本發(fā)明涉及醫(yī)學領(lǐng)域，具體而言，涉及一種破骨細胞培養(yǎng)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
破骨細胞(Osteoclast，OC)是骨骼的細胞成分之一，是生理狀態(tài)下唯一具有骨吸收功能的細胞，破骨細胞來源于造血干細胞的粒細胞-巨噬細胞集落形成單位，是由其分化的單核細胞融合而成。人成熟破骨細胞的直徑約為100μm，為成熟紅細胞直徑的10倍，其內(nèi)含有2-50個聚集的細胞核。功能狀態(tài)下，破骨細胞在接觸骨質(zhì)側(cè)形成大量的微絨毛結(jié)構(gòu)，稱為皺褶緣，在其周圍是僅有微絲而無其他細胞器的胞質(zhì)區(qū)，稱為亮區(qū)，皺褶緣的胞質(zhì)內(nèi)富含溶酶體與吞飲泡，亮區(qū)富集了高濃度的水解酶及有機酸，這些結(jié)構(gòu)均利于破骨細胞功能的行使。而當細胞進入靜止期，它則會失去這些結(jié)構(gòu)。
破骨細胞是機體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細胞。在骨代謝過程中，破骨細胞與成骨細胞相互協(xié)作，保障骨重建順利進行，維持骨代謝的動態(tài)平衡。破骨細胞缺失或功能異常均能導致骨代謝疾病，如骨質(zhì)硬化和骨質(zhì)疏松等；除此之外，破骨細胞還參與腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展，影響疾病的轉(zhuǎn)歸和預后。體外培養(yǎng)破骨細胞方法主要應用于如下研究領(lǐng)域：研發(fā)破骨細胞生成和功能促進劑和抑制劑，人們正在不斷努力嘗試把上述發(fā)現(xiàn)應用到代謝性和免疫性骨病的臨床治療；將破骨細胞引入骨組織工程領(lǐng)域，將其與成骨細胞共同種植于礦化支架上，改善了組織工程化骨的重建結(jié)構(gòu)；不斷發(fā)現(xiàn)新的破骨細胞生物標志物應用于臨床，用來監(jiān)測骨吸收狀態(tài)，反映機體骨代謝穩(wěn)態(tài)；應用于代謝性和免疫性骨病的發(fā)病機制研究中，極大的促進了骨骼疾病分子發(fā)病機制研究進展。綜上所述，建立體外破骨細胞培養(yǎng)方法是在細胞與分子水平研究各種因素(激素、細胞因子和環(huán)境元素等)影響骨吸收機制的基礎(chǔ)，也是研究代謝性骨病(骨硬化癥、骨質(zhì)疏松癥等)、腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病發(fā)病機制和治療藥物的有效手段。
破骨細胞主要分布于骨質(zhì)表面與骨內(nèi)血管通道周圍的小陷窩內(nèi)。破骨細胞主要的生理功能是溶解與吸收骨質(zhì)，參與骨組織的重建和維持血鈣的動態(tài)平衡。由于破骨細胞獨特的功能，對破骨細胞的研究在闡明骨代謝性疾病的病理生理機制以及為疾病診療提供新方法中具有至關(guān)重要的意義。然而，破骨細胞是高代謝終末分化細胞，具有不能傳代、存活時間短等特點，且破骨細胞在體內(nèi)數(shù)量極少，難以分離獲得。
1982年Chamber首次從乳兔四肢骨分離培養(yǎng)出成熟破骨細，為骨吸收的體外研究奠定了基礎(chǔ)。我國于世風等1988年率先引進了破骨細胞的培養(yǎng)方法并加以改良。然而經(jīng)典分離培養(yǎng)方法獲得的破骨細胞數(shù)量有限，純化困難。由于體外分離培養(yǎng)的破骨細胞無增殖能力，存活時間只有7～14天，因此經(jīng)典分離培養(yǎng)的破骨細胞只適合于一些生物學功能和藥效學研究，無法滿足破骨細胞分子生物學方面的研究需要。如何獲得高量、高純度的破骨細胞對研究破骨細胞的生物學具有重要意義。近20年以來，不少的學者曾經(jīng)嘗試從不同種屬的動物(如鳥類、嚙齒類動物)分離培養(yǎng)成熟的破骨細胞，企圖解決上述問題，然而由于骨組織里存在的正常成熟破骨細胞數(shù)量有限，因此高產(chǎn)量高純度破骨細胞的獲得一直是破骨細胞體外骨吸收研究的一個難題，由此，如何選擇一種簡便高效的破骨細胞體外培養(yǎng)方法，成為了當前限制對其研究的最大問題。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種破骨細胞培養(yǎng)試劑盒，該試劑盒所含試劑豐富齊全，通過消化和誘導操作可以實現(xiàn)破骨細胞在體外的快速培養(yǎng)制備。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述試劑盒的制備方法，以實現(xiàn)該試劑盒的應用。
本發(fā)明的第三目的在于提供使用該試劑盒培養(yǎng)破骨細胞的方法，該方法操作簡便，易于控制，配合試劑盒即可實現(xiàn)破骨細胞體外培養(yǎng)的效果。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
本發(fā)明提供了一種破骨細胞培養(yǎng)試劑盒，包括：所述試劑盒中含有平衡鹽溶液、1,25(OH)2D3、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液、鏈蛋白酶E、PBS沖洗液。
