本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

植物是藥物的天然寶庫，人類利用藥用植物來防病治病已有幾千年歷史。植物合成和積累的次生代謝物被廣泛應(yīng)用于藥品、食品和化妝品等行業(yè)。我國是世界上藥用植物資源最豐富的國家之一，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，國內(nèi)、外對中藥資源的需求在迅速增加，我國每年也有大量來源于藥用植物的提取物出口到世界各地，這些都加速著我國中藥資源的消耗，給瀕危的藥用植物資源帶來毀滅性的危害(陳士林&肖培根，2006；高文遠(yuǎn)&肖培根，2008)。工業(yè)化加上城市化也不斷地增加自然資源的壓力。由于生態(tài)環(huán)境的破壞和掠奪式的過度采收，致使很多中藥資源蘊含量下降，甚至耗竭，一些種類瀕臨滅絕(黃璐琦，2001)。生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)提供了一個嶄新的方法。在快速繁殖、保護(hù)和增強有用的次級代謝物的水平以滿足藥物的需求并減少原位采收自然資源方面，植物組織培養(yǎng)技術(shù)擁有巨大的潛力(Bapat等，2008)。

黃精葉鉤吻屬(Croomia)植物是百部科(Stemonaceae)多年生草本植物，花部4基數(shù)，屬單子葉植物網(wǎng)狀脈類群。該屬僅6個種，4種(C.heterosepala,C.hyugaensis,C.saitoana和C.kinoshitae)為日本特有(Kato&Ebihara,2011；Kadota,2010，2012)，1種(C.japonica)為中國和日本分布，1種(C.pauciflora)為美國特有。該屬植物的總體分布呈古老的東亞-北美間斷分布，在亞洲又呈現(xiàn)為中國大陸-日本島嶼的分布格局。該屬植物的染色體研究表明該屬的3個種(C.heterosepala，C.japonica和C.pauciflora)染色體數(shù)目都是2n＝24(Duyfjes,1991；Oginuma等,2001)，但也有研究指出黃精葉鉤吻(C.japonica)的染色體數(shù)目為2n＝26(李林初，1986)。李恩香(2006)的研究表明該屬植物的繁育系統(tǒng)為自交可育的混合交配系統(tǒng)。葉綠體DNA(trnL一F)的研究表明：東亞的兩個種是姐妹類群，分歧時間是在更新世中晚期；東亞種與美國種的分歧時間是在上新世晚期到更新世早期(Li等，2008)。方明(2012)基于SSR分子標(biāo)記和單拷貝核基因Agtl序列研究表明黃精葉鉤吻是祖先種，并由它衍生出了日本的C.heterosepala和北美的C.pauciflora。中國的天目山可能是該屬植物的分布及起源中心。

黃精葉鉤吻屬植物是一類種群較小且區(qū)域化分布的種，種群的繁殖和散布主要依賴根莖的無性繁殖。由于根莖的活動非常有限，使該屬植物成為易受干擾、易瀕危的植物(Tomlinson和Ayensu,1968)。因此，該屬植物在中國、日本和美國都被列為稀有瀕危植物名錄(傅立國，1992；Estill&Cruzan,2001；Chafin，2007；Kato&Ebihara,2011)。

黃精葉鉤吻，又名金剛大，分布于我國浙江、安徽、江西、福建和日本。該植物的根狀莖是民間常用的藥物，具有祛風(fēng)解毒、治跌打損、毒蛇咬傷等功效(浙江植物志，1994)。林文翰等(1993)對金剛大的根部和莖葉的化學(xué)成分的研究表明其主要成分為金剛大堿(Croomine)和脫氫金剛大堿((didehydrocroomine)，另外根部還有粉蕊黃楊胺A(pachysamine A)和金剛大啶(Croomionidine)兩個甾體生物堿和β-谷甾醇。。

