本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

山羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物，生產(chǎn)肉、絨、奶等經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，特別是山羊奶具有巨大的市場潛力，如果獲得、保持優(yōu)質(zhì)的山羊品種遺傳資源，是對現(xiàn)有種群進(jìn)行改良，成為山羊大規(guī)模養(yǎng)殖的迫切問題。

克隆胚胎屬于克隆的一種方法，最常用的就是體細(xì)胞克隆技術(shù)，是指采用核移植的方法，利用細(xì)胞拆合或者細(xì)胞重組技術(shù)，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或者含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核質(zhì)體作為核供體，將核供體移入核受體中構(gòu)建重組胚胎(受精卵)，然后核供體在去核卵母細(xì)胞的包質(zhì)中被重新編程、發(fā)育的過程。體細(xì)胞克隆技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有許多成功案例，對于研究動物胚胎發(fā)育、研究胚胎發(fā)育機(jī)理、藥物治療作用、克隆動物等方面具有重要的應(yīng)用價值。

合理利用克隆胚胎技術(shù)，構(gòu)建山羊細(xì)胞克隆胚胎是保持山羊優(yōu)質(zhì)遺傳資源的關(guān)鍵手段，隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，克隆胚胎技術(shù)逐漸成熟并推廣應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)中，m16培養(yǎng)基是胚胎移植之前用于培養(yǎng)胚胎的常用培養(yǎng)基，但是這種培養(yǎng)基是基礎(chǔ)通用的培養(yǎng)基，雖然具有廣泛適用性，但是針對性不強，一般需要的克隆胚胎發(fā)育率較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，針對性強，解決了m16培養(yǎng)基一般需要的克隆胚胎發(fā)育率較低的問題。

本發(fā)明提供的一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、100-120mg的檸檬酸、100mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有10-20mg的胎牛血清、120-150mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種山羊細(xì)胞克隆胚胎的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，將重組好的山羊受精卵置于權(quán)利要求1所述的a液中離體培養(yǎng)，直至胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期；

步驟2，將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎用0.85g/100ml氯化鈉溶液清洗后，接著置于權(quán)利要求1所述的b液中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液具有以下有益效果：

(1)對現(xiàn)有技術(shù)的dmem培養(yǎng)基和m16培養(yǎng)基進(jìn)行改良，制備出培養(yǎng)液的a液和b液，然后采用分階段培養(yǎng)細(xì)胞，二細(xì)胞胚胎數(shù)、四細(xì)胞胚胎數(shù)、桑葚胚數(shù)、囊胚數(shù)、囊胚植入母體后成活率均較高，山羊受精卵的體外發(fā)育率總體較dmem培養(yǎng)基和m16培養(yǎng)基高。

(2)具體實施方式中，比較a、f、g、h組，發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸和蘋果酸，最后獲得的囊胚數(shù)高于不添加檸檬酸、不添加蘋果酸或者檸檬酸以及蘋果酸均不添加的f、g、h組，說明檸檬酸和蘋果酸有助于提高山羊受精卵體外發(fā)育率和囊胚植入母體后成活數(shù)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件操作，所用試劑均為市售，由于不涉及發(fā)明點，故不對其步驟進(jìn)行詳細(xì)描述。

除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

本發(fā)明提供的一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、100-120mg的檸檬酸、100mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有10-20mg的胎牛血清、120-150mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

其中，dmem高糖型液體培養(yǎng)基、m16液體培養(yǎng)基分別是市售的dmem高糖型培養(yǎng)基、m16培養(yǎng)基按照說明書配制成液體后制成。

其中，所述蘋果酸是l-蘋果酸、d-蘋果酸或者混合物dl-蘋果酸。

實施例1

一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、100mg的檸檬酸、100mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有15mg的胎牛血清、150mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

所述蘋果酸是l-蘋果酸。

實施例2

一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、120mg的檸檬酸、100mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有17mg的胎牛血清、120mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

所述蘋果酸是d-蘋果酸。

實施例3

一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、100mg的檸檬酸、110mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有10mg的胎牛血清、130mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

