本發(fā)明屬于領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)基底的修飾方法及使用該方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞是指生物體內(nèi)能夠進(jìn)行自我更新，并維持機(jī)體各組織細(xì)胞新陳代謝的一群細(xì)胞。同時，在生物體內(nèi)各種組織受到內(nèi)源或外源性的損害時，干細(xì)胞可以被激活執(zhí)行分化功能，從而達(dá)到修復(fù)該組織的目的。間充質(zhì)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有強(qiáng)大的增值能力和分化能力，能夠修復(fù)多種組織損傷，包括骨骼，肌肉，神經(jīng)等組織，因此，間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域引起了越來越多的重視。骨髓當(dāng)中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此得到了最為廣泛和深入的研究。研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特定的表面抗原表型，比如，CD45-，CD34-，CD29+，CD90+，CD73+和CD105+。在體外和體內(nèi)環(huán)境中可向骨骼，軟骨，神經(jīng)以及胰島等細(xì)胞分化。另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)的功能，分泌多種免疫相關(guān)信號分子，從而在免疫性疾病治療過程中發(fā)揮作用。但是，盡管骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞較易分離和培養(yǎng)，但是，骨髓來源有限，難以滿足臨床大量的需求。即便是進(jìn)行患者的自體移植，患者也必須承擔(dān)額外的痛苦。在其他組織，比如肌肉，脂肪，腦以及血液等其它組織也能分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，應(yīng)用其他組織的間充干細(xì)胞面臨著和應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相同的問題，及樣品稀缺，不足以滿足臨場需求。已經(jīng)證實(shí)，血液中含有活性很強(qiáng)的干細(xì)胞群，包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。血液中的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓干細(xì)胞相似，有著相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文獻(xiàn)表明，血液干細(xì)胞有著更原始的干細(xì)胞特性和更低的免疫原性。同時，應(yīng)用血液治療糖尿病，神經(jīng)損傷以及血管壞死等疾病也屢見報道。但是，由于血液中間充質(zhì)干細(xì)胞含量極低，如何高效分離和擴(kuò)增這些細(xì)胞成為了阻礙血液間充質(zhì)干細(xì)胞向臨床轉(zhuǎn)化的難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基底的修飾方法及使用該方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法。所述修飾方法，利用特定的高分子化學(xué)物質(zhì)而不是使用成分難以確定的細(xì)胞外基質(zhì)對培養(yǎng)容器進(jìn)行修飾，配合適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，能夠?qū)崿F(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的高效分離擴(kuò)增。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種培養(yǎng)基底的修飾方法，包括以下步驟：A、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；B、將修飾液均勻涂抹在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面；C、回收培養(yǎng)容器內(nèi)表面上修飾液中的氯仿，得到內(nèi)表面覆蓋有修飾層的培養(yǎng)容器。其中PEG為聚乙二醇，CYCLIC-RGD為環(huán)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。使用被所述修飾方法修飾過得培養(yǎng)容器，能夠能夠?qū)崿F(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的高效分離擴(kuò)增。作為一種回收氯仿的方式，步驟C中，將培養(yǎng)容器置于2-10℃的負(fù)壓下36-60小時，以完成氯仿的回收。采用低溫負(fù)壓的方式，是為了不破壞修飾液中的成分。為穩(wěn)定修飾層及整個體系的pH值，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟C后還包括步驟D、向培養(yǎng)容器內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應(yīng)10-14小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗。進(jìn)一步地，步驟D中，向培養(yǎng)容器內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應(yīng)12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續(xù)在震蕩下反應(yīng)24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟D中使用的磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8。為保證間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增的順利進(jìn)行，不被雜菌污染，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟D之后還包括步驟E、將培養(yǎng)容器使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒處理。根據(jù)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.1-0.005g時有較好的修飾效果，PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.01g時，修飾效果最好，能夠起到最好的分離擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的效果。