臨床治療級(jí)人胎盤底蛻膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(PDB-MSCs)無血清體外提取制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。涉及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi)貼附 環(huán)境分離篩選，PDB-MSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)。特別公開發(fā)明了一種臨床治療級(jí)人胎盤底蛻膜 層來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(PDB-MSCs)的高擬體內(nèi)貼附環(huán)境細(xì)胞外基質(zhì)附著體外提取制備方 法，發(fā)明特征包括體外分離及規(guī)?；囵B(yǎng)擴(kuò)增與保存的方法。通過高擬體外細(xì)胞外基質(zhì)附 著鎖定目標(biāo)PDB-MSCs貼附培養(yǎng)，利用優(yōu)選的培養(yǎng)基組合，梯度無血清馴化培養(yǎng)體系獲得臨 床治療級(jí)別的H)B-MSC S-種科學(xué)快速有效獲取創(chuàng)新方法。本發(fā)明獲得干細(xì)胞國(guó)際細(xì)胞協(xié)會(huì) (ISCT)標(biāo)準(zhǔn)具有高純度、干細(xì)胞增殖擴(kuò)增、傳代活性強(qiáng)、以及凍存保護(hù)細(xì)胞活性技術(shù)，該技 術(shù)應(yīng)用是干細(xì)胞治療領(lǐng)域核心基礎(chǔ)，滿足了TOB-MSCs干細(xì)胞臨床藥物設(shè)計(jì)開發(fā)與醫(yī)療機(jī)構(gòu) 開展干細(xì)胞療法回輸安全有效應(yīng)用的需求。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，國(guó)際國(guó)內(nèi)對(duì)干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域越來越重視，細(xì)胞治療再生醫(yī)學(xué)得 到了前所未有推進(jìn)，科研領(lǐng)域沐浴在時(shí)代的朝陽下得以蓬勃發(fā)展。尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞已 經(jīng)成為一種新的治療手段廣泛應(yīng)用修復(fù)受損或病變的組織器官，治療心、腦血管疾病、神經(jīng) 系統(tǒng)疾病、臨床骨修復(fù)、軟骨修復(fù)、骨髓再生、肌肉再生、脂肪形成、肌腱修復(fù)、基因治療、血 管支持、角膜損傷、燒傷燙傷創(chuàng)面修復(fù)等多種疾病。經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的干細(xì)胞在組織工 程再生和多種組織修復(fù)中展示出令科研工作者印象深刻的治療廣泛性潛能，這種潛能是科 研領(lǐng)域毋庸置疑的發(fā)展方向。
[0003] 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)具有自我更新和多向分化的能 力。來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細(xì)胞。是一種非血源性的多功能干細(xì)胞，廣泛 存在于人體不同組織中，如骨髓、脂肪、牙周膜及臍帶，胎盤組織等。近幾年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其 主要來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSc)可以自體移植， 避免了移植后的免疫排斥，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增比較容易，而且具有跨系或跨胚 層分化為不同組織來源細(xì)胞的潛能，所以在臨床已經(jīng)應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管及免疫 系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病的治療，在癌癥和遺傳性疾病研究中也有涉及。BMSc可體外誘導(dǎo)分化為 成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌母細(xì)胞、并在一定的條件下誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)細(xì)胞，而且 可進(jìn)行自體移植，避免免疫排斥，被認(rèn)為是治療多種疾病的良好細(xì)胞來源。也有研究者認(rèn)為 在胎盤組織中也含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，提示可以將其提取作為干細(xì)胞移植治療的備選 細(xì)胞。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)等特性，被認(rèn)為是干細(xì) 胞研究的一種理想種子細(xì)胞。
[0004] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在美國(guó)Π )Α已批準(zhǔn)在心肌干細(xì)胞移植方面進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)， 這充分展示了 MSCs的巨大應(yīng)用前景。不過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中的含量較少，而且隨 著年齡的增加，在骨髓中的含量逐漸減少，其增殖分化能力也逐漸減弱；同時(shí)骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞的取材是有創(chuàng)侵入性操作，增加了捐獻(xiàn)者的痛苦和感染的機(jī)會(huì)，所以骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞的臨床應(yīng)用受到了一定的限制，并且病患嚴(yán)重感染、骨髓惡性腫瘤或隨著年齡的增長(zhǎng)，骨 髓細(xì)胞數(shù)及增殖、分化能力均明顯下降等情況下，患者就無法順利獲得足量可用于治療的 BMSCs，為此很有必要尋找新的MSCs來源。
