本發(fā)明涉及用于保護脂肪組織的組合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：人體脂肪組織中含有大量的脂肪干細胞(adiposetissue-derivedcells，ADSC)，它是一種間充質(zhì)細胞，可以自我更新，自我復(fù)制，并具有多向分化潛能，在體內(nèi)和體外不同誘導(dǎo)因素下能夠分化為脂肪細胞、神經(jīng)細胞、軟骨細胞、胰島細胞等多種組織的細胞，同時，ADSC可以分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子，具有巨大的應(yīng)用潛力。2001年，Zuk等通過脂肪抽吸術(shù)，在吸出的人體脂肪組織中第一次分離得到了多向分化的干細胞，即脂肪干細胞。ADSC的優(yōu)點在于：①分離方法簡單，可操作性強；②ADSC在脂肪組織中含量高，獲取率高達1％-2％，而骨髓干細胞僅有0.001％-0.002％，脂肪干細胞是骨髓干細胞的1000倍；③體外擴增能力強，易于傳代培養(yǎng)；④具有跨胚層分化能力；⑤免疫排斥低；⑥ADSC的來源——脂肪組織分布廣泛；⑦通過吸脂術(shù)可輕易獲得脂肪，患者痛苦小，供區(qū)損傷低等。因此，近年來ADSC一直是干細胞研究的熱點，應(yīng)用范圍也非常廣泛，例如，ADSC可以用于皮膚創(chuàng)面愈合，軟骨損傷修復(fù)，神經(jīng)功能修復(fù)和皮膚美容整形等方面。ADSC來源于人體脂肪組織，通過吸脂術(shù)采集到的脂肪組織在體外經(jīng)過培養(yǎng)并擴增獲得滿足臨床實驗應(yīng)用的大量ADSC。傳統(tǒng)方法是將采集到的脂肪組織直接放入無菌容器內(nèi)，運送到實驗室進行ADSC培養(yǎng)操作。但是吸脂術(shù)采集脂肪組織本身存在一定的細菌污染風險，有細菌污染就會導(dǎo)致ADSC培養(yǎng)失敗，造成脂肪組織的浪費。實驗的失敗也造成實驗試劑耗材的損失。而即使能夠重新吸脂術(shù)采集脂肪也增加了患者的痛苦和身體的損傷，造成了時間和經(jīng)濟上的損失。另外，同樣采用脂肪組織自然貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)ADSC，沒有使用保護劑的脂肪組織培養(yǎng)的細胞形態(tài)好，活性強，增殖能力強，但耗時較長，培養(yǎng)基消耗較大，時間和經(jīng)濟成本較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種離體脂肪的保護劑及其制備方法和用途。本發(fā)明離體脂肪保護劑，它由如下組分組成：生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素，前述各個組分配比依次為：500ml：500ml：(146.1mg～584.4mg)：125000U：125000U。優(yōu)選地，所述生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U。優(yōu)選地，所述生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。本發(fā)明制備前述的保護劑的方法，步驟如下：按照前述配比取各組分，混勻，即可。本發(fā)明還提供了前述的保護劑在離體脂肪組織的保護中的用途。其中，所述用途是保護劑用于抑菌的用途。其中，所述用途是保護劑用于促進細胞增殖的用途。本發(fā)明還提供了一種離體脂肪組織的保存方法，取離體脂肪組織，與前述的保護劑混合，保存即可。其中，所述保存是在4℃條件下保存。生理鹽水：為醫(yī)用0.9％氯化鈉注射液。DMEM溶液：是美國HyClone公司生產(chǎn)商品化培養(yǎng)基，成分為：無水氯化鈣116.6mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、亞油酸0.042mg/L、五水硫酸銅0.0013mg/L、L-賴氨酸鹽酸鹽91.25mg/L、硫辛酸0.105mg/L、九水硝酸鐵0.05mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、酚紅8.1mg/L、七水硫酸亞鐵0.417mg/L、L-苯丙氨酸35.48mg/L、1,4-丁二胺二鹽酸鹽0.081mg/L、氯化鉀311.8mg/L、L-絲氨酸26.25mg/L、丙酮酸鈉55mg/L、氯化鎂28.64mg/L、L-蘇氨酸53.45mg/L、維生素H0.0035mg/L、無水硫酸鎂48