本發(fā)明提供的這種試劑盒，其含有破骨細胞的分離培養(yǎng)、純化試劑，同時也含有將純化后的細胞進行誘導分化的試劑，通過優(yōu)選的試劑組合，保證細胞在不同的階段能夠快速的增殖。其中，平衡鹽溶液提供破骨細胞分離時的外環(huán)境，α-MEM培養(yǎng)基提供細胞增殖過程中的營養(yǎng)需求(具體操作時加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素)；Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液、鏈蛋白酶E和PBS沖洗液則用于細胞的分離、消化以及洗滌。本發(fā)明提供的試劑盒其針對破骨細胞不同的培養(yǎng)階段，特定選擇了不同的處理試劑，將細胞的純化、分離、消化以及誘導等特定地進行了結(jié)合，而且不同所用的試劑也是特定選擇的，其為體外快速獲得破骨細胞提供了便利。
可選的，所述平衡鹽溶液為D-Hanks液。
D-Hanks液可優(yōu)選作為細胞培養(yǎng)取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗試劑，而且還可以很好的保持細胞的活性。
可選的，所述試劑盒中還包括牙片、玻片；且所述平衡鹽溶液中含有青霉素和鏈霉素，青霉素和鏈霉素的濃度為100-1200微克/毫升。
可選的，所述牙片和所述玻片的尺寸均為1-2cm2。
為了使得后續(xù)細胞在誘導的過程中順利地附著增殖，并且利于培養(yǎng)，所述試劑盒中還優(yōu)選含有牙片和玻片，而且牙片和所述玻片的優(yōu)選尺寸均為1-2cm2。
對于玻片而言，其尺寸設(shè)定合適之后，優(yōu)選泡酸過夜，再分別用自來水和蒸餾水清洗后烘干、滅菌備用。
可選的，所述試劑盒包括盒體以及用于固定裝有試劑的試劑瓶的支撐物，所述支撐物設(shè)置于所述盒體內(nèi)。
對于試劑盒而言，難免需要經(jīng)過產(chǎn)時間運輸和保存等，劇烈的碰撞和拿放對試劑盒所含的試劑不可避免會造成影響，因此本申請中，試劑盒包括盒體以及用于固定裝有試劑的試劑瓶的支撐物，所述支撐物設(shè)置于所述盒體內(nèi)。對于支撐物的結(jié)構(gòu)并不做具體的限定，其只要滿足填充試劑之間的間隙即可，例如可以是設(shè)置了很多放置槽的泡沫墊。
可選的，所述試劑盒還含有TRAP染色試劑。
為了便于觀察使用該試劑盒制備的破骨細胞的生長情況，本試劑盒中還優(yōu)選含有TRAP染色試劑。
一種所述的破骨細胞培養(yǎng)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
將各試劑或者載片分別封裝于單獨的封裝裝置內(nèi)，再將封裝裝置內(nèi)設(shè)置于支撐物后裝于盒體中。
可選的，所述方法還包括制備牙片和玻片步驟，具體包括：
將新鮮動物牙縱切成110-120μm，用金剛砂石磨薄至12-15μm，超聲波清洗后浸泡于含青霉素1200-1400μg/ml、鏈霉素700-900μg/ml的D-Hanks液中，換液2-4次后置入含青霉素80-90μg/ml、鏈霉素70-80μg/ml的D-Hanks液置換2-4次，再置于含有胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中浸泡后，得到牙片；
將1-2cm2的玻片于酸中浸泡10-12小時后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水洗4-6遍，干熱消毒滅菌后得到玻片。
一種根據(jù)所述的破骨細胞培養(yǎng)試劑盒培養(yǎng)破骨細胞的方法，包括以下步驟：
1)、取新生兔的四肢長骨后于平衡鹽溶液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
2)、將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清、青霉素和鏈霉素，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于800-900轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6-8分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
該步驟2)中，得到的骨干在α-MEM培養(yǎng)基中剖開的過程中，為了保證所得細胞懸液的活性，優(yōu)選的，α-MEM培養(yǎng)基中含有15％的胎牛血清，鏈霉素和青霉素的濃度分別為80-90微克/微升和110-120微克/微升。
所取得懸液在4℃、1200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心8分鐘，去除上清后所得沉淀加入濃度分別為80-90微克/微升和110-120微克/微升的α-MEM培養(yǎng)基吹打均勻，接種至培養(yǎng)皿后于36-38℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)16-18小時。
將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于800-900轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6-8分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸。
3)、將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E處理后，利用胰蛋白酶和EDTA消化之后，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液，再利用胰蛋白酶和EDTA進行消化處理，得到待誘導細胞；
該步驟為細胞誘導前的準備過程，分離利用鏈蛋白酶E、利用胰蛋白酶和EDTA處理重懸液之后，可以提高細胞的純度(提高到90％以上)，便于后續(xù)誘導過程的順利進行。