[0005] 再生組織工程細(xì)胞建立工作始于本世紀(jì)(Harrison 1907，Carrel 1912)，指導(dǎo)引 領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，被稱為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一，組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻(xiàn)者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進(jìn)行孵化培養(yǎng)、使得組織細(xì)胞健康生長(zhǎng)。間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附 強(qiáng)快速特性，使得體外篩選培養(yǎng)人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞得以在國(guó)內(nèi)外方法特異性發(fā)展。而 干細(xì)胞生物學(xué)性能，可以做到增進(jìn)功能，避免潛在有害基因?qū)Ω杉?xì)胞控制分化時(shí)間與控制 不同分化方向等的影響，在基礎(chǔ)科研、臨床治療、干細(xì)胞治療研究方向、再生損傷修復(fù)等均 有歷史時(shí)期的重要不可取代的指導(dǎo)意義。
[0006] 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分， 是細(xì)胞新陳代謝、生長(zhǎng)、繁殖、分化、表達(dá)、傳遞、互惠所依賴的極其重要場(chǎng)所。早期研究學(xué)者 認(rèn)為，外基質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)。Hauschka和Konigsberg在1966年 研究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象，并在兩年之后得以證明， 學(xué)者們才對(duì)這種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識(shí)和思考。
[0007] Hay在11年后報(bào)道了 ECM對(duì)胚胎發(fā)育過程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行為 的現(xiàn)象得以關(guān)注并進(jìn)行廣泛的研究，但是并沒有成型的理論基礎(chǔ)來佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動(dòng)態(tài)互惠"的模型。 在這個(gè)模中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號(hào)通過細(xì)胞膜傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞漿 中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，從而引起某些特定基因的表達(dá)。
[0008] 研究并證明這些基因的表達(dá)產(chǎn)物又可以反過來對(duì)ECM發(fā)生作用，今天的許多研究 證實(shí)了這個(gè)模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用，直接參與了細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、游 走、分化和程序性死(凋亡）的過程。外介質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的活性、還能夠直 接激活、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。由于這種對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)作用，因此，我 們必須充分了解細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)、物理、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的形成和修復(fù)中 的作用，才能更好地應(yīng)用這些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生物 構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深入開展對(duì)ECM的 認(rèn)識(shí)，同時(shí)也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，這種研究模式促進(jìn)學(xué)科前行及發(fā)展。
[0009] 胎盤起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層，由間質(zhì)、血管、滋養(yǎng)細(xì)胞組成，含有大量的間 充質(zhì)成分，也含有大量的干細(xì)胞。臍血和臍帶華通氏膠中都可能含有MSCs，而與臍帶組織緊 密相連，在胎兒出生后多作為廢物與臍帶一起被丟棄的胎盤也含有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相 似特性的細(xì)胞，胎盤組織中確含有這些前體細(xì)胞，極大程度上解決了干細(xì)胞的來源問題。
[0010] 足月胎盤是分娩的廢棄物，取材容易，對(duì)供者不造成損傷，無倫理問題，而且胎盤 體積大，獲得干細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，所以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞更方便適用于臨床。有學(xué)者在胎 兒蛻膜側(cè)胎盤組織成功分離培養(yǎng)出胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，并觀察其生物學(xué)特性和抗凋亡細(xì)胞 因子血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌水平，結(jié)果證實(shí)胎 盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，并能分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因 子、胰島素樣生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。