-155下調(diào)并不能直接提高DC細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷力，但是miRNA-155下調(diào)的DC細(xì)胞可以通過共培養(yǎng)顯著增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。因此，miRNA-155可以作為藥物靶標(biāo)用于提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。本發(fā)明提供了兩種天然化合物作為miRNA-155有效抑制劑，天然化合物來源比合成的核苷酸類siRNA具有更高的化學(xué)穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為抑制組、對(duì)照組和陰性對(duì)照組DC細(xì)胞miRNA-155的相對(duì)表達(dá)量；

圖2為不同組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)白血病K562/A02細(xì)胞系的殺傷活性；

圖3為不同組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)白血病THP-1細(xì)胞系的殺傷活性；

圖4為不同組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)白血病HL-60細(xì)胞系的殺傷活性。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步介紹。實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。

實(shí)施例1：miRNA-155對(duì)DC-CIK細(xì)胞共培養(yǎng)的影響

一、實(shí)驗(yàn)材料

1、miRNA-155 inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供(如下序列1)；inhibitor negative control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供(如下序列2)。

序列1：5’-ACCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA-3’；

序列2：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

2、腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、效應(yīng)細(xì)胞DC與CIK的分離培養(yǎng)

(1)單個(gè)核細(xì)胞的分離：采集健康志愿者外周血20mL，預(yù)冷的PBS 1:1稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層，650g，4℃離心20min，收集白色細(xì)胞層，分離單個(gè)核細(xì)胞，1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后置于37℃，5％CO₂孵箱中孵育2h。

(2)DC細(xì)胞的培養(yǎng)：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)2h后收集貼壁細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)誘導(dǎo)DC生成，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)，每2天半量換液一次，換液后補(bǔ)充GM-CSF、IL-4，于第6d在培養(yǎng)基中添加TNF-α誘導(dǎo)DC成熟(100ng/mL)，連續(xù)培養(yǎng)7d，收集細(xì)胞備用。

(3)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)：收集單核細(xì)胞中的懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml，在完全培養(yǎng)基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3單抗(50μg/mL)。每2-3d進(jìn)行換液，并補(bǔ)充等量的細(xì)胞因子，連續(xù)培養(yǎng)7天，收集細(xì)胞備用。

2、效應(yīng)細(xì)胞DC的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑為美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的lipofectamine2000，嚴(yán)格按照使用說明操作。

(1)傳細(xì)胞培養(yǎng)板：以6孔板為例，轉(zhuǎn)染前一天，按1×10⁶/ml密度接種DC細(xì)胞于6孔板，每孔加2ml培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度達(dá)60％。

(2)用DEPC水稀釋miRNA-155 inhibitor或inhibitor negative control(NC)，配制終濃度為20μM的存儲(chǔ)液，分裝使用。

(3)配制混合液：

miRNA-155 inhibitor或NC混合液：取10μl上述存儲(chǔ)液，用opti-MEM稀釋，輕輕混勻，配制250μl稀釋液A；lipofectamine2000稀釋液：取5μl lipofectamine2000，用opti-MEM稀釋，輕輕混勻，配制250μl稀釋液B。

(4)稀釋液A和稀釋液B室溫孵育5分鐘后，將二者輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，配制總體積為500μl的稀釋液C。

(5)將6孔板內(nèi)原培養(yǎng)基吸去，PBS沖洗1次后吸去，每孔加入1.5ml opti-MEM。將稀釋液C加入每孔，使得每孔液體總體積為2ml，miRNA-155 inhibitor或NC濃度為100nM。

(6)將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時(shí)，吸去含有miRNA-155 inhibitor或NC的培養(yǎng)基，PBS沖洗1次后，加入完全培養(yǎng)基2ml，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

3、效應(yīng)細(xì)胞DC轉(zhuǎn)染后miRNA-155的表達(dá)量(qRT-PCR)

3.1細(xì)胞總RNA的提取

(1)吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus 1ml，緩慢吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分裂解；

