本發(fā)明屬于細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，心肌梗死的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，是當(dāng)今威脅人類健康的重要疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后會(huì)有少量心肌細(xì)胞發(fā)生分裂增生，但數(shù)量有限，僅限于存活部分的心肌，不能有效修復(fù)心肌組織；大量的心肌細(xì)胞死亡后由疤痕組織代替，導(dǎo)致局部的心肌收縮減弱、紊亂，心肌功能下降，目前尚無(wú)理想的治療手段，如何增加有舒縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量成為治療心肌受損后心力衰竭的關(guān)鍵。將外源性干細(xì)胞移植入受損心肌組織的心肌細(xì)胞成形術(shù)讓我們看到了希望。通過(guò)將外源性干細(xì)胞移植到心肌受損部位，使之存活并轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞或有心肌細(xì)胞功能的細(xì)胞，代替衰竭或死亡的心肌細(xì)胞，以恢復(fù)和改善心功能，最后達(dá)到治療心血管疾病的目的。但移植外源性干細(xì)胞治療功能性心肌細(xì)胞死亡或凋亡,易導(dǎo)致移植并發(fā)癥,因此心臟本身存在的心肌祖細(xì)胞成為更理想的種子細(xì)胞。為滿足醫(yī)學(xué)研究和治療的需求，大量培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞成為重要的研究課題，心肌祖細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程很繁瑣，而且所需的培養(yǎng)試劑因子種類較多，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，如果試驗(yàn)人員選擇的用于培養(yǎng)和保存心肌祖細(xì)胞的試劑和方法不夠妥當(dāng)，往往會(huì)造成培養(yǎng)的心肌祖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量無(wú)法達(dá)到要求，浪費(fèi)了人力和其他資源，因此研究一種專門用于穩(wěn)定的大量擴(kuò)增培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒具有重要意義。目前專門用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒較少，現(xiàn)有技術(shù)中公開了一些用于培養(yǎng)其他干細(xì)胞的試劑盒，例如CN104928238A公布了一種用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，包括脂肪保存液、脂肪洗滌液、脂肪分解液、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、細(xì)胞凍存液，但此試劑盒培養(yǎng)擴(kuò)增干細(xì)胞的效果不夠理想，存在試劑安全性、穩(wěn)定性不高，細(xì)胞存活率和增殖率低等問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、果聚糖、大車前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基30-50g、所述人血白蛋白10-20g、所述果聚糖1-3g、所述大車前苷0.2-0.5g、所述苦杏仁甙0.05-0.08g。大車前苷：分子式為C29H36O16，CAS號(hào)為104777-68-6；苦杏仁甙：分子式為C20H27NO11，CAS號(hào)為29883-15-6；本發(fā)明提供的試劑盒內(nèi)的凍存液的凍存性能較好，心肌祖細(xì)胞復(fù)蘇后存活率較高，而且更利于心肌祖細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液I為DMEM/F12培養(yǎng)基溶液，所述DMEM/F12培養(yǎng)基溶液由DMEM/F12干粉培養(yǎng)基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基20-40g。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液II為H-DMEM培養(yǎng)基溶液，所述H-DMEM培養(yǎng)基溶液由H-DMEM干粉培養(yǎng)基用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述H-DMEM干粉培養(yǎng)基20-40g。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子I為bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)溶液，所述bFGF溶液由bFGF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述bFGF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子II為EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)溶液，所述EGF溶液由EGF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述EGF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子III為L(zhǎng)IF(白細(xì)胞抑制因子)溶液，所述LIF溶液由LIF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述LIF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述生長(zhǎng)因子IV為VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)溶液，所述VEGF溶液由VEGF凍干粉用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述VEGF凍干粉0.1-0.2mg。優(yōu)選的，所述消化液為含1％胰酶的PBS緩沖液。優(yōu)選的，所述清洗液為PBS緩沖液。上述PBS緩沖液均為含0.05％吐溫-20，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述細(xì)胞種子為心肌祖細(xì)胞原代細(xì)胞。優(yōu)選的，所述心肌祖細(xì)胞原代細(xì)胞分離自流產(chǎn)胚胎心臟組織。進(jìn)一步的，所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯0.6-1.3g、所述甘氨酸鈉0.4-0.8g、所述葡萄糖酸內(nèi)酯0.1-0.3g。在凍存液中加入海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯可以顯著提高凍存液的穩(wěn)定性，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，凍存液的穩(wěn)定性下降。進(jìn)一步的，所述凍存液中還含有二硫代甘醇酸和甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.3-0.5g、所述甲酸鈉0.08-0.2g。在凍存液中加入二硫代甘醇酸和甲酸鈉可以提高凍存液的抗菌能力，有效抑制凍存液中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障凍存液的使用安全。