本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液及注射液。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells）是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，源于發(fā)育早期的中胚層，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，可以從骨髓、外周血、脂肪及皮膚等多種組織中獲得。間充質(zhì)干細胞屬于非終末分化細胞，它既有間質(zhì)細胞的特征，又有內(nèi)皮細胞及上皮細胞的特征；作為一類多能干細胞，它在體外特定的誘導條件下，可以向骨、軟骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神經(jīng)、內(nèi)皮及胰島樣細胞等方向增殖分化。

間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)過程中，會分泌干細胞因子（SCF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板源性生長因子A（PDGF-A）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）、白細胞介素（IL）、胰島素樣生長因子（IGF-Ⅱ）、巨噬細胞集落刺激因子（GSFs）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、干擾素（IFN）、神經(jīng)生長因子（NGF）、以及細胞分泌的外泌體（Exosome）、載有功能性蛋白質(zhì)、mRNA 及microRNA（miRNA）等物質(zhì)。包含RNA分子這種復合細胞因子在人體內(nèi)能夠促進細胞增殖、分化和再生，加強新陳代謝，防止細胞衰老；介導機體細胞信號傳導、活化機體干細胞，促進新毛細血管形成，進行生理性修復；調(diào)節(jié)機體亞健康，提高機體免疫清除損傷、病變、衰老的細胞。有研究表明，使用干細胞分泌因子及Exosome與使用干細胞具有相同的作用。因此，在細胞治療中不使用細胞而使用細胞分泌因子的去細胞化的概念，受到越來越多的關(guān)注和支持，干細胞分泌因子與干細胞相比，優(yōu)勢明顯。

細胞在體外的生長依賴于培養(yǎng)液，而干細胞直接將細胞因子分泌到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液的成分直接關(guān)系到細胞因子的臨床使用?，F(xiàn)階段動物細胞的體外培養(yǎng)主要依賴于胎牛血清，這樣細胞在體外才能較好的增殖生長。但由于胎牛血清成分復雜，使用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞存在潛在的細胞毒性作用、外源病毒和致病因子污染問題，使細胞培養(yǎng)的標準化和終產(chǎn)品純化難度加大，異種血清的殘留也易導致臨床上的過敏反應(yīng)。因此，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和應(yīng)用勢在必行。所謂無血清培養(yǎng)基，是指不含有動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養(yǎng)基。

世界衛(wèi)生組織將機體無器質(zhì)性病變，但是有一些功能改變的狀態(tài)稱為“第三狀態(tài)”，我國稱為“亞健康狀態(tài)”。亞健康即指介于健康和疾病之間的一種生理功能低下的狀態(tài)。臨床藥物大體都是用于治療疾病的藥物，沒有針對亞健康群體的調(diào)節(jié)劑。針對病患，臨床上常用一些營養(yǎng)增補劑，來調(diào)節(jié)機體代謝及免疫系統(tǒng)，例如：人血白蛋白，具有增加循環(huán)血容量、維持血漿膠體滲透壓的作用，可作為氮源為組織提供營養(yǎng)，利于細胞新陳代謝，也可作為載體，輸送不同的物質(zhì)；水溶性維生素，具有增強免疫力，抗氧化提高新陳代謝的作用，還具有控制和預(yù)防癌癥的作用；復方氨基酸，可參與蛋白質(zhì)的合成和代謝，生成酶類、激素、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白，促進組織愈合，恢復正常生理功能；谷氨酰胺，是一種營養(yǎng)增補劑，為機體提供氮源，促進蛋白質(zhì)的合成，改善機體營養(yǎng)代謝，調(diào)節(jié)血糖，并可增強免疫系統(tǒng)的功能以及抗氧化；微量元素注射液，屬于腸外營養(yǎng)添加劑，維持機體內(nèi)的生化反應(yīng)正常進行；水解蛋白，可進入組織細胞，參與蛋白質(zhì)合成代謝，獲得正氮平衡，并生成酶類、激素、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白、促進組織生理功能恢復正常；勃脈力A液，是水、電解質(zhì)的補充劑和堿化劑，可保持滲透壓，保護細胞。這些臨床藥物已在臨床使用多年，其安全性和有效性得到社會的認可。