(2)將裂解液吸出轉(zhuǎn)入1.5ml EP管中，冰上靜置5min；

(3)在EP管中加入氯仿200μl，劇烈震蕩混勻約15秒，冰上靜置3min；然后于4℃條件下12000g/min離心15分鐘；

(4)離心后吸取EP管中上層水相液體500μl轉(zhuǎn)入新的1.5ml EP管中，加入異丙醇500μl，顛倒混勻，冰上靜置10min；然后于4℃條件下12000g/min離心10分鐘；

(5)將EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震蕩混勻，重懸白色沉淀；然后于4℃條件下7500g/min離心10分鐘；

(6)吸去EP管中液體，可見管中沉淀，室溫中干燥5分鐘后用DEPC水30μl左右溶解沉淀獲得總RNA，置于4℃冰箱過夜；

(7)取2μl上述總RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀釋的總RNA，測(cè)定濃度和純度；置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 miRNA-155逆轉(zhuǎn)錄

(1)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

用Hairpin-it^TMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)按照說明書在DEPC處理的200μl EP管中配制如下反應(yīng)體系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RT primers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNA sample，1μg；加RNase Free H₂O至20μl。將該體系輕輕混勻后，瞬時(shí)離心，設(shè)置反應(yīng)條件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反應(yīng)產(chǎn)物cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將cDNA稀釋3倍，然后混勻并吸取2μl作模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書配制如下反應(yīng)體系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNA RT Product，2μl；Taq DNA polymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH₂O至20μl。將該體系輕輕混勻后，瞬時(shí)離心，設(shè)置反應(yīng)條件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。

miRNA-155以U6為內(nèi)參，miRNA-155和U6的引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

4、效應(yīng)細(xì)胞DC與CIK共培養(yǎng)

成熟的DC細(xì)胞分組如下：

(1)miRNA-155下調(diào)的DC(miRNA-155 inhibitor轉(zhuǎn)染)；

(2)miRNA-155正常表達(dá)的DC(inhibitor negative control轉(zhuǎn)染)

將上述成熟的DC和CIK按1:8混合，置于含300U/mL IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，共培養(yǎng)4天，收集細(xì)胞。

5、體外特異性殺傷試驗(yàn)

分別使用K562/A02，THP-1及HL-60細(xì)胞作為靶細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/mL，按照效靶5:1將效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞加入96孔板中，37℃、5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)48h。通過MTT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活率。

殺傷活性(％)＝[1-(試驗(yàn)孔均值-效應(yīng)對(duì)照孔均值)/靶細(xì)胞對(duì)照孔均值]×100％。

根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞的種類分為如下組別：

(A)CIK組；

(B)miRNA-155正常表達(dá)的DC組；

(C)miRNA-155正常表達(dá)的DC-CIK組；

(D)miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC組；

(E)miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC-CIK組。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、DC、CIK細(xì)胞增殖情況和表型分析

從外周血分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，通過誘導(dǎo)刺激分別得到DC和CIK細(xì)胞。經(jīng)過傳代培養(yǎng)，使用MTT檢測(cè)試劑盒分析兩種細(xì)胞的增殖活性，從570nm的吸光值結(jié)果可以看出，初種細(xì)胞后的1-2d，DC、CIK細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，d3細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，6d以后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩。提取培養(yǎng)7d后的DC及CIK，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物，其中DC細(xì)胞表面CD80、CD83、CD86的陽性率分別為73.24％、57.48％、61.17％，說明DC細(xì)胞已經(jīng)成熟，純度較高。CIK細(xì)胞表面CD3⁺CD8⁺、CD3⁺CD56⁺雙陽性比率分別為58.28％、50.46％。

2、DC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miRNA-155表達(dá)情況

轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor的DC細(xì)胞(抑制組)中的miRNA-155表達(dá)量顯著下調(diào)，其與對(duì)照組DC(不轉(zhuǎn)染inhibitor或negative control)和陰性對(duì)照組DC(轉(zhuǎn)染inhibitor negative control)的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示。

