專利名稱：一種胰島素和c肽雙標(biāo)記測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胰島素和C肽雙標(biāo)記試劑盒，特別是涉及一種以濾紙干血片為樣本使用雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫熒光法進(jìn)行胰島素和C肽測(cè)定的試劑盒，利用本試劑盒一次測(cè)試可以同時(shí)定量檢測(cè)胰島素和C肽兩種標(biāo)志物。本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用解決了血清樣本中胰島素和C肽不穩(wěn)定的問(wèn)題，可廣泛用于糖尿病的輔助診斷和病情檢測(cè)，指導(dǎo)臨床用藥以及預(yù)后等多個(gè)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病(DM)是一種常見(jiàn)多發(fā)病，也是世界衛(wèi)生組織所列三大疑難病之一，如何防治DM是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界的一大難題.DM分為I型(胰島素依賴型)和II型(非胰島素依賴型)，其實(shí)驗(yàn)室分型依據(jù)主要依賴胰島素及C肽釋放試驗(yàn)。胰島素及C肽釋放試驗(yàn)即在做口服葡萄糖耐量試驗(yàn)的同時(shí)，利用口服葡萄使血糖升高而刺激胰島B細(xì)胞分泌胰島素，通過(guò)測(cè)定空腹及服糖后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)血中胰島素和C肽動(dòng)態(tài)變化，來(lái)反映胰島B細(xì)胞的功能狀況。胰島素是從胰島B細(xì)胞分泌的一種能降低血糖的物質(zhì)。胰島B細(xì)胞合成胰島素原后，分裂為胰島素及C肽，二者以同等的數(shù)目釋放入血循環(huán)中。測(cè)定血中胰島素及C肽濃度， 可以了解胰島B細(xì)胞貯備功能，對(duì)指導(dǎo)治療具有非常重要的意義。對(duì)于那些已經(jīng)使用外源性胰島素治療的糖尿病人，體內(nèi)可產(chǎn)生胰島素抗體，干擾胰島素測(cè)定，而測(cè)定血中C肽水平不僅可以準(zhǔn)確地反映B細(xì)胞功能，而且可以彌補(bǔ)胰島素測(cè)定的不足。臨床上，常常將葡萄糖耐量試驗(yàn)，胰島素及C肽釋放試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)。常規(guī)的血清胰島素和C肽檢測(cè)大多采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光法和時(shí)間分辨免疫熒光分析法(TRFIA)。酶聯(lián)免疫法試劑盒均為半定量試劑，不能為臨床醫(yī)生提供精確的定量值，很難有效指導(dǎo)臨床的治療。同時(shí)，由于該方法本身在靈敏度上的局限性，對(duì)于血清胰島素和C肽含量的變化還無(wú)法有效檢測(cè)，影響了臨床醫(yī)生的判斷。時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是繼放射免疫分析之后標(biāo)記物發(fā)展的一個(gè)新里程碑，已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。TRFIA以稀土離子作為標(biāo)記物，具有制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明選用TRFIA技術(shù)研制胰島素和C肽檢測(cè)試劑盒。胰島素分子量5700道爾頓，由兩條氨基酸肽鏈組成，C肽是由21個(gè)氨基酸組成的直鏈，分子量3020道爾頓，均可以采用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)。銪和釤是TRFIA技術(shù)中常用于雙標(biāo)記分析中的一對(duì)稀土元素。他們的激發(fā)波長(zhǎng)均為340nm，均能利用β-萘甲酰三氟丙酮(β-ΝΤΑ)螯合劑增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。銪和釤最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為613nm和643nm，雖然相差不大，但由于是窄峰發(fā)射，能夠充分分辨；另外銪和釤熒光壽命相差顯著，分別為820 μ s和88 μ s，檢測(cè)時(shí)彼此干擾比較小。本發(fā)明采用銪標(biāo)記C肽抗體、釤標(biāo)記胰島素抗體，利用TRFIA技術(shù)在一份樣本中同時(shí)定量測(cè)定胰島素和C肽，除了擁有TRFIA技術(shù)的固有特點(diǎn)外，還具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)和高效等突出優(yōu)點(diǎn)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法以血清作為檢測(cè)樣本。而胰島素和C肽在血清中穩(wěn)定性較差，特別是C肽。血清樣本(2-8)°C放置3天，胰島素和C肽濃度將下降10%以上。本發(fā)明采用濾紙干血片為載體，采集病人手指或足跟血，滴制血片，晾干。胰島素和C肽在濾紙干血片中 (2-8) °C保存7天，活性無(wú)明顯下降。本發(fā)明采用濾紙干血片作為樣本，大大提高胰島素和 C肽的檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，更適合于臨床應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒選用濾紙干血片為檢測(cè)樣本，并整合雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、省時(shí)、高效等顯著優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)同時(shí)進(jìn)行胰島素和C肽定量測(cè)定的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，需要對(duì)試劑盒所使用的原料進(jìn)行篩選，從而確定最佳的原料，這一篩選過(guò)程包括包被和標(biāo)記抗體的活性、標(biāo)記物和抗體的比例、包被抗體的濃度、標(biāo)記物的稀釋度、包被板的吸附性能和變異大小等。