另外，本發(fā)明創(chuàng)造性地采用了將經(jīng)過鏈蛋白酶E處理后的懸液使用胰蛋白酶和EDTA消化(0.5％蛋白酶和0.02％EDTA)，該消化操作可以將貼壁能力較強的細胞消化下來，進而提高了待誘導細胞的量。
4)、將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
可選的，在步驟4)中，具體包括：
將步驟3)中所得的待誘導細胞收集于離心管內(nèi)，在3-5℃，1200-1400r/min下離心8-9min，棄上清，加α-MEM培養(yǎng)基稀釋接種于細胞培養(yǎng)板中，并向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入1,25(OH)2D3，置35-38℃，3-6％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1次；
其中，細胞培養(yǎng)板內(nèi)分別置玻片和牙片。
優(yōu)選的，在接種細胞的過程中，細胞的接種密度控制在2.5-3×106個/cm2。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
(1)、提供了一種體外培養(yǎng)破骨細胞的試劑盒，該試劑盒所含試劑種類豐富，可以滿足細胞分離、純化、消化以及誘導等步驟的需求，而且實際選擇合理得當，破骨細胞在體外的快速制備提供了便利，進而為可為破骨細胞的體外研究提供豐富的細胞來源。
(2)、該體外破骨細胞的制備方法簡單，產(chǎn)生的破骨樣細胞量很多，經(jīng)試驗統(tǒng)計，在1×l cm2的玻片上誘導產(chǎn)生的破骨細胞產(chǎn)量約為正常分離的成熟破骨細胞的50倍以上。
(3)、在誘導前利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化可使破骨細胞純度達95％以上，因此適合于破骨細胞生化學方面的研究，尤其適合于凝膠遷移等分子生物學研究，可提供足夠的核提取物來研究破骨細胞分化過程中一些轉(zhuǎn)錄因子的變化。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
本發(fā)明提供了一種用于體外培養(yǎng)破骨細胞的試劑盒、試劑盒的制備方法以及利用該試劑盒體外培養(yǎng)破骨細胞的方法，所述試劑盒中含有平衡鹽溶液、1,25(OH)2D3、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液、鏈蛋白酶E、PBS沖洗液。另外，優(yōu)選的，為了更好的實現(xiàn)制備效果，在上述方案的基礎(chǔ)之上，本申請的試劑盒可以包含以下限定中的一種或幾種；優(yōu)選的，所述平衡鹽溶液為D-Hanks；或所述試劑盒中還包括牙片、玻片；且所述平衡鹽溶液中含有青霉素和鏈霉素，青霉素和鏈霉素的濃度為100-1200微克/毫升；或所述牙片和所述玻片的尺寸均為1-2cm2，或所述試劑盒包括盒體以及用于固定裝有試劑的試劑瓶的支撐物，所述支撐物設(shè)置于所述盒體內(nèi)。另外，該試劑盒還可以含有TRAP染色試劑，以方便后續(xù)破骨細胞培養(yǎng)監(jiān)控。
本發(fā)明所述的破骨細胞培養(yǎng)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
將各試劑或者載片分別封裝于單獨的封裝裝置內(nèi)，再將封裝裝置內(nèi)設(shè)置于支撐物后裝于盒體中；另外，該制備方法還可包括牙片和玻片的制備步驟，具體的，該制備步驟包括：將新鮮人牙縱切成110-120μm，用金剛砂石磨薄至12-15μm，超聲波清洗后浸泡于含青霉素1200-1400μg/ml、鏈霉素700-900μg/ml的D-Hanks液中，換液2-4次后置入含青霉素80-90μg/ml、鏈霉素70-80μg/ml的D-Hanks液置換2-4次，再置于α-MEM培養(yǎng)液中浸泡后，得到牙片；將1-2cm2的玻片于酸中浸泡10-12小時后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水洗4-6遍，干熱消毒滅菌后得到玻片。
接下來，本發(fā)明基于試劑盒對破骨細胞體外培養(yǎng)方法給出以下具體實施例。
實施例1
本實施例提供的試劑盒包括：α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、D-Hanks液、胰蛋白酶、EDTA、Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液、鏈蛋白酶E、PBS沖洗液。基于該試劑盒的破骨細胞培養(yǎng)方法包括如下步驟：
S11：取新生兔的四肢長骨后于平衡鹽溶液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
S12：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為15％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為100微克/毫升和300微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液(孵育液覆蓋于分離液表面)后于800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心8分鐘，所得含有目的細胞(包括破骨細胞的前體細胞，以下實施例同)的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S13：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E在適當溫度下處理15分鐘后，利用胰蛋白酶和EDTA消化之后，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液，再利用胰蛋白酶和EDTA進行消化處理，得到待誘導細胞；