抑制組、對(duì)照組、陰性對(duì)照組的DC細(xì)胞的活力及增殖行為基本一致，證明miRNA-155低表達(dá)后并不影響DC細(xì)胞的活力和增殖行為。

3、MTT比色法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

A～E組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)不同白血病細(xì)胞系的殺傷活性見圖2-4。結(jié)果可見，miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC-CIK細(xì)胞比miRNA-155正常表達(dá)的DC-CIK細(xì)胞具有更高的殺傷力，而miRNA-155下調(diào)表達(dá)的DC細(xì)胞與miRNA-155正常表達(dá)的DC細(xì)胞的殺傷力基本一致，無顯著性差異。這表明，miRNA-155下調(diào)并不能直接提高DC細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷力，但是miRNA-155下調(diào)的DC細(xì)胞可以通過共培養(yǎng)顯著增強(qiáng)CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

miRNA-155可以作為藥物靶標(biāo)提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

實(shí)施例2：miRNA-155抑制劑的篩選(太子參環(huán)肽B、C)

一、實(shí)驗(yàn)材料

太子參環(huán)肽B購(gòu)買自上海源葉生物科技有限公司；太子參環(huán)肽C購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。其他材料同實(shí)施例1。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、效應(yīng)細(xì)胞DC與CIK的分離培養(yǎng)

(1)單個(gè)核細(xì)胞的分離：采集健康志愿者外周血20mL，預(yù)冷的PBS 1:1稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層，650g，4℃離心20min，收集白色細(xì)胞層，分離單個(gè)核細(xì)胞，1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后置于37℃，5％CO₂孵箱中孵育2h。

(2)DC細(xì)胞的培養(yǎng)：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)2h后收集貼壁細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)誘導(dǎo)DC生成，于37℃，5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)，每2天半量換液一次，換液后補(bǔ)充GM-CSF、IL-4，于第6d在培養(yǎng)基中添加TNF-α誘導(dǎo)DC成熟(100ng/mL)，連續(xù)培養(yǎng)7d，收集細(xì)胞備用。

(3)CIK細(xì)胞的培養(yǎng)：收集單核細(xì)胞中的懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml，在完全培養(yǎng)基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3單抗(50μg/mL)。每2-3d進(jìn)行換液，并補(bǔ)充等量的細(xì)胞因子，連續(xù)培養(yǎng)7天，收集細(xì)胞備用。

2、太子參環(huán)肽B、C誘導(dǎo)DC細(xì)胞低表達(dá)miRNA-155

(1)傳細(xì)胞培養(yǎng)板：以6孔板為例，轉(zhuǎn)染前一天，按1×10⁶/ml密度接種DC細(xì)胞于6孔板，每孔加2ml培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度達(dá)60％。

(2)藥物誘導(dǎo)：吸去6孔板中的培養(yǎng)基，PBS沖洗1次后，加入含有太子參環(huán)肽B(8μg/ml)或C(5μg/ml)的完全培養(yǎng)基2ml，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

3、DC細(xì)胞中miRNA-155的表達(dá)(qRT-PCR)

3.1細(xì)胞總RNA的提取

(1)吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，吸去PBS，每孔注入RNAiso Plus 1ml，緩慢吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分裂解；

(2)將裂解液吸出轉(zhuǎn)入1.5ml EP管中，冰上靜置5_min；

(3)在EP管中加入氯仿200μl，劇烈震蕩混勻約15秒，冰上靜置3min；然后于4℃條件下12000g/min離心15分鐘；

(4)離心后吸取EP管中上層水相液體500μl轉(zhuǎn)入新的1.5ml EP管中，加入異丙醇500μl，顛倒混勻，冰上靜置10min；然后于4℃條件下12000g/min離心10分鐘；