進(jìn)一步的，所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量份數(shù)的各成分：本發(fā)明提供的培養(yǎng)基添加劑可以提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力，提高心肌祖細(xì)胞的培養(yǎng)增殖速度。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量份數(shù)的各成分：葛根素0.5-1維生素E0.2-0.6。葛根素：分子式為C21H20O9，CAS號(hào)為3681-99-0；在培養(yǎng)基添加劑中加入葛根素和維生素E有利于進(jìn)一步提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量份數(shù)的各成分：酒石酸鉀鈉0.8-1聚乙烯醇0.1-0.3。在培養(yǎng)基添加劑中加入酒石酸鉀鈉和聚乙烯醇可以顯著提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，避免完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀、分層和變色等問(wèn)題，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性下降。進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量份數(shù)的各成分：谷胱甘肽0.3-0.7對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1-0.2。在培養(yǎng)基添加劑中加入谷胱甘肽和對(duì)羥基苯甲酸甲酯可以有效提高采用其配制的完全培養(yǎng)基防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制完全培養(yǎng)基中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障完全培養(yǎng)基的使用安全，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，都會(huì)導(dǎo)致全培養(yǎng)基抗菌能力減弱。本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟：S1.將培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV按照重量份數(shù)比為3：3：1：1：1：1的比例混合均勻，配置成為完全培養(yǎng)基放置在4℃的冰箱中保存；S2.將細(xì)胞種子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的條件下離心5min，然后收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基重懸，再按照1-2×106個(gè)/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％C02的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞；S3.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到85-95％時(shí)，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化1-2min，最后加入預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將獲得的細(xì)胞按照1:3的比例傳代；S4.重復(fù)S3步驟1次，然后在4℃、1000rpm的條件下離心5min，重復(fù)離心2遍，然后收集細(xì)胞放入凍存液中進(jìn)行凍存，凍存密度為1-2×107個(gè)/ml凍存液。進(jìn)一步的，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞的過(guò)程中，如果經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)面積未達(dá)到50％，則更換1次完全培養(yǎng)基。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞種子的制備包括：從流產(chǎn)胚胎上采取心臟組織，倒入清洗液清洗后用眼科剪剪成1-2mm3大小的組織碎塊；將組織碎塊加入含1％膠原酶I型的PBS緩沖液中，水浴震蕩，每3min震蕩一次，震蕩5次后加入完全培養(yǎng)基終止分解；然后進(jìn)行反復(fù)吹打，混勻細(xì)胞漿，用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾后收集懸液；將懸液離心后棄去上清液，即可獲得細(xì)胞種子。本發(fā)明提供的試劑盒可以培養(yǎng)擴(kuò)增心肌祖細(xì)胞并進(jìn)行冷凍保存，解決了心肌祖細(xì)胞培養(yǎng)存活率低、培養(yǎng)效率不高、培養(yǎng)批次間差別大、凍存復(fù)活率不理想等問(wèn)題，使心肌祖細(xì)胞在理想營(yíng)養(yǎng)平衡狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增而不發(fā)生分化，為利用心肌祖細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和醫(yī)學(xué)治療提供了豐富的來(lái)源，非常適用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、果聚糖、大車前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基30g、所述人血白蛋白10g、所述果聚糖1g、所述大車前苷0.2g、所述苦杏仁甙0.05g。實(shí)施例2一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、果聚糖、大車前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基50g、所述人血白蛋白20g、所述果聚糖3g、所述大車前苷0.5g、所述苦杏仁甙0.08g。實(shí)施例3一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、果聚糖、大車前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述人血白蛋白12g、所述果聚糖2g、所述大車前苷0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。實(shí)施例4一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例1不同的是：所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯0.6g、所述甘氨酸鈉0.4g、所述葡萄糖酸內(nèi)酯0.1g。實(shí)施例5一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例2不同的是：所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1.3g、所述甘氨酸鈉0.8g、所述葡萄糖酸內(nèi)酯0.3g。實(shí)施例6一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述甘氨酸鈉0.5g、所述葡萄糖酸內(nèi)酯0.2g。實(shí)施例7一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例1不同的是：所述凍存液中還含有二硫代甘醇酸和甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.3g、所述甲酸鈉0.08g。