.84mg/L、L-丙氨酸4.45mg/L、D-泛酸鈣2.24mg/L、氯化鈉6999.5mg/L、L-天門冬酰胺7.5mg/L、L-谷氨酰胺365mg/L、氯化膽堿8.98mg/L、無水磷酸二氫鈉54.35mg/L、L-天門冬氨酸6.65mg/L、葉酸2.65mg/L、磷酸氫二鈉71.02mg/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽17.56mg/L、i-肌醇12.6mg/L、七水硫酸鋅0.432mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、煙酰胺2.02mg/L、L-精氨酸鹽酸鹽147.5mg/L、L-脯氨酸17.25mg/L、鹽酸吡哆醛2mg/L、L-胱氨酸鹽酸鹽31.29mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、鹽酸吡哆醇0.031mg/L、L-酪氨酸38.4mg/L、核黃素0.219mg/L、甘氨酸18.75mg/L、L-纈氨酸52.85mg/L、鹽酸硫胺2.17mg/L、L-組氨酸鹽酸鹽31.48mg/L、D-葡萄糖3151mg/L、胸苷0.365mg/L、L-異亮氨酸54.47mg/L、次黃嘌呤2mg/L、維生素B120.68mg/L。L－谷氨酰胺：左旋谷氨酰胺，化學(xué)名2-氨基-4-甲酰胺基丁酸。本發(fā)明的保護劑可以長時間保護離體的脂肪組織，不僅可以有效的降低脂肪組織在培養(yǎng)干細胞初期的細菌污染率，而且用保護液中的脂肪組織分離提取的脂肪干細胞具有良好的活性，較好地保持其性狀和分化潛能，增殖能力強，脂肪組織培養(yǎng)初期細胞生長速度快，縮短了脂肪干細胞培養(yǎng)的時間，節(jié)約了成本，具有良好的市場應(yīng)用價值。下面通過具體實施方式對本發(fā)明做進一步詳細說明，但是并不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。附圖說明圖1本發(fā)明的保護劑配方組1培養(yǎng)中觀察到的細胞生長形態(tài)圖2本發(fā)明的保護劑配方組2培養(yǎng)中觀察到的細胞生長形態(tài)圖3本發(fā)明的保護劑配方組3培養(yǎng)中觀察到的細胞生長形態(tài)圖4對照組培養(yǎng)中觀察到的細胞生長形態(tài)圖5本發(fā)明的保護劑配方組1-組3以及對照組細胞生長曲線圖圖6本發(fā)明的保護劑和對照組儲存4h脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長曲線圖圖7本發(fā)明的保護劑和對照組儲存8h脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長曲線圖圖8本發(fā)明的保護劑和對照組儲存12h脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長曲線圖圖9本發(fā)明的保護劑和對照組儲存24h脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長曲線圖圖10本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長形態(tài)圖11對照組的脂肪組織培養(yǎng)的細胞生長形態(tài)圖12本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CD90檢測結(jié)果圖13本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CD105檢測結(jié)果圖14本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CDHLA-DR檢測結(jié)果圖15本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CD45檢測結(jié)果圖16本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CD14/34/79a檢測結(jié)果圖17本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織和對照組培養(yǎng)的細胞表面標志CD73檢測結(jié)果圖18本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織培養(yǎng)的細胞成脂分化能力