(5)將EP管中沉淀留下，加入75％乙醇1ml震蕩混勻，重懸白色沉淀；然后于4℃條件下7500g/min離心10分鐘；

(6)吸去EP管中液體，可見管中沉淀，室溫中干燥5分鐘后用DEPC水30μl左右溶解沉淀獲得總RNA，置于4℃冰箱過夜；

(7)取2μl上述總RNA，加198μl DEPC水，配制200μl稀釋的總RNA，測(cè)定濃度和純度；置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 miRNA-155逆轉(zhuǎn)錄

(1)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

用Hairpin-it^TMmiRNAs qPCR Quantitation Kit(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)按照說明書在DEPC處理的200μl EP管中配制如下反應(yīng)體系：5×RT Buffer，4μl；dNTP(10mM)，0.75μl；miR-RT primers(1μM)，1.2μl；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μl)，0.2μl；RNA sample，1μg；加RNase Free H₂O至20μl。將該體系輕輕混勻后，瞬時(shí)離心，設(shè)置反應(yīng)條件如下：16℃，30min；42℃，30min；85℃，10min。反應(yīng)產(chǎn)物cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將cDNA稀釋3倍，然后混勻并吸取2μl作模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書配制如下反應(yīng)體系：2×RT PCR Buffer，10μl；miR specific Primer set(5μM)，0.4μl；miRNA RT Product，2μl；Taq DNA polymerase(5U/ml)，0.2μl；加ddH₂O至20μl。將該體系輕輕混勻后，瞬時(shí)離心，設(shè)置反應(yīng)條件如下：95℃，3min；95℃，12sec；62℃，40sec；40cycles。

miRNA-155以U6為內(nèi)參，miRNA-155和U6的引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

4、效應(yīng)細(xì)胞DC與CIK共培養(yǎng)

成熟的DC細(xì)胞分組如下：

(1)對(duì)照DC細(xì)胞(不加藥處理)；

(2)太子參環(huán)肽B處理的DC細(xì)胞；

(3)太子參環(huán)肽C處理的DC細(xì)胞。

將上述成熟的DC和CIK按1:8混合，置于含300U/mL IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO₂孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液，共培養(yǎng)4天，收集細(xì)胞。

5、體外特異性殺傷試驗(yàn)

分別使用K562/A02，THP-1及HL-60細(xì)胞作為靶細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁵個(gè)/mL，按照效靶5:1將效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞加入96孔板中，37℃、5％CO₂孵育箱中培養(yǎng)48h。通過MTT檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活率。

殺傷活性(％)＝[1-(試驗(yàn)孔均值-效應(yīng)對(duì)照孔均值)/靶細(xì)胞對(duì)照孔均值]×100％。

根據(jù)效應(yīng)細(xì)胞的種類分為如下組別：

(A)普通DC-CIK組；

(B)太子參環(huán)肽B處理的DC-CIK組；

(C)太子參環(huán)肽C處理的DC-CIK組。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、DC、CIK細(xì)胞增殖情況和表型分析

結(jié)果同實(shí)施例1。

不同處理的DC細(xì)胞的活力及增殖行為基本一致，證明上述劑量下的太子參環(huán)肽B或C不影響DC細(xì)胞的活力和增殖行為。

2、DC細(xì)胞處理后miRNA-155表達(dá)情況

太子參環(huán)肽B或C處理的DC細(xì)胞中的miRNA-155表達(dá)量顯著下調(diào)，分別為對(duì)照DC細(xì)胞中的miRNA-155表達(dá)量的0.38倍、0.32倍。

3、MTT比色法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

太子參環(huán)肽B處理的DC-CIK組、太子參環(huán)肽C處理的DC-CIK組的DC-CIK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷力顯著提高，以HL-60細(xì)胞系為例，分別為普通DC-CIK組DC-CIK細(xì)胞殺傷力的2.17倍和2.35倍。

上述結(jié)果表明，太子參環(huán)肽B或C可以作為miRNA-155抑制劑用于提高DC細(xì)胞共培養(yǎng)增強(qiáng)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

上述實(shí)施例僅用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何簡(jiǎn)單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于上述具體實(shí)施例。