實(shí)施例8一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例5不同的是：所述凍存液中還含有二硫代甘醇酸和甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.5g、所述甲酸鈉0.2g。實(shí)施例9一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有二硫代甘醇酸和甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.4g、所述甲酸鈉0.1g。實(shí)施例10一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例1不同的是：所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例11一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例8不同的是：所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例12一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：實(shí)施例13一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例10不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：葛根素0.5g維生素E0.2g。實(shí)施例14一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例11不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：葛根素1g維生素E0.6g。實(shí)施例15一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：葛根素0.8g維生素E0.5g。實(shí)施例16一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例10不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：酒石酸鉀鈉0.8g聚乙烯醇0.1g。實(shí)施例17一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例14不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：酒石酸鉀鈉1g聚乙烯醇0.3g。實(shí)施例18一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：酒石酸鉀鈉0.9g聚乙烯醇0.2g。實(shí)施例19一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例10不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：谷胱甘肽0.3g對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.1g。實(shí)施例20一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例17不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：谷胱甘肽0.7g對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.2g。實(shí)施例21一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：谷胱甘肽0.5g對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.15g。實(shí)施例22一種培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟：S1.將培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV按照重量份數(shù)比為3：3：1：1：1：1的比例混合均勻，配置成為完全培養(yǎng)基放置在4℃的冰箱中保存；S2.將細(xì)胞種子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的條件下離心5min，然后收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基重懸，再按照1×106個(gè)/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％C02的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞；S3.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到85％時(shí)，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化1min，最后加入預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將獲得的細(xì)胞按照1:3的比例傳代；S4.重復(fù)S3步驟1次，然后在4℃、1000rpm的條件下離心5min，重復(fù)離心2遍，然后收集細(xì)胞放入凍存液中進(jìn)行凍存，凍存密度為1×107個(gè)/ml凍存液。實(shí)施例23一種培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的方法，包括如下步驟：S1.將培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV按照重量份數(shù)比為3：3：1：1：1：1的比例混合均勻，配置成為完全培養(yǎng)基放置在4℃的冰箱中保存；S2.從流產(chǎn)胚胎上采取心臟組織，倒入清洗液清洗后用眼科剪剪成1-2mm3大小的組織碎塊；將組織碎塊加入含1％膠原酶I型的PBS緩沖液中，水浴震蕩，每3min震蕩一次，震蕩5次后加入完全培養(yǎng)基終止分解；然后進(jìn)行反復(fù)吹打，混勻細(xì)胞漿，用300目的細(xì)胞篩過(guò)濾后收集懸液；將懸液離心后棄去上清液，即可獲得細(xì)胞種子；S3.將細(xì)胞種子加入清洗液中，在4℃、1000rpm的條件下離心5min，然后收集細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基重懸，再按照1.5×106個(gè)/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％C02的環(huán)境中，用標(biāo)準(zhǔn)的孵化器孵化細(xì)胞，如果經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)面積未達(dá)到50％，則更換1次完全培養(yǎng)基；S4.當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)到90％時(shí)，先用清洗液清洗2次，然后加入5％的消化液，適當(dāng)震蕩搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液與細(xì)胞充分接觸，再放入培養(yǎng)箱中消化1.5min，最后加入預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將獲得的細(xì)胞按照1:3的比例傳代；S5.