圖19本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織培養(yǎng)的細胞成脂分化能力圖20本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織培養(yǎng)的細胞成骨分化能力圖21本發(fā)明的保護劑儲存的脂肪組織培養(yǎng)的細胞成骨分化能力具體實施方式主要儀器及試劑：儀器：離心機Eppendorf5810R、流式細胞儀BeckmanFC500、細胞計數(shù)儀羅氏CASYModel77、倒置相差顯微鏡奧林巴斯CKX41、CO2培養(yǎng)箱Thermo8000、生物安全柜ESCOclassⅡBSC、全自動微生物培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)梅里埃BACT/ALERT3D；試劑：0.9％氯化鈉注射液(生理鹽水)購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)DMEM溶液購自HyClone公司L－谷氨酰胺購自Sigam公司青霉素購自遼寧科泰生物基因制藥股份有限公司鏈霉素購自四川省長征藥業(yè)股份有限公司人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶購自Corning公司0.25％胰酶-0.38g/LEDTA溶液購自GIBCO公司0.04％臺盼藍染色液購自GIBCO公司細菌培養(yǎng)瓶購自梅里埃公司流式抗體CD90、CD73、CD105、CD14、CD34、CD79a、HLA-DR、CD45購自BD公司人脂肪干細胞成骨分化試劑盒購自GIBCO公司人脂肪干細胞成脂分化試劑盒購自GIBCO公司茜素紅S購自Sigam公司油紅O購自Sigam公司實施例1本發(fā)明保護劑的制備及其用于離體脂肪的保護作用一、制備本發(fā)明保護劑保存脂肪組織如下表所示的配方，在無菌條件下將青霉素和鏈霉素溶解在氯化鈉注射液中，然后加入L－谷氨酰胺使之溶解，再加入DMEM溶液，將混合液混勻，然后無菌分裝至已滅菌的采集瓶內(nèi)，每瓶30ml，加入采集的脂肪組織30ml。本發(fā)明保護劑的配方對照組不加保護劑保存脂肪組織30ml。二、保護劑的抑菌實驗抑菌效果測定采用微量肉湯法，試驗藥物濃度最大為50μg(U)/ml，為實際藥物濃度的一半。微量肉湯稀釋法步驟：根據(jù)計數(shù)結(jié)果，用常規(guī)的MH肉湯(營養(yǎng)肉湯)將增菌液稀釋至105-106個/ml；將混勻的菌液加至96孔板，每孔100μl；在第一列分別加入保護液100μl，每批保護液兩個，充分吹打混勻后吸取100μl至第二列，一直倍比稀釋至第11列，37℃培養(yǎng)12-16h。結(jié)果記錄以無菌生長的最后一列對應(yīng)的列數(shù)作為結(jié)果記錄，以高濃度和低濃度都長菌為耐藥，高濃度不長菌、低濃度長菌表示為中度抑菌，高濃度和低濃度都不長為高度抑菌。保護劑存儲0天、15天和30天的抑菌效果的實驗結(jié)果，如表1所示。3組保護劑配方的試驗樣本。表1保護劑存放不同時間后的抑菌結(jié)果備注：表中數(shù)字為0代表無抑菌性；數(shù)字<3為低度抑菌性；3≤數(shù)字<6為中度抑菌性；數(shù)字≥6為高度抑菌性。上述實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的保護劑體存儲存0天是均有高度抑菌性，；在4℃和20℃儲存15天后，抑菌性較0天時雖都有所下降但仍然表現(xiàn)為高度抑菌性。在4℃和20℃儲存30天后，抑菌性大都幅下降表現(xiàn)為中度抑菌，但仍均有抑菌性。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的3種配方配制的保護劑都具有較好地抑菌性，并且儲存30天仍然具有中度及以上的抑菌性，能夠起到減少細菌生長的較好效果。三、保護劑對離體脂肪的保護作用取裝有本發(fā)明上述實施例1的3組配方保護劑30ml的無菌采集瓶和無保護劑的對照組，各10瓶分別通過吸脂術(shù)采集并裝入30ml脂肪組織。4℃保存，分別在采集后4h、8h、12h和24h這4個保存時間段，每個時間段取出6ml脂肪組織用于培養(yǎng)脂肪干細胞。培養(yǎng)方法：1、將采集瓶中下層液體用吸管吸出，留下黃色脂肪組織，注意不要吸到黃色脂肪顆粒；2、加入30ml生理鹽水，震蕩采集瓶，清洗脂肪組織，然后靜置3分鐘，待分層后用吸管吸出下層液體。