本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)方法以其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：鷓鴣茶[Mallotuspeltatus(Geiseler)MullerArgoviensis]也叫山苦茶、毛茶和禾姑茶，系大戟科野桐屬植物。鷓鴣茶在海南島主要分布在文昌、萬寧和陵水，也在三亞、樂東、白沙、定安、東方、瓊中、保亭和昌江等地有分布，其中以文昌銅鼓嶺和萬寧東山嶺的出產(chǎn)的鷓鴣茶最為有名。此外，在我國廣東、云南、廣西，以及中印半島和蘇門答臘島也有野生分布。鷓鴣茶葉圓味甘，是一種奇特的野生茶葉，其葉片等植物體干燥后具有濃郁的零陵香氣；沖泡飲用時(shí)別具風(fēng)味、甘冽爽口，被歷代文人墨客譽(yù)為"靈芝草"。鷓鴣茶是海南具有濃郁地方和民族特色的代茶飲料植物，已成為海南地方茶的一大文化特色。鷓鴣茶具有顯著的保健作用和藥用功效，是海南重要的民間中藥材，利用歷史悠久。鷓鴣茶的提取物中富含茶多糖、茶多酚、沒食子酸和多酚類等多種有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鷓鴣茶中的有效成分具有清除氧自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)膽汁分泌、抑制病菌活性、抗疲勞衰老與鎮(zhèn)靜止痛等功效。另外，作為重要的中藥材，海南民間用鷓鴣茶的根治療牙痛有良好的效果。目前，鷓鴣茶資源的開發(fā)利用尚停留在利用野生資源的水平上，產(chǎn)業(yè)發(fā)展所需的鷓鴣茶人工規(guī)模種植和配套栽培技術(shù)尚處于空白。亦今為止，海南島內(nèi)外或國內(nèi)外尚沒有建立鷓鴣茶產(chǎn)品商業(yè)化生產(chǎn)的大規(guī)模種植基地，幾乎所有市場上流通的鷓鴣茶產(chǎn)品均是直接從野生植物上獲取。除了個(gè)別農(nóng)戶有零星的庭院式種植外，制作鷓鴣茶產(chǎn)品所需的原材料幾乎全部依賴掠奪式地從野生植株上獲取葉片。受到經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，目前鷓鴣茶野生資源已經(jīng)逐年減少。由于鷓鴣茶的市場需求量較大，且隨著“海南國際旅游島”的發(fā)展，鷓鴣茶原葉的需求量也將會急劇增加。鷓鴣茶是雌雄異株植物，在自然居群中以雄株多而雌株少為普遍現(xiàn)象。自然授粉條件下，鷓鴣茶的平均結(jié)實(shí)率(成熟種子/雌花數(shù))不足5％，因此，行業(yè)內(nèi)將目光轉(zhuǎn)向組織培養(yǎng)，但是鷓鴣茶的組織培養(yǎng)一直是行業(yè)內(nèi)的瓶頸，因?yàn)橥庵搀w培養(yǎng)極易發(fā)生褐變，而無法取得愈傷材料。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基以及采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的方法，愈傷率高，填補(bǔ)了鷓鴣茶組織培養(yǎng)的空白。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種用于培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有兩種激素組分，第一激素組分為萘乙酸，其含量以所述培養(yǎng)基為基準(zhǔn)為0.1-0.5mg/L，第二激素組分為激動(dòng)素、2,4-D或6-芐氨基腺嘌呤，其以所述培養(yǎng)基為基準(zhǔn)含量為0.5-1.5mg/L。優(yōu)選地，第一激素組分為萘乙酸，其含量為0.3-0.5mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，第一激素組分為萘乙酸，其含量為0.3mg/L。優(yōu)選地，第二激素組分含量為1-1.5mg/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，第二激素組分為2,4-D，其含量為1mg/L；或者第二激素組分為激動(dòng)素，其含量為1.5mg/L；或者第二激素組分為6-芐氨基腺嘌呤，其含量為1.5mg/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加所述兩種激素。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還添加蔗糖。蔗糖作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源外，并維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)酌量添加，本發(fā)明對蔗糖在培養(yǎng)基中的含量不作特別限定。一般地，蔗糖在培養(yǎng)基中的含量為20-40g/L，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，其含量為30g/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還添加瓊脂。瓊脂作為凝固劑來將液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)酌量添加使液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基即可，本發(fā)明對瓊脂在培養(yǎng)基中的含量不作特別限定。一般地，瓊脂在培養(yǎng)基中的含量為5-10g/L，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，其含量為7.5g/L的蔗糖。其中，所述培養(yǎng)基的pH值5.8-6.2。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)方法，取健壯鷓鴣茶無菌苗剛出芽的胚軸，切成小段，接種于本發(fā)明第一個(gè)方面所述的任意一種培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。本申請發(fā)明人為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，反復(fù)摸索，成功獲得可高效培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織的培養(yǎng)基，采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)鷓鴣茶愈傷組織，愈傷率高，填補(bǔ)了鷓鴣茶組織培養(yǎng)的空白。附圖說明圖1為本發(fā)明培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果，其中，A為實(shí)施例5的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果,B為實(shí)施例15的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果，C為實(shí)施例24的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果。圖2為實(shí)施例24的培養(yǎng)基對胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)生長過程，A為培養(yǎng)15天的愈傷生長狀態(tài)，B為培養(yǎng)30天的愈傷生長狀態(tài)，C為培養(yǎng)45天的愈傷生長狀態(tài)，D為培養(yǎng)60天的愈傷生長狀態(tài)。