重復(fù)S3步驟1次，然后在4℃、1000rpm的條件下離心5min，重復(fù)離心2遍，然后收集細(xì)胞放入凍存液中進(jìn)行凍存，凍存密度為1.5×107個(gè)/ml凍存液。對(duì)照例1一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、大車前苷、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述人血白蛋白12g、所述大車前苷0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。對(duì)照例2一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，其內(nèi)設(shè)有若干試劑瓶，若干所述試劑瓶?jī)?nèi)分別盛裝有培養(yǎng)液I、培養(yǎng)液II、生長(zhǎng)因子I、生長(zhǎng)因子II、生長(zhǎng)因子III、生長(zhǎng)因子IV、消化液、清洗液、凍存液和細(xì)胞種子，所述凍存液主要是將DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、人血白蛋白、果聚糖、蒲公英提取物、苦杏仁甙用注射用水溶解而成，每L所述注射用水溶解所述DMEM/F12干粉培養(yǎng)基40g、所述人血白蛋白12g、所述果聚糖2g、所述蒲公英提取物0.4g、所述苦杏仁甙0.06g。對(duì)照例3一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯和葡萄糖酸內(nèi)酯，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述葡萄糖酸內(nèi)酯0.2g。對(duì)照例4一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和次磷酸鈉，每L所述注射用水溶解所述海藻酸丙二醇酯1g、所述甘氨酸鈉0.5g、所述次磷酸鈉0.2g。對(duì)照例5一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述甲酸鈉0.1g。對(duì)照例6一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述凍存液中還含有二硫代甘醇酸和苯甲酸鈉，每L所述注射用水溶解所述二硫代甘醇酸0.4g、所述苯甲酸鈉0.1g。對(duì)照例7一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：羥丙基纖維素9g亮氨酸4g乙基香草醛。0.8g。對(duì)照例8一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例3不同的是：所述試劑瓶?jī)?nèi)還盛裝有培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)基添加劑包括如下重量的各成分：對(duì)照例9一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括0.8g的葛根素。對(duì)照例10一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：甘草提取物0.8g維生素E0.5g。對(duì)照例11一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括0.9g的酒石酸鉀鈉。對(duì)照例12一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：酒石酸鉀鈉0.9g甲殼素0.2g。對(duì)照例13一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括0.5g的谷胱甘肽。對(duì)照例14一種用于培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的試劑盒，與實(shí)施例12不同的是：所述培養(yǎng)基添加劑中還包括如下重量的各成分：木糖醇0.5g對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.15g。凍存液對(duì)心肌祖細(xì)胞凍存性能的影響評(píng)價(jià)將心肌祖細(xì)胞分別加入1.5mL實(shí)施例3、對(duì)照例1和對(duì)照例2提供的的凍存液和CN104928238A提供的的細(xì)胞凍存液重懸后加入2mL細(xì)胞凍存管中，并控制細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)/mL；迅速將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的細(xì)胞程序降溫盒中，放入-80℃超低溫冰箱2～3天后，將細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存；一個(gè)月后進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將保存于液氮中的細(xì)胞凍存管取出，轉(zhuǎn)移至37℃水浴鍋中迅速解凍，用移液管將細(xì)胞轉(zhuǎn)入之前預(yù)溫好的10mL按照實(shí)施例22的方法配置的完全培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻后，取0.5mL細(xì)胞懸液檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。表1凍存液對(duì)心肌祖細(xì)胞凍存性能的影響組別細(xì)胞存活率(％)細(xì)胞形態(tài)變化實(shí)施例397.6幾乎不變對(duì)照例179.7輕微形態(tài)變化對(duì)照例283.1輕微形態(tài)變化CN104928238A69.8輕微形態(tài)變化將實(shí)施例3提供的凍存液的凍存性能與對(duì)照例1、對(duì)照例2提供的的凍存液和CN104928238A提供的細(xì)胞凍存液的凍存性能相比，可以得出本發(fā)明提供的凍存液的凍存性能相對(duì)更好，心肌祖細(xì)胞復(fù)蘇后存活率較高，而且更利于心肌祖細(xì)胞凍存前后細(xì)胞形態(tài)的維持和穩(wěn)定。凍存液穩(wěn)定性評(píng)價(jià)1.加速試驗(yàn)取實(shí)施例3、實(shí)施例6、對(duì)照例3和對(duì)照例4提供的凍存液，均在溫度40℃±2℃下，相對(duì)濕度為75％±5％的條件下放置6個(gè)月，在試驗(yàn)期間1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)凍存液的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例6提供的凍存液的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而實(shí)施例3、對(duì)照例3和對(duì)照例4提供的凍存液出現(xiàn)少量沉淀，并且顏色變深。2.長(zhǎng)期試驗(yàn)取實(shí)施例3、實(shí)施例6、對(duì)照例3和對(duì)照例4提供的凍存液，均在溫度25℃±2℃下，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下放置12個(gè)月，在試驗(yàn)期間0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)凍存液的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例6提供的凍存液的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而實(shí)施例3、對(duì)照例3和對(duì)照例4提供的凍存液出現(xiàn)沉淀和顏色變深的現(xiàn)象。