專利CN102920735A、專利CN1966080A，均提供了一種間充質(zhì)干細胞注射液，但是其注射液成分含有活細胞，降低了臨床使用的安全性和可控性，并且，培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞時使用了胎牛血清，引入外源蛋白，使用的風險性更大；專利CN1618981A提供了一種干細胞分泌因子制備方法，其干細胞經(jīng)過基因修飾后變?yōu)橛郎毎?，由于基因修飾存在一定的潛在風險，且干細胞分泌因子經(jīng)過分離純化，過程繁雜，干細胞分泌因子不可避免會造成損失；專利CN102008507A提供了一種臍帶間充質(zhì)干細胞注射液，但是其僅加入人血白蛋白和肝素鈣，配方營養(yǎng)結(jié)構(gòu)單一，對細胞活性及分泌因子含量會有一定影響，并且其注射液中含有活的干細胞，安全性也存在問題；專利CN102703385A提供了一種間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液，其應(yīng)用細胞培養(yǎng)液添加無血清添加劑、bFGF、 EGF、胎球蛋白和抗生素制成干細胞培養(yǎng)液，首先細胞培養(yǎng)液不屬于臨床級試劑，不能直接應(yīng)用于人體，其次，培養(yǎng)液中加入抗生素，存在過敏的風險，最后，其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)單一，不能滿足細胞營養(yǎng)，可能對細胞活性及分泌因子含量有一定影響。

不論是干細胞臨床研究和治療，還是對干細胞分泌因子的應(yīng)用開發(fā)，均需要大量擴增間充質(zhì)干細胞，因此，如何獲得大量的間充質(zhì)干細胞是研究的前提和關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供一種干細胞培養(yǎng)液及注射液。該注射液直接進行靜脈注射，不含活細胞。操作過程簡單可靠，應(yīng)用安全，能有效提高機體免疫力，恢復健康狀態(tài)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種干細胞培養(yǎng)液，其原料按體積百分比計算，由如下成分組成：復方氨基酸注射液10%、注射用水溶性維生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脈力A液68%。

采用所述干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，并收集間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清；將收集的培養(yǎng)上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，收集濾液，即為間充質(zhì)干細胞注射液。

所述間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞、胎盤間充質(zhì)干細胞、臍帶血間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或牙髓間充質(zhì)干細胞等成體干細胞。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種干細胞培養(yǎng)液的配制方法，包括如下步驟。

步驟1、取1%的勃脈力A液，溶解注射用水溶性維生素，得混合液。

步驟2、分別將步驟1的混合液、復方氨基酸注射液、丙氨酰谷氨酰胺、人血白蛋白、水解蛋白注射液、微量元素注射液、67%的勃脈力A液，按比例混勻，即為干細胞培養(yǎng)液。

所述干細胞培養(yǎng)液pH值為6.8-7.0，滲透壓為310 mOsm/kg。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種間充質(zhì)干細胞注射液的制備方法，包括以下步驟。

步驟1、間充質(zhì)干細胞樣本采集、處理。

步驟2、干細胞的原代提取及培養(yǎng)：用物理剪切的方法分離間充質(zhì)的組織，以組織塊貼壁培養(yǎng)法采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞；離心分離單個核細胞，以貼壁培養(yǎng)的方式分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞。

步驟3、干細胞的傳代培養(yǎng)：當細胞達到70%以上融合時，清洗兩次后加入細胞消化液，過濾去除組織小塊，離心棄上清后，獲得原代間充質(zhì)干細胞；原代間充質(zhì)干細胞用無血清培養(yǎng)基重懸后，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，待細胞融合度達到80%-90%時，收集第一代間充質(zhì)干細胞，作為種子細胞或繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

步驟4、間充質(zhì)干細胞的生物學及流式細胞鑒定。

步驟5、配制干細胞培養(yǎng)液，對間充質(zhì)干細胞換液，繼續(xù)培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，并收集間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清。

步驟6、將步驟5中收集的干細胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，收集濾液，即為干細胞注射液。

所述步驟1中樣本處理采用酒精浸泡時間1-4min，所述酒精經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾除菌。

所述無血清培養(yǎng)基是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%血清替代品，且使用前需補加L-谷氨酰胺。