反復(fù)重復(fù)此步驟，清洗3次；3、將采集瓶中清洗后的脂肪組織取出，每3ml放入一個100mm2的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪將脂肪組織剪成1mm3大小的碎塊，均勻的鋪在培養(yǎng)皿底部；4、每個培養(yǎng)皿加入10ml人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿放置在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5、培養(yǎng)過程中，每3天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，并將培養(yǎng)上清液吸出，添加10ml新鮮的培養(yǎng)基。細菌污染率檢測：在培養(yǎng)第10天，將吸出的培養(yǎng)上清液加入細菌培養(yǎng)瓶中，然后將細菌培養(yǎng)瓶置于全自動微生物培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)中培養(yǎng)。監(jiān)測系統(tǒng)中培養(yǎng)7天后如果系統(tǒng)沒有報告陽性結(jié)果，則將細菌培養(yǎng)瓶從系統(tǒng)中取出廢棄。記錄檢測結(jié)果，并統(tǒng)計細菌污染率，如表2所示。表2使用和未使用保護劑保護脂肪組織不同時間后的細菌污染結(jié)果上述實驗結(jié)果顯示，存放在未裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織，細菌污染率高于存放在裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織。隨著存放時間延長，細胞培養(yǎng)過程中細菌污染率增加，存放在未裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織培養(yǎng)的細胞24h細菌污染率達到了25％，而使用了保護劑后1-3組，只有組1的脂肪組織培養(yǎng)的細胞在24h細菌污染率為5％，大幅度降低了細菌污染率，提高了脂肪干細胞的培養(yǎng)成功率。本發(fā)明保護劑用于離體脂肪保存時，隨著保護劑中的L－谷氨酰胺用量的增加，抑菌效果增加，其中，L－谷氨酰胺用量為365.3mg時，在保存24h內(nèi)就可以保證無細菌污染。因此，本發(fā)明保護劑的配方有選為生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U；進一步有選為所述生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。四、細胞生長實驗⑴實驗方法：取裝有本發(fā)明上述實施例1的1-3組配方保護劑30ml的無菌采集瓶和無保護劑的對照組，分別通過吸脂術(shù)采集并裝入30ml脂肪組織。4℃保存，在采集后4h開始制備培養(yǎng)脂肪干細胞。①培養(yǎng)方法：1、將采集瓶中下層液體用吸管吸出，留下黃色脂肪組織，注意不要吸到黃色脂肪顆粒；2、加入30ml生理鹽水，震蕩采集瓶，清洗脂肪組織，然后靜置3分鐘，待分層后用吸管吸出下層液體。反復(fù)重復(fù)此步驟，清洗3次；3、將采集瓶中清洗后的脂肪組織取出，每3ml放入一個100mm2的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪將脂肪組織剪成1mm3大小的碎塊，均勻的鋪在培養(yǎng)皿底部；4、每個培養(yǎng)皿加入10ml人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿放置在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5、培養(yǎng)過程中，每3天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，并將培養(yǎng)上清液吸出，添加10ml新鮮的培養(yǎng)基。6、用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當觀察到培養(yǎng)皿中細胞生長出來且匯合度達40％，將培養(yǎng)皿中上清液和脂肪組織吸出，注意不要吸到細胞。7、加入1ml的0.25％胰酶-0.38g/LEDTA溶液消化細胞。8、在顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，即可加入5ml培養(yǎng)基終止消化。