從上述加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)的結(jié)果可知，在凍存液中加入海藻酸丙二醇酯、甘氨酸鈉和葡萄糖酸內(nèi)酯可以顯著提高凍存液的穩(wěn)定性，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，凍存液的穩(wěn)定性下降。凍存液安全性評(píng)價(jià)分別取實(shí)施例3、實(shí)施例9、對(duì)照例5和對(duì)照例6提供的凍存液，均在溫度為25℃±2℃，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個(gè)月，檢測(cè)凍存液中的細(xì)菌總數(shù)。表2凍存液中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)實(shí)施例3實(shí)施例9對(duì)照例5對(duì)照例6細(xì)菌總數(shù)(cfu/mL)801101789764由上述結(jié)果可知，在凍存液中加入二硫代甘醇酸和甲酸鈉可以提高凍存液的抗菌能力，有效抑制凍存液中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障凍存液的使用安全。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基增殖能力的影響分析將實(shí)施例12、實(shí)施例15、對(duì)照例7-10提供的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例22的方法配置全培養(yǎng)基，再將上述全培養(yǎng)基分別按照實(shí)施例22的方法培養(yǎng)擴(kuò)增心肌祖細(xì)胞，采用臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)原代和第3代活心肌祖細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果見表3。表3心肌祖細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增效果評(píng)價(jià)由上述結(jié)果可以得出，采用實(shí)施例12提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的增殖速度明顯高于CN104928238A的細(xì)胞培養(yǎng)液，也優(yōu)于采用對(duì)照例7和對(duì)照例8的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基，說(shuō)明本發(fā)明提供的培養(yǎng)基添加劑可以提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力。采用實(shí)施例15提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的增殖速度比采用實(shí)施例12、對(duì)照例9、對(duì)照例10提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞的增殖速度更佳，說(shuō)明在培養(yǎng)基添加劑中加入葛根素和維生素E有利于提高采用其配置的完全培養(yǎng)基的增殖能力。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基穩(wěn)定性的影響分析取實(shí)施例12、實(shí)施例18、對(duì)照例11、對(duì)照例12的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例22的方法在無(wú)菌條件下配置完全培養(yǎng)基，對(duì)上述完全培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定性的加速試驗(yàn)和常溫試驗(yàn)：1.加速試驗(yàn)將上述完全培養(yǎng)基均在溫度40℃±2℃下，相對(duì)濕度為75％±5％的條件下放置6個(gè)月，在試驗(yàn)期間1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)完全培養(yǎng)基的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采取實(shí)施例12提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而采取實(shí)施例18、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基顏色變深，并且出現(xiàn)少量沉淀。2.長(zhǎng)期試驗(yàn)將上述完全培養(yǎng)基均在溫度25℃±2℃下，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下放置12個(gè)月，在試驗(yàn)期間0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月末分別取樣一次，檢測(cè)完全培養(yǎng)基的性狀、色澤和氣味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采取實(shí)施例12提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化；而采取實(shí)施例18、對(duì)照例11和對(duì)照例12提供的培養(yǎng)基添加劑配置的完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀和顏色變深的現(xiàn)象。從上述加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)的結(jié)果可知，在培養(yǎng)基添加劑中加入酒石酸鉀鈉和聚乙烯醇可以顯著提高完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，避免完全培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀、分層和變色等問(wèn)題，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，完全培養(yǎng)基的穩(wěn)定性下降。培養(yǎng)基添加劑對(duì)完全培養(yǎng)基安全性的影響分析取實(shí)施例12、實(shí)施例21、對(duì)照例13、對(duì)照例14的培養(yǎng)基添加劑分別按照實(shí)施例22的方法在無(wú)菌條件下配置完全培養(yǎng)基，將上述完全培養(yǎng)基均在溫度為25℃±2℃，相對(duì)濕度為60％±10％的條件下密閉保存12個(gè)月，然后檢測(cè)完全培養(yǎng)基中的細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果如表4所示。表4完全培養(yǎng)基中細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)實(shí)施例12實(shí)施例21對(duì)照例13對(duì)照例14細(xì)菌總數(shù)(cfu/mL)59725571546由上述結(jié)果可知，在培養(yǎng)基添加劑中加入谷胱甘肽和對(duì)羥基苯甲酸甲酯可以有效提高完全培養(yǎng)基防止細(xì)菌感染的能力，有效抑制完全培養(yǎng)基中細(xì)菌的滋生和繁殖，保障完全培養(yǎng)基的使用安全，減少其中一個(gè)成分，或變化其中一個(gè)成分，都會(huì)導(dǎo)致全培養(yǎng)基抗菌能力減弱。最后應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3