所述步驟2貼壁培養(yǎng)中采用CO₂培養(yǎng)箱；所述CO₂培養(yǎng)箱的條件為：37℃、12%的氧氣、5%二氧化碳、83%氮氣的低氧條件。

所述步驟3中接種密度為5000-6000個/cm²。

所述干細胞注射液可直接應(yīng)用于人體靜脈注射，劑量為200m人/次。

本發(fā)明的有益效果。

本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)液及注射液，模擬間充質(zhì)干細胞體內(nèi)低氧環(huán)境并使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞融合率達到70%時，換用干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2天，收集干細胞培養(yǎng)上清液，上清液中含有干細胞分泌因子，經(jīng)過濾后得到干細胞注射液，可直接應(yīng)用于人體靜脈注射。本發(fā)明使用去細胞化的干細胞分泌因子進行靜脈注射，去細胞化有助于化解主管部門對植入干細胞后不受控制的危險性憂慮，并且去細胞化的上清液不會增加末梢微血管阻塞的風險，也不會致瘤；本發(fā)明的干細胞培養(yǎng)液，為干細胞生存環(huán)境提供基本營養(yǎng)，能有效促進干細胞分泌大量的細胞因子和外泌體，保持干細胞活性，并且培養(yǎng)液中營養(yǎng)增補劑配方與干細胞分泌因子配合，能有效緩解機體亞健康狀態(tài)，重現(xiàn)機體健康；本發(fā)明提供的干細胞培養(yǎng)液，原料成分均屬于臨床級別，可直接用于人體，安全可靠。

本發(fā)明的細胞培養(yǎng)環(huán)境為低氧條件下培養(yǎng)，生理學上體內(nèi)細胞生存的環(huán)境氧含量為1-13%，但大部分現(xiàn)有技術(shù)中的細胞體外培養(yǎng)是在21%氧氣濃度下完成。間充質(zhì)干細胞主要在體內(nèi)低氧的環(huán)境中生長，低氧更符合其生理狀態(tài)，富氧反而對細胞具有損傷作用。目前研究表明，低氧培養(yǎng)可提高間充質(zhì)干細胞的增殖能力，遷移能力及黏附能力，并降低細胞衰亡率。但是低氧下會產(chǎn)生更多地乳酸，作為代謝副產(chǎn)物，過多的乳酸會對細胞產(chǎn)生毒性，限制細胞進一步生長，因此，本發(fā)明經(jīng)過大量的實踐，給出適于間質(zhì)干細胞的低氧條件12%的氧氣。本發(fā)明采用血清替代品替代傳統(tǒng)間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)中使用的胎牛血清，在臨床應(yīng)用中能避免動物血清及動物來源的異種蛋白帶來的潛在風險。

同時，本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)液及注射液，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，有巨大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為間充質(zhì)干細胞細胞生長狀態(tài)圖。

圖2為間充質(zhì)干細胞流式細胞檢測圖；其中2-1.間充質(zhì)干細胞CD90表達率波形圖、2-2.間充質(zhì)干細胞CD73表達率波形圖、2-3.間充質(zhì)干細胞CD105表達率波形圖、2-4.間充質(zhì)干細胞CD45表達率波形圖、2-5. 間充質(zhì)干細胞CD34表達率波形圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

實施例1。

一種臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液及注射液的制備方法，包括以下步驟。

步驟1、樣本采集。

經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，采集足月健康胎兒新鮮無菌臍帶組織，4℃保存，24h內(nèi)處理。產(chǎn)婦產(chǎn)前七天內(nèi)采集母血進行HIV檢測、乙肝檢測、丙肝檢測、梅毒檢測、谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測、巨細胞病毒檢測和支原體檢測，全部檢測合格后，方可使用其胎兒新鮮無菌臍帶組織。

清潔和消毒：在生物安全柜內(nèi)取出臍帶，先用0.9%的氯化鈉注射液10ml進行表面清洗，之后將臍帶浸入經(jīng)0.22μm過濾除菌的75%酒精內(nèi)2min；最后用0.9%的氯化鈉注射液10ml再次清洗，去除殘余酒精和血漬。

步驟2、干細胞的原代提取及培養(yǎng)。

（1）將臍帶剪成2-3cm的小段，剔除外側(cè)羊膜和內(nèi)部血管得到華通氏膠，將所得華通氏膠剪成2mm³的組織小塊，用20ml生理鹽水清洗3次后，得到無血漬的華通氏膠組織小塊。

（2）將得到的無血漬的華通氏膠組織小塊，用10mlⅠ型膠原酶（0.1mg/mL）消化處理10min，從組織釋放出細胞外基質(zhì)蛋白，即得到細胞外基質(zhì)蛋白和組織小塊組成的混合物。