黃精葉鉤吻種群間遺傳分化高，而種群內(nèi)的遺傳多樣性低(li等，2008)，同時由于種群較小、受人類活動影響嚴(yán)重的，因此亟待保護(hù)。由于該種植物的結(jié)實率較低，因此通過種子發(fā)芽的繁殖方式有限，通過根莖的繁殖是其野外繁殖的主要方式，但該方法也很有限。因此，發(fā)展和利用離體快繁的方法勢在必行。為了保護(hù)野生的黃精葉鉤吻資源，同時又能滿足醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用，因此有必要建立黃精葉鉤吻的離體再生體系，這對豐富植物組織培養(yǎng)的理論和應(yīng)用生物技術(shù)保護(hù)種質(zhì)資源以及滿足臨床應(yīng)用等均有重要意義。

迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于黃精葉鉤吻組織培養(yǎng)方面的研究還是有限的和初步的，僅僅是利用黃精葉鉤吻的莖段誘導(dǎo)出愈傷組織和防止愈傷組織褐化的研究(李溫平等，2012；陳貝貝等，2012)，未見愈傷組織成功分化出試管苗的報道。

涉及的參考文獻(xiàn)具體如下：

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文中所提及的縮寫字母的以及見如下縮略詞表：

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法，采用本發(fā)明的方法可以短時間內(nèi)快速培育出大量試管苗。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法，包括以下步驟：

1)、取材：

選用黃精葉鉤吻的根狀莖的不定芽作為外植體；

2)、不定芽的消毒：

將步驟1)所得的根狀莖上的不定芽充分洗滌(先用自來水加入微量的洗潔精進(jìn)行洗滌，接著置于塑料網(wǎng)袋中流水沖洗10～15min)，然后在超凈臺上操作，先用75％(體積％)酒精浸泡處理20～30sec，無菌水沖洗后，用含0.1％(質(zhì)量％)升汞滅菌8～10min，無菌水沖洗3～5次；

3)、不定芽的啟動培養(yǎng)：

將消毒后的不定芽(步驟2)所得)剝離外圍的葉片(于超凈臺中進(jìn)行)后接種到啟動培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽生長及叢生芽的誘導(dǎo)；

所述啟動培養(yǎng)基為MS+BA0.6～3mg/L+NAA0～0.2mg/L+蔗糖20～30g/l+瓊脂5～8g/l，pH為5.6～5.8；

誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30～45μmolm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

當(dāng)啟動培養(yǎng)基上的不定芽的基部出現(xiàn)至少3個叢生芽(即，不定芽突起)時，結(jié)束啟動培養(yǎng)(培養(yǎng)時間約2～2.5個月)；

上述啟動培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入BA、NAA、蔗糖、瓊脂，均勻混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為5.6～5.8；每1L的MS基本培養(yǎng)基加入0.6～3mg的BA、0～0.2mg的NAA，20～30g蔗糖，5～8g瓊脂；

4)、不定芽的快速擴(kuò)增：

將步驟3)所得的叢生芽分割成含1新芽(新芽的基部有2～3個突起)的芽叢后轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.6～3mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+KT 0～1.0mg/L+2,4-D 0～0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30～45μmolm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

待增殖培養(yǎng)基上的新芽至少長出3個叢生芽時(約培養(yǎng)35～42天)，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)；

上述增殖培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入BA、NAA、KT、2,4-D、PVP、蔗糖、瓊脂；均勻混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為5.6～5.8；每1L的MS基本培養(yǎng)基加入0.6～3mg的BA、0.2～0.5mg的NAA、0～1.0mg的KT、0～0.5mg的2,4-D，0.8g的PVP，20～30g蔗糖，5～8g瓊脂。

5)、不定芽的伸長及生根培養(yǎng)：

將步驟4)所得的叢生芽切割成含2～3株為一叢的不定芽叢轉(zhuǎn)移到生根/伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(即，從而實現(xiàn)既能伸長生長、同時又能生根)，生根/伸長培養(yǎng)基為MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30～45μmoLm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為20±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