S14：將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
實施例2
本實施例的試劑盒與實施例1致，在此不做贅述，僅僅對體外制備破骨細胞的方做進一步的說明。
S21：取新生兔的四肢長骨后于平衡鹽溶液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
在該步驟中，出生24h內(nèi)的新生兔斷頸處死，無菌取其四肢長骨，在D-Hanks液中去凈附著在其表面的軟組織和軟骨骺，得到骨干。
S22：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為14％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為300微克/毫升和200微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，1000r/min離心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心8分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S23：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E在適當溫度下處理20分鐘后，利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化之后，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液，再利用4％胰蛋白酶和0.04％EDTA進行消化處理，得到待誘導細胞；
S24：將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導(最終加入濃度為10-8M)，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
實施例3
本實施例的試劑盒與實施例1一致，在此不做贅述，僅僅對體外制備破骨細胞的方做進一步的說明。
S31：出生24h內(nèi)的新生兔斷頸處死，取其四肢長骨后在D-Hanks液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
S32：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為13％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為400微克/毫升和300微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，800r/min離心12min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育(37℃孵育18h)，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于900轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心7分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S33：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E在適當溫度下處理30分鐘后，利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化之后，使用D-Hanks液沖洗后，再使用PBS沖洗液沖洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA進行消化處理，得到待誘導細胞；
S34：將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導(最終加入濃度為10-8M)，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
實施例4
本實施例的試劑盒與實施例1一致，在此不做贅述，僅僅對體外制備破骨細胞的方做進一步的說明。
S41：出生24h內(nèi)的新生兔斷頸處死，取其四肢長骨后在D-Hanks液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