由于銪和釤的標(biāo)記和純化方法與酶聯(lián)免疫分析完全不同，通過(guò)反復(fù)探索和試驗(yàn)比對(duì)，最終找到了簡(jiǎn)便、效率高、成本低、質(zhì)量可靠的方法。同時(shí)本發(fā)明通過(guò)研究確定了試劑盒的組分及配方，包括洗液配方、分析緩沖液配方、增強(qiáng)液配方、校準(zhǔn)品基質(zhì)的配方等，并公開(kāi)了銪和釤標(biāo)記抗體的制備過(guò)程?；诒景l(fā)明目的，其中所述的試劑盒包括1)校準(zhǔn)品干血片；2)包被反應(yīng)板；3)標(biāo)記物；4)分析緩沖液；5)洗液(25x)；6)增強(qiáng)液。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，校準(zhǔn)品干血片由胰島素和C肽兩種物質(zhì)溶解在校準(zhǔn)品基質(zhì)中，并滴制在市售濾紙上。校準(zhǔn)品干血片根據(jù)胰島素和C肽濃度不同分別編號(hào) A-E，其中胰島素和C肽可使用市售產(chǎn)品，市售濾紙優(yōu)選Whatman903#濾紙。編號(hào)A-E的校準(zhǔn)品干血片加入胰島素和C肽濃度如下表所示
權(quán)利要求
1.一種利用雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)同時(shí)進(jìn)行胰島素和C肽定量測(cè)定的試劑盒，包括校準(zhǔn)品干血片、包被反應(yīng)板、標(biāo)記物、分析緩沖液、2 洗液和增強(qiáng)液，其中標(biāo)記物含銪標(biāo)記抗C肽抗體和釤標(biāo)記胰島素抗體兩種標(biāo)記物，其特征在于銪標(biāo)記抗C肽抗體和釤標(biāo)記胰島素抗體濃度分別為25 μ g/mL和50 μ g/mL,溶解基質(zhì)組分為pH7. 8的50mmol/ lTris-HCl,3% BSA、0. 1% Proclin300、3%海藻糖和 0. 84% NaCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于銪標(biāo)記抗C肽抗體和釤標(biāo)記胰島素抗體的制備步驟分別為1)抗體純化和濃縮選擇市售的抗C肽單克隆抗體和抗胰島素單克隆抗體，將Img 抗C肽單克隆抗體和Img抗胰島素單克隆抗體加入pH 9.0的50mmol/L Na2CO3 0.5ml， 混勻后，用市售的帶有濾膜的G-50離心管IOOOOrpm離心5min，再用pH 9.0的50mmol/ LNa2CO3O. 5ml重復(fù)洗滌6次，倒轉(zhuǎn)G-50離心管，1500rpm離心^iiin收集抗體，體積控制在 150 μ 1-250 μ 1 ；2)抗體標(biāo)記將純化的C肽抗體加入O.aiigEu3+標(biāo)記試劑，純化的胰島素抗體加入 0. 5mgSm3+標(biāo)記試劑，充分混勻，25°C振蕩過(guò)夜；3)上樣與洗脫用規(guī)格為IX30cm的kphadex G-50層析柱分離純化，含0. 9 % NaCl 的50mmol/l Tris-HCl洗脫，按lml/管收集流出液，逐管測(cè)量A280nm，合并峰管，測(cè)蛋白含量；4)稀釋標(biāo)記物并管后的銪和釤標(biāo)記物，按1 100的比例進(jìn)行稀釋；5)分裝標(biāo)記物分裝體積為1.Oml/瓶，真空冷凍干燥；6)保存凍干后在2V-8°C條件下保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于分析緩沖液組分為PH7.8的50mmol/ LTris-HClU. 5% PEG6000.0. 2% BSA,0. 1 % Proclin300,0. 02%牛 IgG、0. 1 % Tween 20 和 0. 84% NaCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于校準(zhǔn)品干血片由胰島素和C肽溶解在校準(zhǔn)品基質(zhì)中，并滴制在Whatman903#濾紙上，其中校準(zhǔn)品干血片根據(jù)胰島素和C肽濃度不同分別編號(hào)A-E，編號(hào)為A-E的校準(zhǔn)品干血片加入胰島素和C肽的濃度分別為胰島素(μ υ/ml)C 肽(ng/m_l_)A00B3. 60. 5C144. 7D7513. 7E18022校準(zhǔn)品基質(zhì)由脫纖維綿羊全血，使用生理鹽水洗滌6次后，并采用生理鹽水調(diào)整紅細(xì)胞壓積至0. 55，輕輕混勻制備而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于試劑盒使用的標(biāo)本類型為濾紙干血片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰島素和C肽雙標(biāo)記試劑盒，特別是涉及一種以濾紙干血片為樣本使用雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫熒光法進(jìn)行胰島素和C肽測(cè)定的試劑盒，并提供了銪標(biāo)記抗C肽抗體和釤標(biāo)記胰島素抗體的制備方法，利用本試劑盒一次測(cè)試可以同時(shí)定量檢測(cè)胰島素和C肽兩種標(biāo)志物，以濾紙干血片為樣本解決了血清樣本中胰島素和C肽不穩(wěn)定的問(wèn)題。本發(fā)明的試劑盒可廣泛用于糖尿病的輔助診斷和病情檢測(cè)，指導(dǎo)臨床用藥以及預(yù)后等多個(gè)研究領(lǐng)域。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102419373SQ20101029634
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳英松, 徐偉文, 朱坤, 李明, 湯永平 申請(qǐng)人:廣州市達(dá)瑞抗體工程技術(shù)有限公司