當(dāng)不定芽叢長到4.0～6.0cm高、且基部有至少5條根(5～10條根)時，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)；

該生根/伸長培養(yǎng)基的制作方法具體如下：以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入BA、NAA、PVP，蔗糖、瓊脂，均勻混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為5.6～5.8；每1L的MS基本培養(yǎng)基加入0.6mg的BA、0.5mg的NAA、0.8g的PVP，20～30g蔗糖，5～8g瓊脂。

6)、將步驟5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶種植的種苗。

該種苗栽培于河沙：泥炭土為1:1的混合基質(zhì)上。

作為本發(fā)明的黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法的改進(jìn)：

以步驟4)所得的叢生芽替代步驟3)所得的叢生芽，重復(fù)進(jìn)行步驟4)的不定芽的快速擴(kuò)增；待增殖培養(yǎng)基上的新芽長出至少3個叢生芽時，將其進(jìn)行分割。

備注說明：新的叢生芽的數(shù)目一般5～9個不等。

作為本發(fā)明的黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟5)為：

將不定芽叢轉(zhuǎn)移到生根/伸長培養(yǎng)基上，經(jīng)過28～35天的培養(yǎng)，不定芽既能伸長生長，同時在植株的基部產(chǎn)生根，7～14天可誘導(dǎo)形成根，再培養(yǎng)后形成發(fā)達(dá)的根系。

作為本發(fā)明的黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

將步驟6)所得的裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，放置1～2天后，將植株基部的生根/伸長培養(yǎng)基(特指該生根/伸長培養(yǎng)基內(nèi)的瓊脂)洗凈，將苗移栽到河沙：泥炭土為1：1(重量比)的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始的10～14天溫度為23～25℃，相對濕度為70～80％。

作為本發(fā)明的黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

作為較佳方案：

啟動培養(yǎng)基為：MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

增殖培養(yǎng)基為以下任意一種：

MS+BA0.6mg/L+NAA 0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

MS+BA2mg/L+NAA 0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8；

MS+BA2mg/L+KT 1mg/L+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+瓊脂5～8g/L，pH為5.6～5.8。

在本發(fā)明中，照明燈可采用全光譜T5節(jié)能燈。

使用本發(fā)明的方法，將黃精葉鉤吻根狀莖的不定芽消毒、接種培養(yǎng)60～75天可誘導(dǎo)形成叢生芽，在此基礎(chǔ)上繼代培養(yǎng)，叢生芽可大量繁殖，大約每42天繼代一次，平均增殖倍數(shù)為6.4。把繼代后的叢生芽轉(zhuǎn)移到本發(fā)明提供的伸長、生根培養(yǎng)基中14～28天可大量發(fā)根，生根率在93％左右，再繼續(xù)培養(yǎng)7-14天可出瓶煉苗。

本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：

1、本發(fā)明采用特定的生根/伸長培養(yǎng)基，從而實現(xiàn)將不定芽的伸長生長和生根培養(yǎng)一步完成。

而常規(guī)的百部科Stemona屬植物的培養(yǎng)，伸長生長和生根分兩步完成，生根培養(yǎng)需要單獨添加NAA、IAA或IBA等激素。

2、本發(fā)明增殖培養(yǎng)基使用的植物激素是低濃度的BA和NAA的組合；能實現(xiàn)不定芽的擴(kuò)增。

3、本發(fā)明步驟3)所需培養(yǎng)時間為2～2.5個月，步驟4)所需的培養(yǎng)時間約為42天，步驟5)所需的培養(yǎng)時間約為42天。

本發(fā)明的優(yōu)點：(1)黃精葉鉤吻的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約。2)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)。(3)該技術(shù)方法解決了黃精葉鉤吻快速繁殖和穩(wěn)定生根的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，達(dá)到技術(shù)穩(wěn)定，繁殖系數(shù)高的要求，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的目的。(4)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術(shù)得到的黃精葉鉤吻幼苗進(jìn)行人工栽培，可以得到個體差異小，品質(zhì)均一的黃精葉鉤吻，可以提供園林綠化或者提供均一性好的根狀莖成品，可以為臨床應(yīng)用提供品質(zhì)穩(wěn)定的原材料。(5)可以保存黃精葉鉤吻的種質(zhì)資源，同時有利于保護(hù)野生資源，減少對自然資源的破壞。

