本發(fā)明屬于干細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種人胎盤運輸提取液及其替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：牛血清(胎牛血清和小牛血清)是培養(yǎng)細(xì)胞最重要的添加物，在各類細(xì)胞培養(yǎng)及生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位。然而，使用牛血清培養(yǎng)人細(xì)胞，特別是用于臨床治療的細(xì)胞，具有非常明顯的缺點，包括：牛血清中可能含有瘋牛病病毒、朊病毒等污染源，牛血清培養(yǎng)的人細(xì)胞會產(chǎn)生顯著的免疫排斥反應(yīng)，殘留的牛血清白蛋白導(dǎo)致人體產(chǎn)生抗體及炎癥等。有研究顯示，牛血清培養(yǎng)的人細(xì)胞能吞噬牛血清蛋白成分，即使在多次且較長時間洗滌下仍然有較多的殘留，足以誘導(dǎo)人產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此，很多國家限制使用牛血清培養(yǎng)人細(xì)胞用于治療。尋找合適的替代牛血清的添加物是進(jìn)行細(xì)胞治療的必要步驟，這些替代物包括添加生長因子的無血清培養(yǎng)基、人血小板裂解液、人自體及異體血清。其中，無血清培養(yǎng)基成分確定，但是價格昂貴，并非適合所有細(xì)胞類型。血小板裂解液具有類似人血清的功能，但是血小板數(shù)量少，來源匱乏，需要反復(fù)凍融處理釋放內(nèi)容物；而人自體血清相對于其他添加物具有明顯的優(yōu)勢，如人自體血清培養(yǎng)自身細(xì)胞不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，富含細(xì)胞生長所需的各種生長因子，有效的促進(jìn)細(xì)胞生長和維持特性。到目前為止，采用自體血清培養(yǎng)成功的細(xì)胞類型，包括人樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)，雪旺細(xì)胞，上皮/內(nèi)皮細(xì)胞，造血干祖細(xì)胞，類肝細(xì)胞，人骨髓、臍血、脂肪、軟骨等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞培養(yǎng)過程中一般均采用牛血清為對照，對人自體/異體血清的培養(yǎng)性能進(jìn)行了比較，包括生長速率、傳代數(shù)、表面標(biāo)記、分化潛能等。在基礎(chǔ)研究方面，也對細(xì)胞的信號通路、表達(dá)譜、分子機(jī)制進(jìn)行探索；整體的培養(yǎng)方面，有些研究認(rèn)為自體血清優(yōu)于小牛血清(FCS)，有些研究認(rèn)為自體血清與FCS效果相當(dāng)，有些研究表明FCS要好于自體血清。長期培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，采用人血清能加速擴(kuò)增，延長壽命和克隆形成能力，表明應(yīng)用性良好。將人的脂肪干細(xì)胞凍存4年后，采用5％人血清培養(yǎng)，從p2到p8代，細(xì)胞增殖速率加快，其中p5代細(xì)胞具有最佳的表面標(biāo)記分布。在生長速率的比較上，樹突狀細(xì)胞用自體血清培養(yǎng)誘導(dǎo)僅為同濃度的胎牛血清(FBS)的得率的一半。人雪旺細(xì)胞用自體血清培養(yǎng)后，倍增時間為10.33天，比使用FBS的縮短1.4天。人內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)上，兩者在生長及形態(tài)等各方面沒有差別。StuteN等培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，采用低密度接種，3天內(nèi)發(fā)現(xiàn)10％自體血清生長最好，優(yōu)于10％FCS，且效果約等于3％人自體血清，到對數(shù)期時，仍然是自體血清快于FCS。同樣的，在培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞時，比較研究顯示，第二代擴(kuò)增速率產(chǎn)生顯著差異，10％自體血清大于10％FBS，10％FBS約等于5％自體血清。培養(yǎng)人脂肪來源的干細(xì)胞，同時比較了FBS、人胎盤血清、自體血清和異體血清，在擴(kuò)增效率方面，自體血清與人胎盤血清類似，優(yōu)于異體血清，遠(yuǎn)好于FBS(見：StuteN，etal.ExpHematol.2004.32(12)：1212-1225)。經(jīng)過血清培養(yǎng)后，干細(xì)胞的分化能力也進(jìn)行了對比，不同的細(xì)胞對人血清的反應(yīng)能力不同，分化方向也發(fā)生一些變化。用人血清培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，對數(shù)期的表面標(biāo)記沒有差別，但是成骨分化能力上，人血清的比牛血清的好，在脂肪分化方面，則是FBS的更好；OreffoRO等的結(jié)果則是人血清促進(jìn)了成骨和脂肪的分化能力(見：OreffoRO，etal.EurJCellBio1.1997.74：251-261)，有的研究通過成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)計數(shù)和堿性磷酸酶(ALP)陽性克隆計數(shù)表明具有相似的成骨分化能力(見：WolfF，etal.EurCellMater.2008.15：1-10.)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞在第四代是分化能力產(chǎn)生顯著差異，10％FBS的優(yōu)于10％自體血清的，在體內(nèi)兩者則相差不大。另外的研究則顯示培養(yǎng)到p6代，脂肪干細(xì)胞能有效的分化成脂肪和軟骨細(xì)胞，但是成骨細(xì)胞形成能力減弱。