本發(fā)明還提供了一種使用所述修飾方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法，包括以下步驟：A、將血液和同體積的α-MEM培養(yǎng)基混合，并加入濃度為3-8g/L的甲基纖維素溶液，靜置30-40分鐘，得到細(xì)胞懸液；B、取所述細(xì)胞懸液的上清液，加至相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液上，并在2500-3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心20-40min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細(xì)胞懸液；C、將所述單細(xì)胞懸液接種至經(jīng)所述修飾方法修飾過得培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。為了進(jìn)一步提高間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)效率，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟A中，向培養(yǎng)α-MEM培養(yǎng)基中添加0.5-2％的Pen-Strep，5-100ng/mL的b-FGF，5-100ng/mL的EGF和5-100ng/mL的TGF-β。其中，α-MEM為α-最小必需極限培養(yǎng)基；Pen-Strep為青霉素-鏈霉素，b-FGF為b-成纖維細(xì)胞生長因子，EGF為表皮細(xì)胞生長因子，TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基底的修飾方法及使用該方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法。所述修飾方法，利用特定的高分子化學(xué)物質(zhì)而不是使用成分難以確定的細(xì)胞外基質(zhì)對培養(yǎng)容器進(jìn)行修飾，配合適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，能夠?qū)崿F(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的高效分離擴(kuò)增。附圖說明圖1為應(yīng)用實(shí)施例6所述經(jīng)過高分子修飾基底的培養(yǎng)容器及培養(yǎng)方法分離擴(kuò)增血液中間充質(zhì)干細(xì)胞的相差顯微鏡圖片?？梢钥吹郊?xì)胞形態(tài)均一，均為紡錘形，狀態(tài)良好。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例1一種培養(yǎng)基底的修飾方法，包括以下步驟：A、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.1g；B、將修飾液均勻涂抹在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面；C、將培養(yǎng)容器置于10℃的負(fù)壓下36小時，回收培養(yǎng)容器內(nèi)表面上修飾液中的氯仿，得到內(nèi)表面覆蓋有修飾層的培養(yǎng)容器；D、向培養(yǎng)容器內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應(yīng)12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續(xù)在震蕩下反應(yīng)24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養(yǎng)容器自然干燥后使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒處理，備用。實(shí)施例2一種培養(yǎng)基底的修飾方法，包括以下步驟：B、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.005g；B、將修飾液均勻涂抹在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面；C、將培養(yǎng)容器置于2℃的負(fù)壓下60小時，回收培養(yǎng)容器內(nèi)表面上修飾液中的氯仿，得到內(nèi)表面覆蓋有修飾層的培養(yǎng)容器；D、向培養(yǎng)容器內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應(yīng)12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續(xù)在震蕩下反應(yīng)24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養(yǎng)容器自然干燥后使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒處理，備用。實(shí)施例3一種培養(yǎng)基底的修飾方法，包括以下步驟：C、將PEG和CYCLIC-RGD溶于氯仿中，得到修飾液；所述PEG和CYCLIC-RGD的比例為1mL：0.01g；B、將修飾液均勻涂抹在培養(yǎng)容器的內(nèi)表面；C、將培養(yǎng)容器置于6℃的負(fù)壓下48小時，回收培養(yǎng)容器內(nèi)表面上修飾液中的氯仿，得到內(nèi)表面覆蓋有修飾層的培養(yǎng)容器；D、向培養(yǎng)容器內(nèi)加入磷酸鹽緩沖液，在震蕩下反應(yīng)12小時，再使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，并繼續(xù)在震蕩下反應(yīng)24小時后，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為10mg/mL，pH值為8；E、將培養(yǎng)容器自然干燥后使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒處理，備用。實(shí)施例4一種使用實(shí)施例1所述修飾方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養(yǎng)基混合，向培養(yǎng)α-MEM培養(yǎng)基中添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mLb-FGF，5ng/mLEGF和100ng/mLTGF-β；得到培養(yǎng)液，并濃度為3g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養(yǎng)液的體積比為4:1；靜置40分鐘，得到細(xì)胞懸液；B、取所述細(xì)胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在2750rpm的轉(zhuǎn)速下離心40min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細(xì)胞懸液；因?yàn)镕icoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細(xì)胞重但比紅細(xì)胞輕，因此可以將單核細(xì)胞與殘留的紅細(xì)胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細(xì)胞。