（3）取2-3mL上述混合物，涂抹在直徑為10cm的培養(yǎng)皿上，以恰好鋪滿培養(yǎng)皿底部且組織小塊分布均勻為佳，用無菌鑷子移動組織小塊位置，使其均勻分布；在生物安全柜內(nèi)自然晾干2min，形成膠狀包被層粘附在培養(yǎng)皿底部，組織小塊被固定在培養(yǎng)皿底部。

（4）向上述培養(yǎng)皿內(nèi)加入無血清培養(yǎng)基10ml，放置在CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、12%的氧氣、5%二氧化碳、83%氮氣的低氧條件下培養(yǎng)，24h后進行一次全量換液；培養(yǎng)4-5天在顯微鏡下觀察有細胞從組織小塊內(nèi)生長出，再培養(yǎng)至第8天時，進行第二次全量換液，同時收集組織小塊。

所述無血清培養(yǎng)基是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%血清替代物（血清替代品為商業(yè)購買，PALL 公司，15950-017），不含動物源性物質(zhì)，且使用前需補加L-谷氨酰胺，使其濃度為15mg/L。使用血清替代物,替代傳統(tǒng)人臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)中使用的胎牛血清，在臨床應(yīng)用中能避免動物血清及動物來源的異種蛋白帶來的潛在風險。

（5）將上述（4）中收集的組織小塊轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)皿內(nèi)，進行組織小塊二次貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)原代間充質(zhì)干細胞，根據(jù)細胞生長情況（一般細胞培養(yǎng)至第5-6天）進行全量換液，以補充營養(yǎng)物質(zhì)。

在組織小塊的不同培養(yǎng)方法中，組織小塊貼壁及細胞生長情況的差異，如表1所示。其中，本實施例中組織小塊粘附在培養(yǎng)皿底部用時，以未加培養(yǎng)基時，培養(yǎng)皿倒置，組織小塊未從培養(yǎng)皿底部落下為標準。

表1：組織小塊貼壁及細胞生長情況比較。

由表1可知：在培養(yǎng)皿底部涂抹膠狀混合物，有利于組織小塊快速貼壁，且能夠明顯促進細胞從組織塊內(nèi)生長出及在培養(yǎng)皿底部的生長；相同時間內(nèi)，相同數(shù)量的組織小塊通過本方法培養(yǎng)后，獲取的臍帶原代間充質(zhì)干細胞數(shù)量比普通組織塊貼壁法增加了一倍。

本發(fā)明的混合物在培養(yǎng)皿底部形成的包被層，一方面縮短了組織小塊的貼壁時間；另一方面也使細胞更容易從組織小塊內(nèi)游離出（包被層為細胞生長構(gòu)建了立體的三維生長環(huán)境，既促進了細胞對培養(yǎng)皿底部的粘附，又有利于培養(yǎng)液的滲透，還有利于細胞在培養(yǎng)皿底部的增殖和遷移），使原代細胞培養(yǎng)時間大幅縮短。并且與傳統(tǒng)的酶消化法相比，本發(fā)明采用性質(zhì)溫和的膠原酶Ⅰ短時消化獲取細胞外基質(zhì)蛋白，大部分細胞始終保留在組織小塊內(nèi)，避免了酶對細胞膜的損傷，保證了細胞活力。

不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞初次培養(yǎng)擴增至70%融合時，所需要的培養(yǎng)時間和流式檢測結(jié)果，如表2所示。

表2：不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞擴增時間和流式檢測。

由表2可知，不同氧濃度條件下培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞，均符合國際細胞治療協(xié)會關(guān)于間充質(zhì)干細胞的標準：陽性表達率≥95%，陰性表達率≤2%，且不同氧濃度條件培養(yǎng)的細胞檢測結(jié)果一致，表明低氧條件對臍帶間充質(zhì)干細胞的生長沒有影響；但在12%氧氣的低氧條件下，臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)時間最短，但是當氧濃度超過18%時，培養(yǎng)時間變長，故本發(fā)明使用12%氧氣的低氧條件。