分離的軟骨細(xì)胞經(jīng)過人自體血清培養(yǎng)后，仍然具備分化成軟骨的能力，可以體外形成軟骨塊進(jìn)行移植。通過上述的多個研究組的多例比較實驗，人自體血清具有FBS類似的培養(yǎng)細(xì)胞的功能。在來源方面，MizunoN等簡化了自體血清采集方法，他們用完全密封的無菌裝置收集血清，并完成離心和分裝，收集到的血清無需過濾除菌就可直接使用，并被成功用于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)(見：MizunoN.etal.CellBiolInt.2006，30(6)：521-524.)。顯然這種渠道獲得范圍很窄。人胎盤，又稱紫河車，是常用的一種中藥，中醫(yī)認(rèn)為胎盤是一種氣血雙補(bǔ)的良藥。現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)證明，胎盤中含有多種免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物質(zhì)及氨基酸、礦物質(zhì)等成分。迄今為止，已有多種細(xì)胞生長因子從胎盤組織中分離出來，包括血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、轉(zhuǎn)化生長因子、促細(xì)胞生長因子等。研究表明：胎盤提取液中含有多種細(xì)胞因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長；胎盤提取液可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、臍帶血造血干細(xì)胞、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長；人胎盤組織液可以通過提高抗氧化能力和減少細(xì)胞凋亡來延緩大鼠衰老。目前，儲存胎盤干細(xì)胞時，同時提供了整個胎盤，胎盤包含胎盤血，是一個穩(wěn)定的自體血清來源方式；此外，提取胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞只使用一小部分胎盤組織，剩余的胎盤組織往往被浪費掉，凍存的組織使用率微乎其微。因胎盤中含有多種細(xì)胞因子，可以從剩余的胎盤組織中制備胎盤提取物，添加到培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和延緩細(xì)胞的衰老。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是提供一種人胎盤運輸提取液，通過將含胎盤血的合格人胎盤置于胎盤運輸緩沖液中，靜置、過濾得到一替代胎牛血清的人胎盤運輸提取液，同時在培養(yǎng)基中加入人胎盤提取物，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常使用胎牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加物，而帶來的引入污染源和免疫排斥反應(yīng)等問題。本發(fā)明的第二目的是提供一種利用人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基，通過將含胎盤血的合格人胎盤置于胎盤運輸緩沖液中，靜置、過濾得到一替代胎牛血清的人胎盤運輸提取液，同時在培養(yǎng)基中加入人胎盤提取物，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常使用胎牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加物，而帶來的引入污染源和免疫排斥反應(yīng)等問題。本發(fā)明的第三目的是提供一種上述培養(yǎng)基在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，通過將含胎盤血的合格人胎盤置于胎盤運輸緩沖液中，靜置、過濾得到一替代胎牛血清的人胎盤運輸提取液，同時在培養(yǎng)基中加入人胎盤提取物，以解決現(xiàn)有技術(shù)中常使用胎牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加物，而帶來的引入污染源和免疫排斥反應(yīng)等問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種人胎盤運輸提取液，所述的人胎盤運輸提取液的制備包括以下步驟：無菌環(huán)境下，取合格的胎盤置于胎盤運輸緩沖液中，4℃靜置2～4h，收集上清液，離心，再經(jīng)不同孔徑的濾膜過濾，得到所述的人胎盤運輸提取液。優(yōu)選為，所述的胎盤運輸緩沖液為6-10g/LNaCl，0.3-0.6g/LKCl，0.1-0.2g/LCaCl2，0.05-0.2g/LMgSO4，0.1-0.3g/LNa2HPO4·12HO2，0.04-0.1g/LKH2PO4，0.5-2g/L葡萄糖。優(yōu)選為，所述的過濾步驟為依次經(jīng)孔徑為3um、1.6um、1.2um、0.8um、0.65um、0.45um和0.22um的濾膜過濾，其中孔徑3um的濾膜為不銹鋼篩網(wǎng)，孔徑1.6um的濾膜為玻璃纖維素膜，孔徑1.2um、0.8um、0.65um和0.45um的濾膜醋酸纖維素膜，孔徑0.22um的濾膜為一次性500ml過濾系統(tǒng)。本發(fā)明還公開了一種利用上述的人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中含有所述的人胎盤運輸提取液。優(yōu)選為，所述的人胎盤運輸提取液的體積分?jǐn)?shù)為5～40％，更為優(yōu)選為5％、10％、20％、40％，最為優(yōu)選為20％。優(yōu)選為，所述的培養(yǎng)基中還含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％-2％的人胎盤提取物。