具體實(shí)施方式下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例1-9(培養(yǎng)基)實(shí)施例1-9均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和2,4-D，每個(gè)實(shí)施例中NAA和2,4-D添加量如表1所示。實(shí)施例10-18(培養(yǎng)基)實(shí)施例10-18均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和KT(激動(dòng)素)，每個(gè)實(shí)施例中NAA和KT添加量如表2所示。實(shí)施例19-27(培養(yǎng)基)實(shí)施例19-27均采用MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8-6.2，其中加入30g/L蔗糖和7.5g/L瓊脂，并加入激素NAA(萘乙酸)和6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)，每個(gè)實(shí)施例中NAA和6-BA添加量如表3所示。試驗(yàn)方法1、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本次試驗(yàn)采用實(shí)施例1-27的培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度30-40μmol/m·s。2、無菌苗獲得將鷓鴣茶的成熟種子用流水沖洗3h，70％酒精消毒5min，去除種皮至于無菌水中，在超凈工作臺中用40％過氧化氫進(jìn)行消毒處理10min，無菌水沖洗3次，將無菌材料接于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40d后即可獲得鷓鴣茶無菌苗。3、胚軸愈傷組織的誘導(dǎo)選取長勢良好一致的鷓鴣茶無菌苗，取其剛出芽的胚軸，將胚軸切成1cm長的小段，接種于實(shí)施例1-27的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理接種60個(gè)胚軸，重復(fù)3次。30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織平均誘導(dǎo)率和愈傷組織長勢。4、數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。5、結(jié)果與分析5.1不同NAA和2,4-D濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響在不同NAA和2,4-D濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)影響的實(shí)驗(yàn)中，通過添加不同濃度的NAA和2,4-D能夠有效的誘導(dǎo)出愈傷組織。通過試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，實(shí)施例1-9均能夠有效的進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，其中出愈傷總數(shù)在22-57個(gè)之間，平均出愈傷率在0.37-0.95之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為實(shí)施例5(MS+0.3mg/LNAA+1mg/L2,4-D)(圖1A)，出愈傷總數(shù)可以達(dá)到57個(gè)，平均出愈傷率可以達(dá)到0.95。表1不同NAA和24-D濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響NAA(mg/L)2,4-D(mg/L)接種總數(shù)(個(gè))出愈傷總數(shù)(個(gè))平均出愈傷率實(shí)施例10.10.560240.4實(shí)施例20.1160310.52實(shí)施例30.11.560220.37實(shí)施例40.30.560450.75實(shí)施例50.3160570.95實(shí)施例60.31.560470.78實(shí)施例70.50.560450.75實(shí)施例80.5160350.58實(shí)施例90.51.560230.385.2不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響在不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)影響的實(shí)驗(yàn)中，通過添加不同濃度的NAA和KT能夠有效的誘導(dǎo)出愈傷組織。通過試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，實(shí)施例10-18均能夠有效的進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，同時(shí)各組試驗(yàn)具有顯著影響，其中出愈傷總數(shù)在21-59個(gè)之間，平均出愈傷率在0.35-0.98之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為實(shí)施例15(MS+0.3mg、LNAA+1.5mg/LKT)(圖1B)，出愈傷總數(shù)可以達(dá)到59個(gè)，平均出愈傷率可以達(dá)到0.98。表2不同NAA和KT濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響NAA(mg/L)KT(mg/L)接種總數(shù)(個(gè))出愈傷總數(shù)(個(gè))平均出愈傷率實(shí)施例100.10.560210.35實(shí)施例110.1160350.58實(shí)施例120.11.560260.43實(shí)施例130.30.560430.72實(shí)施例140.3160540.9實(shí)施例150.31.560590.98實(shí)施例160.50.560410.68實(shí)施例170.5160380.63實(shí)施例180.51.560340.572.3不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響在不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)影響的實(shí)驗(yàn)中，通過添加不同濃度的NAA和6-BA能夠有效的誘導(dǎo)出愈傷組織。通過試驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，實(shí)施例19-27均能夠有效的進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，同時(shí)各組試驗(yàn)具有顯著影響，其中出愈傷總數(shù)在34-59個(gè)之間，平均出愈傷率在0.57-0.98之間。綜合考慮胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為實(shí)施例24(MS+0.3mg/LNAA+1.5mg/L6-BA)(圖1C和圖2)，出愈傷總數(shù)可以達(dá)到59個(gè)，平均出愈傷率可以達(dá)到0.98。表3不同NAA和6-BA濃度對胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3