C、將所述單細(xì)胞懸液接種至經(jīng)所述修飾方法修飾過得培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基均勻打散收集到的細(xì)胞，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是指在添加0.5％的Pen-Strep，100ng/mL的b-FGF，5ng/mL的EGF和100ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞打散后，接種于實(shí)施例1制備的培養(yǎng)容器(細(xì)胞培養(yǎng)板)，7天后更換培養(yǎng)基，洗滌培養(yǎng)板，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每7天換液一次，直至細(xì)胞接近90％融合。將90％融合細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，接種于未經(jīng)實(shí)施例1處理過的培養(yǎng)板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天換液一次。直至融合，并進(jìn)行下一次傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。實(shí)施例5一種使用實(shí)施例2所述修飾方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養(yǎng)基混合，向培養(yǎng)α-MEM培養(yǎng)基中添加2％的Pen-Strep，5ng/mLb-FGF，100ng/mLEGF和5ng/mLTGF-β；得到培養(yǎng)液，并濃度為8g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養(yǎng)液的體積比為4:1；靜置35分鐘，得到細(xì)胞懸液；B、取所述細(xì)胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心30min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細(xì)胞懸液；因?yàn)镕icoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細(xì)胞重但比紅細(xì)胞輕，因此可以將單核細(xì)胞與殘留的紅細(xì)胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細(xì)胞。C、將所述單細(xì)胞懸液接種至經(jīng)所述修飾方法修飾過得培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基均勻打散收集到的細(xì)胞，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是指在添加2％的Pen-Strep，5ng/mL的b-FGF，100ng/mL的EGF和5ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞打散后，接種于實(shí)施例2制備的培養(yǎng)容器(細(xì)胞培養(yǎng)板)，7天后更換培養(yǎng)基，洗滌培養(yǎng)板，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每7天換液一次，直至細(xì)胞接近90％融合。將90％融合細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，接種于未經(jīng)實(shí)施例2處理過的培養(yǎng)板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天換液一次。直至融合，并進(jìn)行下一次傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。實(shí)施例6一種使用實(shí)施例3所述修飾方法的間充質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增方法，包括以下步驟：A、無菌條件下，將臍帶血和同體積的α-MEM培養(yǎng)基混合，向培養(yǎng)α-MEM培養(yǎng)基中添加1％的Pen-Strep，50ng/mLb-FGF，10ng/mLEGF和10ng/mLTGF-β；得到培養(yǎng)液，并濃度為5g/L的甲基纖維素溶液，甲基纖維素溶液與所述培養(yǎng)液的體積比為4:1；靜置30分鐘，得到細(xì)胞懸液；B、取所述細(xì)胞懸液的上清液，加入磷酸鹽緩沖液，加至相對密度為1.077的淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque上，并在2500rpm的轉(zhuǎn)速下離心20min，取界面層，加入磷酸鹽緩沖液得到單細(xì)胞懸液；因?yàn)镕icoll-Hypaque的比重為1.077g/ml，其比單核細(xì)胞重但比紅細(xì)胞輕，因此可以將單核細(xì)胞與殘留的紅細(xì)胞分離。收集界層面即可收集到比較純的單核細(xì)胞。C、將所述單細(xì)胞懸液接種至經(jīng)所述修飾方法修飾過得培養(yǎng)容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，具體方式為：隨后，使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基均勻打散收集到的細(xì)胞，臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基是指在添加1％的Pen-Strep，50ng/mL的b-FGF，10ng/mL的EGF和10ng/mL的TGF-β等生長因子的α-MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞打散后，接種于實(shí)施例3制備的培養(yǎng)容器(細(xì)胞培養(yǎng)板)，7天后更換培養(yǎng)基，洗滌培養(yǎng)板，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)使用添加10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每7天換液一次，直至細(xì)胞接近90％融合。將90％融合細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，接種于未經(jīng)實(shí)施例3處理過的培養(yǎng)板，使用10％胎牛血清的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天換液一次。直至融合，并進(jìn)行下一次傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并擴(kuò)增。實(shí)施例7本實(shí)施例FACs(流式細(xì)胞熒光分選技術(shù))對實(shí)施例6中擴(kuò)增得到的干細(xì)胞進(jìn)行表面抗原檢測，結(jié)果如表1所示。表1表面抗原檢測結(jié)果表指示劑反應(yīng)CD34-CD45-CD3-CD73+CD105+CD90+表1證實(shí)，對于實(shí)施例6所分離和培養(yǎng)的干細(xì)胞，CD34、CD45及CD3為陰性，而CD73、CD105及CD90為陽性。此結(jié)果表明實(shí)施例6所分離并擴(kuò)增的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3