綜上所述，本發(fā)明利用黃精葉鉤吻的根狀莖上的不定芽做為外植體來進(jìn)行快繁。包括不定芽的消毒，不定芽生長的啟動，叢生芽的誘導(dǎo)及快速增殖，叢生芽的伸長及生根培養(yǎng)以及試管苗的移栽。本發(fā)明以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入了植物激素：6-芐基腺嘌呤、激動素、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸等，用于黃精葉鉤吻不定芽的誘導(dǎo)、增殖及生根等關(guān)鍵階段的組織培養(yǎng)。本發(fā)明成功實現(xiàn)了黃精葉鉤吻的組培快繁，可以短時間內(nèi)快速培育出大量試管苗，為中藥材GAP種植提供一種切實可行的開發(fā)項目。

本發(fā)明掌握了黃精葉鉤吻組織培養(yǎng)中不定芽的啟動、叢生芽的增殖和不定芽的伸長、生根等關(guān)鍵階段的技術(shù)，使黃精葉鉤吻這一珍稀藥用、觀賞植物實現(xiàn)快速育苗、工廠化栽培成為可能。使用本發(fā)明同時可以有效地保護(hù)這一珍稀野生植物資源、減少私挖濫采、形成可持續(xù)利用和合理開發(fā)相互協(xié)調(diào)的良性循環(huán)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為黃精葉鉤吻的組培快繁圖；

A、采自天目山的黃精葉鉤吻帶花的植株；

B、根狀莖上的不定芽；

C、不定芽在主成分為MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)上的生長及不定芽周圍出現(xiàn)的綠白色的叢生芽；

D、將叢生芽切成2～3個芽的芽叢在主成分為MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L的培養(yǎng)基上的增殖；

E、叢生芽在主成分為MS+BA0.6mg/L+NAA 0.5mg/L培養(yǎng)基上的伸長及生根培養(yǎng)；

F、移栽后生長一個月的組培苗。

具體實施方式

實施例1、一種黃精葉鉤吻的組培快速繁殖方法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)、取材：

選用黃精葉鉤吻的根狀莖的不定芽作為外植體；具體為：選用4月份采自天目山的黃精葉鉤吻根狀莖上的不定芽作為外植體。

2)、不定芽的消毒：

將步驟1)所得的根狀莖上的不定芽充分洗滌：先用每1L自來水加入2～3滴洗潔精進(jìn)行洗滌，接著置于網(wǎng)袋中流水沖洗10～15min；然后將不定芽轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上，先用75％(體積％)酒精浸泡處理20～30sec，無菌水沖洗后，用含0.1％(質(zhì)量％)升汞(每100mL 0.1％升汞加2～3滴吐溫20)滅菌8～10min，無菌水沖洗3～5次后，用于后續(xù)步驟的接種。

3)、不定芽的啟動培養(yǎng)：

將消毒后的不定芽(步驟2)所得)剝離外圍的葉片(于超凈臺中進(jìn)行)后接種到啟動培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽生長及叢生芽的誘導(dǎo)；

所述啟動培養(yǎng)基為MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/l+瓊脂8g/l，pH為5.6～5.8；

誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度35μmolm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

當(dāng)啟動培養(yǎng)基上的不定芽的基部出現(xiàn)至少3個的叢生芽(即，不定芽突起)時，結(jié)束啟動培養(yǎng)(培養(yǎng)時間約為2～2.5個月)；

4)、不定芽的快速擴(kuò)增：

將步驟3)所得的叢生芽切下分割成含1新芽(新芽的基部有2～3個突起)的芽叢后轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.6～5.8；