S42：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為16％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為800微克/毫升和200微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，1000r/min離心8min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育(37℃孵育22h)，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于900轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心8分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S43：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E在適當溫度下處理25分鐘后，利用5％蛋白酶和0.02％EDTA消化10分鐘后利用D-Hanks液沖洗后，再使用PBS沖洗液沖洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分鐘，得到待誘導細胞；
S44：將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導(最終加入濃度為10-8M)，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
實施例5
本實施例的試劑盒與實施例1一致，在此不做贅述，僅僅對體外制備破骨細胞的方做進一步的說明。
S51：出生24h內(nèi)的新生兔斷頸處死，取其四肢長骨后在D-Hanks液中去除軟組織和軟骨骺，得到骨干；
S52：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為15％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為500微克/毫升和700微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，1000r/min離心8min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育(37℃孵育20h)，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S53：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E在適當溫度下處理20分鐘后，利用5％蛋白酶和0.02％EDTA消化5分鐘后利用D-Hanks液沖洗后，再使用PBS沖洗液沖洗，再利用5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分鐘，得到待誘導細胞；
S54：將所述待誘導細胞利用1,25(OH)2D3誘導(最終濃度為10-8M)，得到體外培養(yǎng)的破骨細胞。
實施例6
本實施例提供的試劑盒，與實施例1相比，其還含有牙片、玻片、TRAP染色試劑、盒體以及用于固定裝有試劑的試劑瓶的支撐物，所述支撐物設(shè)置于所述盒體內(nèi)。具體的破骨細胞培養(yǎng)方法如下：
S61：與實施例5一致，在此不做贅述；
S62：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為15％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為1000微克/毫升和800微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，1000r/min離心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育(37℃孵育20h)，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于600轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心12分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S63：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E處理20分鐘后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分鐘，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液沖洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA進行消化10分鐘，得到待誘導細胞；
S64：將所得的待誘導細胞收集于離心管內(nèi)，在3℃，1200r/min下離心8min，棄上清，加α-MEM培養(yǎng)基稀釋后接種于細胞培養(yǎng)板中(細胞培養(yǎng)板事先分別置1cm2的玻片和牙片)，并向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入1,25(OH)2D3(最終濃度為10-8M)，置35℃，3％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1次。
本實施例中，牙片和玻片的制備方法如下：將新鮮人牙縱切成110μm，用金剛砂石磨薄至12μm，超聲波清洗后浸泡于含青霉素1200μg/ml、鏈霉素700μg/ml的D-Hanks液中，換液2次后置入含青霉素80μg/ml、鏈霉素70μg/ml的D-Hanks液置換2次，再置于α-MEM培養(yǎng)液中浸泡后，得到牙片；
將1cm2的玻片于酸中浸泡10小時后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水洗4-6遍，干熱消毒滅菌后得到玻片。
實施例7
本實施例中的試劑盒與實施例6一致，在此不做贅述，僅對制備方法進行進一步的說明。