已有研究證實(shí)胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有與骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞類似的功能和特性，兩者的多向分化潛能也類似，且胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 的增殖能力更強(qiáng)。國(guó)內(nèi)外很多研究者發(fā)現(xiàn)，胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中可被誘導(dǎo) 分化為中胚層的心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，內(nèi)胚層的胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞以 及外胚層的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞;而且這些結(jié)果同樣在心肌梗死和帕金森大鼠 模型、糖尿病小鼠模型和脊髓損傷靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型等體內(nèi)模型中治療顯效得到了證實(shí)。也 有報(bào)道稱胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞將進(jìn)一步應(yīng)用于修復(fù)人膝關(guān)節(jié)退行性改變或膝關(guān)節(jié)半月 板損傷科研實(shí)驗(yàn)。
[0011]間充質(zhì)干細(xì)胞是目前組織工程的主要種子細(xì)胞。經(jīng)歷了多年多位學(xué)者的研究后， 雖然組織工程已經(jīng)獲得了很大進(jìn)展，然而目前缺乏理想篩選方法，間充質(zhì)干細(xì)胞不易獲取、 體外擴(kuò)增困難等限制，使其在臨床級(jí)別回輸?shù)膽?yīng)用受到限制。因此，尋找一種易于獲得、免 疫原性低、易于體外擴(kuò)增的臨床治療級(jí)別的種子細(xì)胞是目前組織工程迫切需要解決的問題 之一。
[0012] 本發(fā)明嘗試直接從胎盤組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，底蛻膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的 發(fā)明專利，并對(duì)所得細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為研究間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力，將其作為 種子細(xì)胞開展臨床應(yīng)用研究提供獨(dú)特的思路獲取體系依據(jù)。為間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療以及 基礎(chǔ)研究奠定科研基礎(chǔ)。
[0013] 人胎盤底銳膜間充質(zhì)干細(xì)胞(placental decidua basalis-mesenchymal stem CellS，PDB-MSCs)來源豐富、獲取無創(chuàng)性、體外增殖能力強(qiáng)且不受低血清和低氧影響、具備 中胚層分化能力，公認(rèn)是一種在體內(nèi)具有無限更新能力，體外培養(yǎng)具有長(zhǎng)期生長(zhǎng)潛能并可 形成克隆。PDB-MSCs不存在倫理學(xué)限制是再生醫(yī)學(xué)干細(xì)胞移植治療潛在來源的重要種子細(xì) 胞。但由于目前缺乏理想篩選方法，對(duì)PDB-MSCs進(jìn)行篩選培養(yǎng)及鑒定方法報(bào)道較少。PDB-MSCs與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，具有來源充足、免疫原性低、病毒污染率較低，且無社會(huì)倫 理爭(zhēng)議等方面的優(yōu)點(diǎn)，使其具有更好的臨床應(yīng)用前景。
[0014] 最常規(guī)的一種培養(yǎng)MSC干細(xì)胞的培養(yǎng)基就是添加有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基。然而，采用 這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC干細(xì)胞，不僅因添加量問題出現(xiàn)生長(zhǎng)過快或比較緩慢現(xiàn)象，超過幾代 之后其分化成功能細(xì)胞的潛能大大降低，動(dòng)物血清培養(yǎng)技術(shù)綜合增殖能力、免疫調(diào)節(jié)能力、 分泌細(xì)胞因子的能力這三方面均會(huì)受到不可控方向變化。國(guó)外不同地域廠商來源的動(dòng)物源 血清批次存在潛在的不重復(fù)性，也是影響了其細(xì)胞擴(kuò)增規(guī)模化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸;另一方面， 相對(duì)于人是異源性，異種蛋白混入潛在細(xì)胞治療不確定性，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。 因此，探索快速擴(kuò)增H)B-MSC S而又不影響其潛能的培養(yǎng)條件及其培養(yǎng)基組成的優(yōu)化組合是 非常重要的研究?jī)?nèi)容。多組合培養(yǎng)體系仿生H)B-MSCs細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境的無血清培養(yǎng)方案與傳 統(tǒng)的含動(dòng)物血清培養(yǎng)基相比，本發(fā)明提供取得TOB-MSCs純度高、貼壁性能強(qiáng)、獲取細(xì)胞能夠 保持干細(xì)胞幼稚形態(tài)、具有更好的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞干性，培養(yǎng)獲得的細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異 的細(xì)胞性能同時(shí)降低了培養(yǎng)成本，符合臨床細(xì)胞治療安全性需求。
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