步驟3、干細胞的傳代培養(yǎng)。

（1）顯微鏡觀察細胞達到70%以上融合時，進行傳代擴增：去除無血清培養(yǎng)基，用0.9%的氯化鈉注射液洗滌2次后，加入5ml細胞消化液（型號：ACCUTASE GMP，廠家Innovative Cell Technologies），使貼壁細胞脫離培養(yǎng)皿底部，過濾去除組織小塊，離心1000rpm處理10min，棄上清后，獲得原代臍帶間充質(zhì)干細胞。

（2）獲取的原代細胞用無血清培養(yǎng)基重懸后，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，接種密度控制在5000-6000個/cm²，培養(yǎng)一段時間后，待細胞融合度達到80%-90%時，收集第一代臍帶間充質(zhì)干細胞，作為種子細胞或繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞，在6%-21%不同氧濃度條件下培養(yǎng)3天，按照ELISA試劑盒（美國，R&D公司）說明書操作，分別檢測其細胞培養(yǎng)上清中分泌因子，如：干細胞因子（SCF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、白細胞介素6（IL6）、肝細胞生長因子（HGF）、腫瘤壞死因子β3（TNF-β3）的含量，具體步驟如下。

（1）取出酶標板，依照次序?qū)?yīng)分別加入100μL的細胞因子標準品于空白孔中作為陽性對照；分別標記樣品編號，加入100μL臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清于空白孔中，37℃孵育90min。

（2）洗板機清洗4次，每次靜置10-20s；每孔加入100μL的生物素標記抗體工作液，37℃孵育60min。

（3）洗板機清洗5次，每次靜置10-20s；每孔加入100μL的酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30min。

（4）洗板機清洗4次，每次靜置10-20s；每孔加入100μL的顯色劑，37℃避光孵育反應(yīng)15 min。

（5）每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。

每份標本設(shè)3個重復孔，用全自動酶標儀測450nm處吸光度(A)值，取其平均值，根據(jù)所繪制的標準曲線計算出細胞因子含量，結(jié)果如表3所示。

表3：不同氧濃度下臍帶間充質(zhì)干細胞分泌因子含量測定（單位：pg/mL）。

由表3可知，對選取的7個細胞因子進行含量測定，可知在12%氧氣的低氧條件下，臍帶間充質(zhì)干細胞分泌細胞因子含量最高，且提高了2-4倍，故本實驗全程使用12%氧氣的低氧條件培養(yǎng)細胞，可大幅提高獲取細胞因子的產(chǎn)量。

步驟4、臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學及流式細胞鑒定。

1、細胞生長及其形態(tài)學特點：采用本實施例步驟1的消化方法，將混合物涂抹在培養(yǎng)皿上進行貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3-5天時經(jīng)倒置顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)有較多貼壁細胞生長；培養(yǎng)至10天時，細胞融合率達到70%，見圖1；組織小塊二次利用時，培養(yǎng)24h后即觀察到有細胞進行貼壁生長，9天后細胞融合率達到70%左右。

2、流式細胞鑒定間充質(zhì)干細胞表面標志。

收集第二代細胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次（1000rpm離心處理5min），調(diào)整細胞濃度至5×10⁶個/ml；加入細胞表面標志物對應(yīng)的抗體后孵育30min，再次洗滌重懸后，即可上機（流式細胞儀FACSCalibur，BD公司）檢測。所用抗體包括下列細胞表面分子的抗體：CD90、CD105、CD73為陽性標記，CD45、CD34為陰性標記。具體結(jié)果參見表4，臍帶間充質(zhì)干細胞流式檢測，結(jié)果見圖2。

表4：臍帶間充質(zhì)干細胞表面標志物檢測結(jié)果。

由表4可知：本實施例中組織小塊所收獲得的原代臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)兩次傳代培養(yǎng)后，仍符合國際細胞治療協(xié)會關(guān)于間充質(zhì)干細胞的標準：陽性表達率≥95%，陰性表達率≤2%；所獲得的細胞可作為臨床研究和應(yīng)用的種子細胞。

步驟5、配制干細胞培養(yǎng)液，然后換用干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)干細胞，并收集干細胞培養(yǎng)上清。