9、用移液器輕輕吹打瓶壁上剩余的細胞，并輕輕吹打?qū)⒓毎瞪?。將細胞轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，1000rpm離心5min。10、棄上清，加入10ml培養(yǎng)基重懸細胞。此時獲得的細胞為P0代脂肪干細胞。②細胞活率比較：取將上述組1-組3以及對照組培養(yǎng)收獲到的各3個皿的P0代細胞，用0.04％臺盼藍染色液染色，計數(shù)死細胞的數(shù)量，分別取平均值。計算得到收獲的脂肪干細胞中活細胞的百分率，進行比較。③細胞生長形態(tài)：將上述收獲到的組1-組3以及對照組的P0代細胞，按照1×104cells/cm2的細胞密度接種在T-75細胞培養(yǎng)瓶中，加入10ml培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長到第3天的細胞進行顯微鏡下觀察不同組別細胞生長的異同，并拍照。④生長曲線對比：組1-組3以及對照組，每組48個培養(yǎng)皿按上述培養(yǎng)方法操作。培養(yǎng)過程中，每天每組各取出3個培養(yǎng)皿按照步驟7-10收獲每天生長出來的細胞，用細胞計數(shù)儀計數(shù)3個培養(yǎng)皿中細胞數(shù)量，取其平均值，進行生長曲線的繪制。沒有計數(shù)的培養(yǎng)皿每3天更換一次培養(yǎng)基，當觀察到培養(yǎng)皿中細胞生長匯合度達40％，進行步驟6-10收獲P0代細胞。如果在第16天培養(yǎng)皿中細胞生長匯合度未達40％，仍然進行步驟6-10收獲P0代細胞，并計數(shù)。⑵實驗結(jié)果：①細胞活率比較細胞活率結(jié)果如表3所示。表3細胞活率比較組1組2組3對照組細胞活率98.8％±0.4％(n＝3)99.0％±0.5％(n＝3)99.1％±0.6％(n＝3)99.0％±0.2％(n＝3)從表3中可以看出，上述組1-組3以及對照組中的脂肪組織培養(yǎng)出的脂肪干細胞的細胞活率沒有明顯差異。②細胞生長形態(tài)如圖1～4所示，本發(fā)明的保護劑保護的脂肪組織在體外細胞培養(yǎng)過程中觀察到的細胞形態(tài)，與對照組的細胞形態(tài)沒有明顯差異。細胞均呈梭形或紡錘形，細胞分布均一，折光度高，貼壁生長。③生長曲線對比組1-組3以及對照組，細胞培養(yǎng)過程中，每天每組各取出3個培養(yǎng)皿收獲生長出來的細胞，用細胞計數(shù)儀計數(shù)3個培養(yǎng)皿中細胞數(shù)量，取其平均值，進行生長曲線的繪制。結(jié)果如表4和圖5所示。表4細胞計數(shù)生長曲線數(shù)據(jù)統(tǒng)計表從表4和圖5可以看出，對照組在細胞培養(yǎng)初期，細胞生長較慢，在培養(yǎng)第9天開始進入高速生長期，到第13天生長速度減慢，進入平臺期。組1在細胞培養(yǎng)初期，細胞生長較快，細胞增值能力較強。在培養(yǎng)第8天開始進入高速生長期，到第13天生長速度減慢，進入平臺期。組2-組3在細胞培養(yǎng)初期，細胞的適應(yīng)性最好，生長最快，增值能力最強。在培養(yǎng)第6天開始進入高速生長期，到第10天生長速度減慢，進入平臺期?？梢钥闯?，從本發(fā)明保護劑處理的離體脂肪中得到的細胞，隨著保護劑中L－谷氨酰胺用量的增加，生長速度加快，當L－谷氨酰胺用量達到365.3mg時，速度不再增加。因此，本發(fā)明保護劑的配方有選為生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：(365.25mg～584.4mg)：125000U：125000U；進一步有選為所述生理鹽水、DMEM溶液、L－谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的配比為：500ml：500ml：365.25mg：125000U：125000U。綜上，采用本發(fā)明保護劑保存離體脂肪組織，可以有效抑菌，同時從本發(fā)明保護劑處理的離體脂肪中得到的細胞生長快，用于離體脂肪組織的保護效果優(yōu)良。實施例2本發(fā)明保護劑保護的脂肪組織用于培養(yǎng)細胞后的各性能檢測一、制備本發(fā)明的保護劑按照實施例1組2的制備方法，在無菌條件下將青霉素和鏈霉素溶解在氯化鈉注射液中，然后加入L－谷氨酰胺使之溶解，再加入DMEM溶液。將混合液混勻，配制成為每升中含有青霉素125000U、鏈霉素125000U、L－谷氨酰胺365.3mg、DMEM溶液500ml和氯化鈉注射液500ml的混合溶液，然后無菌分裝至已滅菌的采集瓶內(nèi)，每瓶30ml。