優(yōu)選為，所述的人胎盤提取物的制備包括以下步驟：無菌環(huán)境下，取人胎盤組織經(jīng)清洗、除血水、勻漿破碎、消化、離心和過濾，得到所述的人胎盤提取物。優(yōu)選為，所述的培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。本發(fā)明還公開一種利用上述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。優(yōu)選為，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：第一：本發(fā)明的一種人胎盤運輸提取液，將含胎盤血的合格人胎盤置于胎盤運輸緩沖液中，靜置、過濾得到一替代胎牛血清的人胎盤運輸提取液，避免胎牛血清作為培養(yǎng)基添加物時，帶來的引入污染源和免疫排斥反應(yīng)等問題；同時在培養(yǎng)基中還加入人胎盤提取物，提高了細(xì)胞增殖速率。第二：本發(fā)明的一種人胎盤運輸提取液，可連續(xù)培養(yǎng)胎盤來源的多種自體間充質(zhì)干細(xì)胞，建立自體間充質(zhì)干細(xì)胞庫，并可用于后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)制備，具有制備工藝簡單、提取量大和成本低的優(yōu)點；第三：本發(fā)明的一種人胎盤運輸提取液，培養(yǎng)出來的大量間充質(zhì)干細(xì)胞，可長期凍存，用于治療自身免疫或炎癥相關(guān)疾病。當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點。附圖說明圖1為本實施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培養(yǎng)13天的示意圖；圖2為本實施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP0培養(yǎng)13天的示意圖；圖3為本實施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培養(yǎng)6天的示意圖；圖4為本實施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP1培養(yǎng)6天的示意圖；圖5為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培養(yǎng)3天的示意圖；圖6為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP0培養(yǎng)3天的示意圖；圖7為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培養(yǎng)2天的示意圖；圖8為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP1培養(yǎng)2天的示意圖；圖9為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含10％胎牛血清的α-MEMP2培養(yǎng)1天的示意圖；圖10為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP2培養(yǎng)1天的示意圖；圖11為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含10％胎牛血清的α-MEMP3培養(yǎng)4天的示意圖；圖12為本實施例2的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP3培養(yǎng)4天的示意圖；圖13為本實施例3的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎牛血清的α-MEMP0培養(yǎng)5天的示意圖；圖14為本實施例3的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP0培養(yǎng)5天的示意圖；圖15為本實施例3的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在含10％胎牛血清的α-MEMP1培養(yǎng)2天的示意圖；圖16為本實施例3的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在含20％胎盤運輸提取液的α-MEMP1培養(yǎng)2天的示意圖.具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在實際應(yīng)用中本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下未注明具體技術(shù)和條件處，均按照本領(lǐng)域科技文獻(xiàn)所描述的技術(shù)、條件或者產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所使用的試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本發(fā)明的人胎盤運輸、人胎盤運輸提取液及其培養(yǎng)基和利用胎盤運輸提取液培養(yǎng)自體胎盤附屬物間充質(zhì)干細(xì)胞均在嚴(yán)格的無菌環(huán)境下進(jìn)行。人胎盤運輸：對胎盤提供者進(jìn)行血型檢測、HLA分型檢測、微生物學(xué)檢測和病毒學(xué)檢測，合格者的胎盤浸泡至胎盤運輸緩沖液中，4℃冷鏈車、24小時內(nèi)運輸至指定地點。本發(fā)明的一種人胎盤運輸提取液，所述的人胎盤運輸提取液的制備包括以下步驟：1、收到上述胎盤的胎盤運輸緩沖液，4℃靜置2～4h，然后收集胎盤運輸提取液的上清液，經(jīng)5000rpm離心20分鐘，收集上清；2、上清依次經(jīng)孔徑為3um、1.6um、1.2um、0.8um、0.65um、0.45um和0.22um的濾膜過濾，得到胎盤運輸提取液，再用BCA試劑盒檢測胎盤運輸提取液中的總蛋白含量，如表1所示。