1.配制干細胞培養(yǎng)液。

（1）取2ml的勃脈力A液，溶解注射用水溶性維生素（華瑞制藥有限公司，批號：國藥準字H32023002，規(guī)格0.5g/瓶）。

（2）將步驟（1）中的混合液、復方氨基酸注射液（北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號：國藥準字H19993345）、丙氨酰谷氨酰胺（華瑞制藥有限公司，批號：國藥準字H20058281）、人血白蛋白（華蘭生物工程股份有限公司，批號：國藥準字S19993024）、水解蛋白注射液（遼源市泓源制藥有限公司，批號：H22026405）、微量元素注射液（華瑞制藥有限公司，批號：國藥準字H32023907）、勃脈力A液（上海百特醫(yī)療用品有限公司，批號：H20000475），按比例混勻，pH值為6.8-7.0，滲透壓為310 mOsm/kg，即為干細胞培養(yǎng)液。干細胞培養(yǎng)液的配方比例，如表5所示。

（3）待臍帶間充質(zhì)干細胞生長到70%融合時，吸棄培養(yǎng)上清，用生理鹽水清洗細胞一次，再用步驟（2）制備的干細胞培養(yǎng)液清洗，之后取干細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2天。

（4）持續(xù)觀察細胞狀態(tài)，2天后收集細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)細胞消化液（型號：ACCUTASE GMP，廠家Innovative Cell Technologies）消化后收集細胞，進行細胞分析。

表5：干細胞培養(yǎng)液配方比例。

由表5可知：用干細胞培養(yǎng)液來培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，2天后測定細胞活率，從第二組開始，干細胞活率保持在96.4%以上，其中第二組干細胞活率最高，為97.5%，且綜合考慮價值，本發(fā)明選擇第二組作為干細胞培養(yǎng)液的優(yōu)選配方，即：復方氨基酸注射液20ml、注射用水溶性維生素0.25g、丙氨酰谷氨酰胺1ml、人血白蛋白20ml、水解蛋白注射液20ml、微量元素注射液1ml、勃脈力A液136ml。

（2）應(yīng)用ELISA方法，測定臍帶間充質(zhì)干細胞注射液分泌因子的濃度。

選擇測定干細胞因子（SCF）、表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板源性生長因子A（PDGF-A）、白細胞介素6（IL6）、白細胞介素1（IL1）、肝細胞生長因子（HGF）、腫瘤壞死因子β3（TNF-β3）、粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）的濃度，具體步驟如下。

（1）取出酶標板，依照次序?qū)?yīng)分別加入50μL的細胞因子標準品于空白孔中作為陽性對照；分別標記樣品編號，加入50μL步驟5制備的干細胞培養(yǎng)上清于空白孔中；在樣品孔中加入10μL的生物素標記液；在標準品孔和樣品孔中加入50μL的酶標記溶液。

（2）37℃孵育60min；洗板機清洗5次，每次靜置20s；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃避光孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50μL的H₂SO₄終止液，終止反應(yīng)。

（3）每份標本設(shè)3個重復孔，用全自動酶標儀測450nm處吸光度(A)值，取其平均值，根據(jù)所繪制的標準曲線，計算出細胞因子含量，結(jié)果如表6所示。

白蛋白生理鹽水和干細胞培養(yǎng)液，各10ml，分別培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞2天，然后收集培養(yǎng)上清，其細胞因子含量比較結(jié)果如表6所示。

表6：細胞因子含量比較（單位：pg/mL）。

由表6可知：對所選取的10個細胞因子含量的測定，可知應(yīng)用干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的干細胞與白蛋白生理鹽水培養(yǎng)相比，其培養(yǎng)上清里的細胞因子含量提高了2-4倍。因此，利用本發(fā)明所提供的干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)干細胞，可大幅提高獲取細胞因子的產(chǎn)量。

步驟6、利用收集的干細胞上清，制備干細胞注射液。

（1）將收集的細胞上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾，收集濾液，即為干細胞注射液。

（2）細菌學鑒定，經(jīng)革蘭氏陰性及革蘭氏陽性菌檢測，結(jié)果均呈陰性。

（3）應(yīng)用凝膠法進行內(nèi)毒素檢測，每1ml中含內(nèi)毒素量0.2EU，符合國家藥典對注射液的要求0.5EU。

使用該干細胞注射液直接應(yīng)用于卵巢早衰患者的人體靜脈注射，每月注射4次，劑量為200ml每人/次，連續(xù)注射2月，潮熱多汗、陰道干澀、性欲下降等絕經(jīng)前后癥狀的卵巢早衰癥狀得到明顯改善，潮熱多汗現(xiàn)象消失，陰道分沁物正常，性欲恢復正常。