S71：與實施例6的步驟S61一致；
S72：將所述骨干置于α-MEM培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中加入胎牛血清(體積占比為15％)、青霉素和鏈霉素(加入后的濃度分別為1200微克/毫升和1000微克/毫升)，將所述骨干縱行剖開，輕刮骨的髓腔表面直至顏色變白，用吸管反復多次吹洗骨髓腔和骨干的內(nèi)表面，取出骨片，吸取懸液置離心管內(nèi)，離心(4℃，1000r/min離心10min)后取沉淀物并加入α-MEM培養(yǎng)液吹打均勻，接種并孵育(37℃孵育25h)，將得到的孵育液用D-Hanks液沖洗后，加入至Ficoll-Paque PREMRUM細胞分離液后于800轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘，所得含有目的細胞的懸液層利用α-MEM培養(yǎng)重懸；
S73：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E處理20分鐘后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化5分鐘，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液沖洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA進行消化15分鐘，得到待誘導細胞；
S74：將所得的待誘導細胞收集于離心管內(nèi)，在5℃，1400r/min下離心8min，棄上清，加α-MEM培養(yǎng)基稀釋接種于細胞培養(yǎng)板中，并向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入1,25(OH)2D3(最終濃度為10-8M)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1次；
與實施例的牙片和玻片的制備方法如下：
將新鮮人牙縱切成120μm，用金剛砂石磨薄至15μm，超聲波清洗后浸泡于含青霉素1400μg/ml、鏈霉素900μg/ml的D-Hanks液中，換液3次后置入含青霉素90μg/ml、鏈霉素80μg/ml的D-Hanks液置換3次，再置于α-MEM培養(yǎng)液中浸泡后，得到牙片；
將1cm2的玻片于酸中浸泡12小時后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水洗4-6遍，干熱消毒滅菌后得到玻片。
實施例8
本實施例中的試劑盒與實施例6一致，在此不做贅述，僅對制備方法進行進一步的說明。
S81：與實施例6的步驟S61一致；
S82：與實施例7的步驟S72一致；
S83：將重懸后的細胞用鏈蛋白酶E處理15分鐘后，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分鐘，使用D-Hanks液沖洗后，使用PBS沖洗液沖洗，再利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化10分鐘，得到待誘導細胞；
S84：將所得的待誘導細胞收集于離心管內(nèi)，在5℃，1200r/min下離心10min，棄上清，加α-MEM培養(yǎng)基稀釋接種(接種密度為2.5-3×106個/cm2)于細胞培養(yǎng)板中(培養(yǎng)板內(nèi)事先放入1cm2的玻片和牙片)，并向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入1,25(OH)2D3(最終濃度為10-8M)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1次；
本實施例中玻片和牙片的制備方法如下：
將新鮮人牙縱切成115μm，用金剛砂石磨薄至13μm，超聲波清洗后浸泡于含青霉素1300μg/ml、鏈霉素800μg/ml的D-Hanks液中，換液3次后置入含青霉素85μg/ml、鏈霉素75μg/ml的D-Hanks液置換3次，再置于α-MEM培養(yǎng)液中浸泡后，得到牙片；
將2cm2的玻片于酸中浸泡12小時后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水洗4-6遍，干熱消毒滅菌后得到玻片。
試驗例
按照上述實施例所列舉的方法進行體外破骨細胞的培養(yǎng)，其中，實施例1-實施例5中加入實施例6所示玻片和牙片，所有實施例在誘導培養(yǎng)10天之后，取出玻片，利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，觀測破骨細胞培養(yǎng)結(jié)果以及骨吸收陷窩分析，結(jié)果如下表1所示：
表1試驗例試驗結(jié)果
綜上所述，該方法是建立在組織中不同細胞貼壁能力不同而使細胞加以純化。在該試劑盒中，其針對破骨細胞不同的培養(yǎng)階段，特定選擇了不同的處理試劑，將細胞的純化、分離、消化以及誘導等特定地進行了結(jié)合，而且所用的試劑也是特定選擇的，其為體外快速獲得破骨細胞提供了便利。另外，利用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA聯(lián)合消化的方法以及將成熟細胞分離與誘導破骨細胞相結(jié)合的方法可獲得高產(chǎn)量和高純度的破骨樣細胞，可為破骨細胞的體外研究提供豐富的細胞來源。
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。