表1胎盤運輸提取液總蛋白含量檢測樣本總蛋白含量/(mg/ml)FBS21.53胎盤運輸提取液11.39本發(fā)明還公開了一種利用上述的人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基中含有所述的人胎盤運輸提取液和人胎盤提取物；所述的人胎盤運輸提取液的體積分?jǐn)?shù)為5～40％；所述的培養(yǎng)基中還含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％-2％的人胎盤提取物。本發(fā)明的人胎盤提取物的制備，包括以下步驟：取胎盤組織100g，用大量PBS清洗，盡量去除血水，然后把組織剪碎，再重懸在2-3倍體積的PBS中，勻漿破碎(10000rpm，1min/次，共5次)，添加膠原酶IV0.3g，37℃恒溫?fù)u床消化5h(消化2.5h后再添加0.3g消化酶)，然后低溫高速離心(4℃，12000rpm，20min)，收集上清，上清經(jīng)0.22um濾膜過濾，保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明還公開一種利用上述的培養(yǎng)基在培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，所述的三種自體干細(xì)胞，原代開始，連續(xù)培養(yǎng)至少3代，培養(yǎng)P2或P3后，可以在液氮中長期凍存；原代培養(yǎng)的胎盤和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，第2天換液，然后每2天換液，原代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞每3天換液，即消化法得到的細(xì)胞，一般是鋪板24小時后首次換液，此后的換液恢復(fù)常規(guī)時間間隔，植塊法從鋪板后，換液時間間隔固定。實施例1：一種利用上述的人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用植塊法，把臍帶剪成合適的小塊，鋪到平皿上，添加適量血清孵育1小時，然后添加適量的含本發(fā)明人胎盤運輸提取液和人胎盤提取物的完全培養(yǎng)基，放置到溫度為37℃、二氧化碳濃度為5％、濕度為95％的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后再做兩組對比實驗，每組3個重復(fù)，一組為含20％胎牛血清的α-MEM，一組為含20％胎盤運輸提取液的α-MEM；且該兩組均加入胎盤提取物。3天后添加2ml培養(yǎng)基，5天后觀察細(xì)胞爬出情況，拍照記錄，如圖1～2所示，統(tǒng)計爬出細(xì)胞的組織塊數(shù)。每2天觀察細(xì)胞爬出情況，并統(tǒng)計。待細(xì)胞長至合適的數(shù)量，傳代培養(yǎng)，即得P1細(xì)胞，培養(yǎng)6天，拍照記錄如圖3～4所示。胎牛血清培養(yǎng)的組血清濃度更換為10％，每3天換液，胎盤運輸提取液培養(yǎng)的組胎盤運輸提取液濃度依然為20％，每2天換液。待細(xì)胞長至融合度85％傳代，計數(shù)，即得P2細(xì)胞。培養(yǎng)方法同P2細(xì)胞。以后每代細(xì)胞培養(yǎng)方法都同P1代細(xì)胞。每2天拍照觀察細(xì)胞狀態(tài)。實施例2：一種利用上述的人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基培養(yǎng)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞把10克羊膜剪成約0.1立方厘米大小的塊，添加1mg/mlDispaseII和1mg/ml膠原酶IV，37℃，160rpm振蕩消化1小時，200目篩網(wǎng)過濾收集細(xì)胞，收獲的細(xì)胞用適量α-MEM培養(yǎng)基重懸，鋪板，做兩組對比實驗，每組3個重復(fù)，變量為含20％胎牛血清的α-MEM和20％胎盤運輸提取液的α-MEM；且該兩組均加入胎盤提取物。第二天換液，去掉漂浮的未貼壁成分。更換培養(yǎng)基方法：胎牛血清培養(yǎng)的每3天更換新鮮培養(yǎng)基，胎盤運輸提取液培養(yǎng)的每2天更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞長至融合度85％，傳代，計數(shù)，即得P1細(xì)胞。胎牛血清培養(yǎng)的組血清濃度更換為10％，每3天換液，胎盤運輸提取液培養(yǎng)的組胎盤運輸提取液濃度依然為20％，每2天換液。P2、P3......培養(yǎng)方法同P1，拍照記錄如圖5～12所示。每2天拍照觀察細(xì)胞狀態(tài)。實施例3：一種利用上述的人胎盤運輸提取液替代胎牛血清制得的培養(yǎng)基培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞剪取胎兒面的胎盤組織10克，酶消化法從胎盤組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。收獲的細(xì)胞用適量α-MEM培養(yǎng)基重懸，做兩組對比實驗，每組3個重復(fù)，一組為含20％胎牛血清的α-MEM，一組為含20％胎盤運輸提取液的α-MEM；且該兩組均加入胎盤提取物。第二天換液，去掉漂浮的未貼壁成分。更換培養(yǎng)基方法：胎牛血清培養(yǎng)的每3天更換新鮮培養(yǎng)基，胎盤運輸提取液培養(yǎng)的每2天更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞長至融合度85％，傳代，計數(shù)，即得P1細(xì)胞。胎牛血清培養(yǎng)的組血清濃度更換為10％，每3天換液，胎盤運輸提取液培養(yǎng)的組胎盤運輸提取液濃度依然為20％，每2天換液。P2、P3......培養(yǎng)方法同P1，拍照記錄如圖13～16所示。每2天拍照觀察細(xì)胞狀態(tài)。以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。當(dāng)前第1頁1 2 3