培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30～45μmolm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

待增殖培養(yǎng)基上的新芽長出至少3個叢生芽時，將其用解剖刀分割成相應(yīng)的至少3個新芽(新芽基部有2-3個突起)。一般而言，35～42天后，每個新芽又可以得到5～9個叢生芽。

備注說明：為了獲得更多的叢生芽，可將所得較高較壯的新芽重復(fù)進(jìn)行步驟4)的不定芽的快速擴(kuò)增；待增殖培養(yǎng)基上的新芽長出至少3個叢生芽時，再進(jìn)行相應(yīng)的切割。

6周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的新芽可再生出5～9個叢生芽。平均增殖倍數(shù)約為6.8。

5)、不定芽的伸長及生根培養(yǎng)：

將步驟4)所得的叢生芽切割成含2-3株為一叢的不定芽叢轉(zhuǎn)移到生根/伸長培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)(即，從而實現(xiàn)既能伸長生長、同時又能生根)，生根/伸長培養(yǎng)基為MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.6～5.8；

培養(yǎng)條件為：16小時光照，光照強度30～45μmoLm^-2s^-1，溫度為25±1℃；8小時暗培養(yǎng)，溫度為20±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；

當(dāng)不定芽長到4.0～6.0cm高、且基部有至少5條根(基部突起長至3～5厘米)時，結(jié)束此步驟的培養(yǎng)。

一般而言：將不定芽轉(zhuǎn)移到生根/伸長培養(yǎng)基上，經(jīng)過28～35天的培養(yǎng)，不定芽既能伸長生長，同時又能在植株的基部產(chǎn)生根。即，10～14天不定芽能迅速伸長，7～14天可以看到有根原基形成，21～28天完成生根；35～42天就能實現(xiàn)不定芽長到4.0～6.0cm高、且基部有至少5條根。

6)、將步驟5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶種植的種苗，該種苗栽培于河沙：泥炭土為1:1的混合基質(zhì)上。

具體為：將裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5～7天，然后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆一層水，放置1～2天后，將植株基部的生根/伸長培養(yǎng)基(特指該生根/伸長培養(yǎng)基內(nèi)的瓊脂)洗凈，將苗移栽到河沙：泥炭土為1：1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20～35天，開始的10～14天溫度為23～25℃，相對濕度為70～80％。隨后即可逐漸過渡到自然的環(huán)境條件。煉苗一個月后移栽到大田，平均存活率達(dá)到92％。

實施例2、

將步驟4)中的增殖培養(yǎng)基改為：MS+BA2mg/L+KT1mg/L+NAA0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L+0.8％PVP+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.6～5.8；其余等同于實施例1。

步驟4)中，6周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽叢可再生出5～7個叢生芽；增殖倍數(shù)約為5.9。

最終存活率為90％。

實施例3、

將步驟4)中增殖培養(yǎng)基改為MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH為5.6～5.8；其余等同于實施例1。

步驟4)中，6周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽叢可再生出5～8個叢生芽。增殖倍數(shù)約為6.6。

最終存活率為90％。

對比例1-1、

將實施例1步驟4)增殖培養(yǎng)基中的BA的濃度由“2mg/L”改成“4.5mg/L(屬于常用濃度)”，其余等同于實施例1。

步驟4)中，6周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽叢可再生出約6～8個叢生芽；增殖倍數(shù)約為7.2。

采用此方法，雖然增殖倍數(shù)增加，但由于BA濃度太高，植株生長矮化，幼苗產(chǎn)生一定的玻璃化，最終存活率僅為68％。

對比例1-2、

將實施例1步驟4)增殖培養(yǎng)基中“2mg/L的BA”改成“7mg/L的KT”，其余等同于實施例1。

步驟4)中，6周后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽叢可再生出約4～6個叢生芽；增殖倍數(shù)約為4.7。

該叢生芽細(xì)弱，生長不健壯，最終存活率僅為52％。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。