所述蘋果酸是混合物dl-蘋果酸。

實施例4

一種山羊細(xì)胞克隆胚胎培養(yǎng)液，包括a液和b液，每升所述a液中含有0.2mg的硝酸亞鐵、350mg的氯化鉀、100mg的檸檬酸、115mg的磷酸二氫鈉、余量為dmem高糖型液體培養(yǎng)基；

每升所述b液中含有20mg的胎牛血清、140mg的蘋果酸、0.2g的氯化鈉、余量為m16液體培養(yǎng)基。

所述蘋果酸是l-蘋果酸、d-蘋果酸或者混合物dl-蘋果酸。

實施例1-4的培養(yǎng)液配制時，先配制好dmem高糖型液體培養(yǎng)基，然后按照配方稱取各組分，混勻，充分溶解即可。

本發(fā)明還提供了一種山羊細(xì)胞克隆胚胎的培養(yǎng)方法，首先按常規(guī)方式制備重組好的山羊受精卵，然后利用下述實施例5的方法使受精卵發(fā)育，培養(yǎng)至細(xì)胞克隆胚胎的囊胚。下面以實施例1中的培養(yǎng)液配方為例，說明實施例5的方法步驟。

實施例5

一種山羊細(xì)胞克隆胚胎的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1，將重組好的山羊受精卵置于實施例1所述的a液中離體培養(yǎng)，直至胚胎發(fā)育到二細(xì)胞期；

步驟2，將發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎用0.85g/100ml氯化鈉溶液清洗后，接著置于實施例1所述的b液中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

發(fā)育至囊胚后便可按照常規(guī)方法植物母體子宮，進(jìn)行分化發(fā)育。

一、不同培養(yǎng)液的比較

我們將重組的山羊受精卵置于不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)方法均同實施例5，只是不同階段采用的培養(yǎng)液不同，設(shè)計以下幾組試驗：

a組：采用實施例1的培養(yǎng)液和實施例5的培養(yǎng)方法進(jìn)行胚胎發(fā)育培養(yǎng)。

b組：將重組好的山羊受精卵置于實施例1所述的a液中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

c組：將重組好的山羊受精卵置于實施例1所述的b液中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

d組：將重組好的山羊受精卵置于dmem高糖型液體培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

e組：將重組好的山羊受精卵置于m16液體培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)，直至克隆胚胎發(fā)育至囊胚。

f組：與a組的操作基本相同，區(qū)別僅在于將實施例1的a液中檸檬酸去除，將b液中的蘋果酸去除。

g組：與a組的操作基本相同，區(qū)別僅在于將實施例1的a液中檸檬酸去除。

h組：與a組的操作基本相同，區(qū)別僅在于將實施例1的b液中的蘋果酸去除。

觀察記錄上述分組中山羊受精卵的體外發(fā)育率。結(jié)果如表1所示。由表1的結(jié)果可知，與d組、e組兩個現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，a組獲得的二細(xì)胞胚胎數(shù)、四細(xì)胞胚胎數(shù)、桑葚胚數(shù)、囊胚數(shù)、囊胚植入母體后成活數(shù)均較高，山羊受精卵的體外發(fā)育率和囊胚植入母體后成活率總體較高；

比較a、b、c、d、e組，發(fā)現(xiàn)單獨使用a液的b組或者單獨使用b液的c組，最后獲得的囊胚數(shù)，囊胚植入母體后成活數(shù)低于a組，高于d、e組；

比較a、f、g、h組，發(fā)現(xiàn)添加檸檬酸和蘋果酸，最后獲得的囊胚數(shù)、囊胚植入母體后成活數(shù)高于不添加檸檬酸、不添加蘋果酸或者檸檬酸、蘋果酸均不添加的f、g、h組，說明檸檬酸和蘋果酸有助于提高山羊受精卵體外發(fā)育率和囊胚植入母體后成活率。

表1100個克隆胚胎在不同培養(yǎng)方法中的發(fā)育數(shù)

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。