二、脂肪干細胞生長實驗⑴實驗方法：以裝有保護劑無菌采集瓶保存的脂肪組織為A組，沒有裝保護劑的無菌采集瓶保存的脂肪組織為對照組B組。分別通過吸脂術(shù)采集并裝入30ml脂肪組織。4℃保存，分別在采集后4h、8h、12h和24h這4個保存時間段，開始制備培養(yǎng)脂肪干細胞。①培養(yǎng)方法：1、將采集瓶中下層液體用吸管吸出，留下黃色脂肪組織，注意不要吸到黃色脂肪顆粒；2、加入30ml生理鹽水，震蕩采集瓶，清洗脂肪組織，然后靜置3分鐘，待分層后用吸管吸出下層液體。反復(fù)重復(fù)此步驟，清洗3次；3、將采集瓶中清洗后的脂肪組織取出，每3ml放入一個100mm2的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪將脂肪組織剪成1mm3大小的碎塊，均勻的鋪在培養(yǎng)皿底部；4、每個培養(yǎng)皿加入10ml人脂肪干細胞無血清培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿放置在37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；5、培養(yǎng)過程中，每3天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，并將培養(yǎng)上清液吸出，添加10ml新鮮的培養(yǎng)基。6、用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當觀察到培養(yǎng)皿中細胞生長出來且匯合度達40％，將培養(yǎng)皿中上清液和脂肪組織吸出，注意不要吸到細胞。7、加入1ml的0.25％胰酶-0.38g/LEDTA溶液消化細胞。8、在顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，即可加入5ml培養(yǎng)基終止消化。9、用移液器輕輕吹打瓶壁上剩余的細胞，并輕輕吹打?qū)⒓毎瞪ⅰ⒓毎D(zhuǎn)移到15ml離心管中，1000rpm離心5min。10、棄上清，加入10ml培養(yǎng)基重懸細胞。此時獲得的細胞為P0代脂肪干細胞。11、將P0代脂肪干細胞，按照1×104cells/cm2的細胞密度接種在T-75細胞培養(yǎng)瓶中，加入10ml培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)瓶置于37℃，5％CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12、每天用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況，每3天更換10ml培養(yǎng)基。當培養(yǎng)瓶中細胞匯合度達80％，重復(fù)上述7-10步操作。此時獲得的細胞為P1代脂肪干細胞。②生長曲線對比：在脂肪采集后4h、8h、12h和24h這4個保存時間段分為A1-A4組和B1-B4組，每組48個培養(yǎng)皿按上述培養(yǎng)方法1-10步操作培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天每組各取出3個培養(yǎng)皿按照步驟7-10收獲每天生長出來的細胞，用細胞計數(shù)儀計數(shù)3個培養(yǎng)皿中細胞數(shù)量，取其平均值，進行生長曲線的繪制。沒有計數(shù)的培養(yǎng)皿每3天更換一次培養(yǎng)基，當觀察到培養(yǎng)皿中細胞生長匯合度達40％，進行步驟6-10收獲P0代細胞。如果在第16天培養(yǎng)皿中細胞生長匯合度未達40％，仍然進行步驟7-10收獲P0代細胞，并計數(shù)。③細胞活率比較：取將上述A組和B組收獲到的P0代細胞，用0.04％臺盼藍染色液染色，計數(shù)死細胞的數(shù)量，采集后4h、8h、12h和24h這4個保存時間段各3皿，分別取平均值。計算得到收獲的脂肪干細胞中活細胞的百分率，進行比較。④細胞生長形態(tài)：將上述收獲到的A組和B組的P0代細胞，按照步驟11-12進行傳代培養(yǎng)。取生長到第3天的細胞進行顯微鏡下觀察不同組別細胞生長的異同，并拍照。⑤表面標志檢測：取A組和B組的P0代細胞傳代培養(yǎng)后，收獲的P1代細胞，以FITC標記的CD90、CD73，PE標記的CD105、CD14、CD34、CD79a，PC5標記的HLA-DR以及PC7標記的CD45進行流式檢測。⑥細胞分化能力測試：取A組和B組的P0代細胞傳代培養(yǎng)后，收獲的P1代細胞，分別以5000個/cm2的密度接種到6孔板中，待長至70％匯合度時，在培養(yǎng)基中加入成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每4天更換一次培養(yǎng)基，14天時分別用油紅O染色對成脂分化細胞染色，大于21天用茜素紅S對成骨分化細胞進行染色。⑵實驗結(jié)果：①生長曲線對比A1-A4組和B1-B4組，細胞培養(yǎng)過程中，每天每組各取出3個培養(yǎng)皿收獲生長出來的細胞，用細胞計數(shù)儀計數(shù)3個培養(yǎng)皿中細胞數(shù)量，取其平均值，進行生長曲線的繪制。結(jié)果如表5和圖6-9所示。表5細胞計數(shù)生長曲線數(shù)據(jù)統(tǒng)計表備注：A組為存放在裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織；B組為存放在未裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織，1-4分別為采集后4h、8h、12h和24h這4個脂肪組織保存時間段。從表5和圖6-9可以看出，有保護劑保護的脂肪組織在細胞培養(yǎng)初期，細胞生長更快，細胞增值能力更強，在培養(yǎng)第6天開始進入高速生長期，到第10天生長速度減慢，進入平臺期。而沒有保護劑的脂肪組織在細胞培養(yǎng)初期，細胞生長較慢，在培養(yǎng)第9天開始進入高速生長期，到第13天生長速度減慢，進入平臺期。②細胞活率比較細胞活率結(jié)果如表6所示。表6細胞活率比較備注：A組為存放在裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織；B組為存放在未裝有保護劑的采集瓶中的脂肪組織從表6中可以看出，脂肪組織無論是否儲存在保護劑中，其培養(yǎng)出的脂肪干細胞的細胞活率沒有明顯差異。③細胞生長形態(tài)如圖10～11所示，A組和B組細胞傳代培養(yǎng)后，顯微鏡下觀察不同組別細胞的生長情況，觀察到A組和B組細胞形態(tài)沒有明顯差異。細胞均呈梭形或紡錘形，細胞分布均一，折光度高，貼壁生長。④表面標志檢測如圖12～17所示，A組和B組細胞體外培養(yǎng)獲得的脂肪干細胞通過流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞高表達CD90、CD105、CD73，而不表達CD14、CD34、CD79a、CD45、HLA-DR，兩組檢測結(jié)果一致，并且符合脂肪干細胞表面標志的特征。⑤細胞分化能力測試如圖18～21所示，本發(fā)明的保護劑保護的脂肪組織體外培養(yǎng)獲得的脂肪干細胞，經(jīng)成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后出現(xiàn)大量的脂肪滴，油紅O染色，表明細胞具有成脂分化能力。細胞經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后出現(xiàn)鈣堆積，茜素紅S染色，表明細胞具有成骨分化能力。對照組細胞也出現(xiàn)相同結(jié)果，表明兩組細胞具有相同的成脂、成骨分化能力。實驗結(jié)果說明，從本發(fā)明保護劑處理的離體脂肪中得到的脂肪干細胞，較好地保持其性狀和分化潛能，同時增殖能力強，在細胞培養(yǎng)初期細胞能較快適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，細胞生長的速度更快，縮短了脂肪干細胞培養(yǎng)的時間，減少了培養(yǎng)基的消耗，節(jié)約資金。綜上所述，本發(fā)明的保護劑可以長時間保護離體的脂肪組織，不僅可以有效的降低脂肪組織在培養(yǎng)干細胞初期的細菌污染率，減少被采集者再次采集的痛苦，減少因污染造成的脂肪干細胞培養(yǎng)的損失，節(jié)約成本，而且用保護劑中的脂肪組織分離提取的脂肪干細胞具有良好的活性，較好地保持其性狀和分化潛能，增殖能力強，在細胞培養(yǎng)初期細胞能較快適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，細胞生長的速度更快，縮短了脂肪干細胞培養(yǎng)的時間，減少了培養(yǎng)基的消耗，節(jié)約資金。因此，本發(fā)明的保護劑安全有效，配制成本較低，使用效果很好，節(jié)約成本，提高效率，使用非常方便，具有良好的推廣應(yīng)用前景。當前第1頁1 2 3